吊瓜上木瓜畸形花叶病毒的初步研究 精灵论文

吊瓜上木瓜畸形花叶病毒的初步研究 精灵 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 吊瓜上木瓜畸形花叶病毒的初步研究 111111,2张玉川，陈绍宁，梁颖，毛倩卓，金磊磊，陈集双 (1. 浙江理工大学生命科学院生物工程研究所，杭州 310018; 2. 南京工业大学生物与制药工程学院，南京 210009) 摘要:本研究对衢州地区表现为花 叶的吊瓜植株进行了病毒检测和寄主生物学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。经 dsRNA、RT-PCR 检测初步确定侵染 吊瓜的病毒为 Potyvirus,进一步应用 TA 克隆和测序分析 确定为木瓜畸形花叶病毒 (Papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV)，该病毒在大 陆为首次发现。寄主生物 学分析结果表明:该病毒不能侵染心叶烟和普通烟;它在西葫芦上 表现为黄化、花叶和绿岛等症状;在本氏烟上表现为花叶、叶片卷曲和黄化。电镜观察组培 吊瓜叶组织发现弯曲的杆状病毒和风轮状内涵体，未发现其它形态的病毒粒子。 关键词:吊瓜;病毒检测;马铃薯 Y 病毒属病毒;木瓜畸形花叶病毒 中图分类号:S432.1 Primary studies of papaya leaf distortion mosaic virus in Fructus Trichosanthis Kirilowii 11111Zhang Yuchuan, Chen Shaoning, Liang Ying, Mao Qianzhuo, Jin Leilei, 1,2Chen Jishuang (1. Institute of Bioengineering,Zhejiang Sci-Tech University, HangZhou 310018; 2. Institute of Bioresources Engineering, Nanjing University of Technology, NanJing 210009) Abstract: In this paper Trichosanthis Kirilowii containing mosaic symptom leaves was deteced of virus in Quzhou.Interaction between the virus and host plant was analysed. Through double stranded-RNA analysis and RT-PCR detection,It primarily showed that the virus belonged to Potyvirus .The virus was then identified as Papaya leaf distortion mosaic virus(PLDMV)by further results and discovered for the first time in China. The results of biological characterization tests showed that PLDMV induced yellowing,mosaic and chlorotic symptoms on leaves of Trichosanthis Kirilowii. It was aslo indicated that PLDMV induced mosaic，curling and yellowing symptoms on Nicotiana benthamiana. Crooked rhabditiform virions and rotor-shaped endsomes were found in the leaf organization of tissue culture through electron microscopic observation. Keywords:Fructus Trichosanthis Kirilowii; Virus detection; Potyvirus; Papaya leaf distortion mosaic virus (PLDMV) 0 引言 [1]吊瓜(Fructus Trichosanthis Kirilowii)为葫芦科瓜蒌属的多年生草本长藤植物。二 十世纪九十年代，人们从野生的吊瓜中筛选了可供食用的诸多吊瓜品种并移栽成功。吊瓜果 实、果皮、种子和根均为传统的中药，其种子(吊瓜籽)经炒制后可精制成坚果类休闲食品。 食用吊瓜因其独特的口感和丰富的营养深受广大消费者喜爱,江西、山东、河南、湖南、湖 [2]北、广西、福建等全国大部份地区均有大规模引种种植 。由于吊瓜遗传变异的发生较为 [3]频繁,导致雌雄比例失调、遗传分离严重、品质差异大、抗逆性差、性状极不稳定，一些 具有典型性状的优良单株遭到流失。 基金项目:国家自然基金资助项目(30971898) 作者简介:张玉川(1986-)，男，浙江理工大学在读硕士，主要研究方向:植物病毒与植物组培 通信联系人:陈集双(1962-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向:从事植物病毒和脱毒快繁研究. E-mail: Biochenjs@163.com 近年来，吊瓜病毒病严重威胁着吊瓜的生产。病毒病侵染的吊瓜植株表现叶片黄化、植 株生长缓慢、结实少、严重时甚至产生坏死，导致种质的退化和吊瓜籽品质和产量的严重下 降。多年生吊瓜，由于病毒的长期积累导致吊瓜大量减产，种植户每年需要将长势差的吊瓜 植株更换，种植新吊瓜种苗。病毒病的广泛发生迫使人们采取隔年轮的种植方式，不仅耗费 大量的人力物力且导致土地不能最大限度的用以发展吊瓜产业。做好病毒的检测及防治工 作，有助于提高吊瓜的产量和品质，对吊瓜产业的发展有重要的意义。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 材料 为了确定侵染吊瓜的病毒的种类，在浙江衢州市常山县采集了 3 株表现型不同的疑似感 病毒的吊瓜田间样品，同时在该地区采集了同年绍兴农业科学院提供的组培苗样品。 1.2 实验方法 1.2.1 寄主生物学分析 将 3 株疑似感病植株和组培吊瓜转接到实验室种植的健康的西葫芦、心叶烟和本氏烟上 并进行寄主生物学分析。 1.2.2 dsRNA 的提取与分析 将采回的 3 株疑似感病毒的和吊瓜组培苗鲜叶去脉，分别称取 5g，液氮研磨至粉末状， [4]按常规方法进行 dsRNA 提取;以健康的西葫芦和接种CMV 的烟草的 dsRNA 为对照，进 行 1.5%琼脂糖凝胶核酸电泳分析。 1.2.3 基因克隆和测序 采用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂盒提取感病毒植物的总 RNA 和提纯病毒总 RNA.根据 GENE BANK 上已收录的 Potyvirus 病毒的序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 出通用检测引物(表 1)。引物所对应 的位置:8422bp-9155bp。RT-PCR 扩增后，PCR 产物经 l.0,琼脂糖凝胶电泳检测，DNA 凝 胶回收试剂盒回收目的 DNA 片段，将回收后的目的 DNA 片段连接到载体 pGEM-T easy 并 转化到大肠杆菌 DH5-α,进行蓝白斑筛选，碱法提取质粒，电泳和酶切鉴定外源片段的插入 情况。挑选含有目的片段的阳性克隆，放入含有 10μg/μL 的氨苄青霉素的培养基中，37?振 荡过夜，取 3 个重复阳性菌液送至上海 Invitrogen 公司进行序列测定，利用 DNAStar 软件和 NCBI BLAST 对所测序列进行分析。 表 1 马铃薯 Y 病毒属病毒 RT-PCR 通用引物 Tab. 1 Universal primers for RT-PCR detection of potyvirus Orientation Sequence (5′– 3′) Forward primer 5′-GGXAAYAAYAGYGGXCAZCC -3′(X= A，T，C，G;Y= T，C;Z= A，G)Reverse primer 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ RT-Reverse primer 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC oligodT(16)-3′ 1.2.4 组培吊瓜上病毒的电镜观察 感病的组培吊瓜叶组织和组培吊瓜转接西葫芦叶组织以及正常西葫芦叶片按常规方法 [5]方法戊二醛一锇酸双固定，Epon812 包埋，制备超薄切片，进行电镜观察。 2 结果与分析 2.1 病毒寄主生物学测定结果 三株疑似感病毒的吊瓜和组培吊瓜的症状分析( 表 2，图 1)如下: 表 2 三株疑似感病毒吊瓜和组培吊瓜症状分析 Tab. 2 Symptoms analyze of the Fructus Trichosanthis Kirilowii 吊瓜样品 症状分析 吊瓜 1 号样品 叶片变窄、畸形有线性化趋势、叶片卷曲 吊瓜 2 号样品 小叶型、黄化、边缘叶片坏死 吊瓜 3 号样品 皱缩、丛簇、轻微花叶 组培吊瓜样品 花叶、褪绿、黄化 刚采摘回的吊瓜样品的症状照片如下: 图 1. 浙江省衢州市常山县采取的三株代表不同症状的感病的吊瓜和组培吊瓜症状照片 1:吊瓜 1 号样品; 2:吊瓜 2 号样品; 3:吊瓜 3 号样品;4:组培吊瓜Fig.1The three typical different symptoms of the virus infecting Fructus Trichosanthis Kirilowii in Quzhou city of Zhejiang province 1: Field sample 1;2: Field sample 2;3: Field sample 3; 4: Tissue culture sample; 将疑似感病的吊瓜叶片汁液摩擦接种到西葫芦、心叶烟、普通烟和本氏烟进行寄主生物 学分析,发现吊瓜样品所携带的病毒能够侵染西葫芦和本氏烟，不能侵染心叶烟和普通烟(表 3)。 表 3.吊瓜田间植株和组培吊瓜上病毒的寄主生物学分析 Tab. 3 Biological characterization tests of the virus in Fructus Trichosanthis Kirilowii 感病植株寄主能否侵染症状表现 吊瓜 1 号 西葫芦可侵染花叶、明脉吊瓜 2 号 西葫芦 可侵染 黄斑 泡状花叶、卷曲、皱缩 严吊瓜 3 号 西葫芦 可侵染 重花叶，轻微黄化，叶片卷曲 组培吊瓜 西葫芦 可侵染 心叶烟不侵染---吊瓜 1 号 吊瓜 2 号 心叶烟 不侵染 --- 吊瓜 3 号 心叶烟 不侵染 --- 组培吊瓜 心叶烟 不侵染 --- 普通烟不侵染---吊瓜 1 号 吊瓜 2 号 普通烟 不侵染 --- 吊瓜 3 号 普通烟 不侵染 --- 组培吊瓜 普通烟 不侵染 --- 本氏烟可侵染花叶、黄化吊瓜 1 号 吊瓜 2 号 本氏烟 可侵染 泡状花叶、黄化 吊瓜 3 号 本氏烟 可侵染 花叶 组培吊瓜本氏烟可侵染花叶、严重黄化、坏死 2.2 病毒基因组 dsRNA 分析结果 疑似感病的吊瓜田间植株和组培吊瓜的 dsRNA 条带大小都在 8000-10000bp 之间(图 2)， 根据病毒的基因组大小和常见的侵染葫芦科病毒的种类分析，初步推测吊瓜携带的病毒为 [6]potyvirus。 图 2.吊瓜的 3 个样品及吊瓜组培苗提取双链的结果 注:M: GeneRuler? 1kb DNA marker;1:吊瓜样品 1 号样品; 2:吊瓜样品 2 号样品; 3:吊瓜样品 3 号样品; 4:吊瓜组培苗; 5:阳性对照 CMV-Fny;6:Mock. Fig2. dsRNA results of the three Field sample and the Tissue culture sample M: GeneRuler? 1kb DNA marker; 1: Field sample 1;2: Field sample 2;3: Field sample 3; 4: Tissue culture sample; 5: CMV-Fny; 6: Mock. 2.3 RT-PCR 结果 dsRNA 分析推断侵染吊瓜的病毒为 Potyvirus,设计 Potyvirus 的通用引物对吊瓜田间样品 1、2、3 和组培吊瓜进行 RT-PCR 扩增，均得到 750bp 左右的目的条带(图 3)。图中的 1700bp 左右的条带由植物组织的非特异性扩增产生，测序结果显示其为植物的 mRNA 基因，健康 的植株(6 号)也有相同的情况出现。 图 3. 吊瓜田间样品和吊瓜组培苗的 RT-PCR 电泳检测结果 M: GeneRuler? 1kb DNA marker; 1:吊瓜 1 号样品; 2:吊瓜 2 号样品; 3:吊瓜 3 号样品; 4:吊瓜组培苗; 5:阳性对照 ZYMV-DY;6:Mock. Fig 3. Virus Detection of the three Fructus Trichosanthis Kirilowii sample and the Tissue culture sample by RT-PCR M: GeneRuler? 1kb DNA marker; 1: Field sample 1;2: Field sample 2;3: Field sample 3; 4: Tissue culture sample; 5: ZYMV-DY; 6: Mock. 2.4 吊瓜上病毒 PCR 产物的克隆和序列分析 将克隆测序的序列进行 NCBI BLAST 分析，发现吊瓜 1 号和 2 号样品都没有相近和相 似的序列，我们推测其为一种新病毒。吊瓜 3 号样品为单一病毒侵染，经克隆测序分析其为 小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini Yellow Mosaic Virus, ZYMV)。吊瓜组培苗经克隆检测为木瓜 畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)和木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)的复合侵染(表 4)。 表 4.吊瓜样品克隆检测结果 Table 4.results of virus detection for Fructus Trichosanthis Kirilowii sample 吊瓜样品编号病毒侵染寄主的个数侵染的病毒的名称1 吊瓜 1 号样品 未知，推测为新病毒 1 未知，推测为新病毒吊瓜 2 号样品 1 ZYMV 吊瓜 3 号样品 2 吊瓜组培苗PLDMV、PRSV 其中检测出的木瓜畸形花叶病毒核苷酸序列如下: 5'GGGAATAATAGTGGTCAGCCGTCTACAGTTGTCGATAATACTTTAATGGTTTGT ATTTGTGTGCAATATAGTTTAATTATGAATAGTATAGAATTTGAGAATCAGGATGATG TTTGCAGATACTTCGTCAATGGAGATGATTTGCTACTAGCAATCAATCCAAAATTCAT ACACATCCTAGATTCATTCAAAGGTCATTTTGCTAATTTAGGTCTAGATTACGACTTCT CTCATCGCACAGAAGACAAGGGTGAGCTTTGGTTTATGTCTCACAAAGGCATAAAAA TTAATGATATGTATATTCCAAAGCTTGAACCAGAAAGAGTCGTTTCAATTCTTGAGTG GGATAGGAGTGAGAGGCCGGAGCACAGATTAGAAGCAATTTGTGCATCGATGATAGA GGCATGGGGTTATCCTGAATTAACTCATGAAATTCGAAAATTTTACGCTTGGGCCCTG GAACAAGCGCCATACAATCATCTTGCATCAGAAGGGAAGGCACCTTATATCTCAGAG ACAGCGCTTAAGAGGCTTTACACATGTGAAGAGGGAAGTGCTGACGAAATTCTGTCA TATCTAGAGATGTGTGCGAGTGATTTGAATGAAGATGAGTATCTTGAAGATGAAGAC GTCTCCCATCAATCTGCTCTTGATGCTGGTAAACCCGCAGGGGATAACAAGAAAGAG AATGAAGAGAAGCAAAAAAAAAAAAAAAAGTCGTGACTGGGAAAACA3' 序列的分析发现该段序列与日本和台湾发现的序列差异性相对较大，其余的序列则比较 相似，差异较小(其中 1-5 为报道序列，6 为获得的上述序列)(图 4)。发现差异性均在 20% 左右。 图 4.PLDMV 获得序列与报道序列相应片断差异性比较分析 Fig4.sequences distances of the corresponding sequences we acquired to PLDMV 2.5 电镜观察结果 带病毒的吊瓜组培苗样品汁液摩擦接种小西葫芦，叶片细胞的细胞质可观察到风轮状体 和束状体(图 5-2)，另外，我们在感病的组培吊瓜和接种的西葫芦叶组织中发现 PLDMV 聚 集、分散的复制场所(箭头)(图 5-3、5-5)。组培吊瓜中发现了风轮状内涵体和筒状体(图 5-4)并且可以看到 potyvirus 弯曲杆状的病毒粒子，未发现其他形态的病毒粒子(图 5-5)。 图 5.组培吊瓜和转接西葫芦叶组织的电镜观察 1:健康的西葫芦; 2: 组培吊瓜转接的西葫芦;3-5:组培吊瓜; Fig 4. Observation of phytopathological alteration in culture of Fructus Trichosanthis Kirilowii and zucchini infected by the virus of tissue culture sample 1: Health zucchini; 2: Virus of Tissue culture sample inoculated to Health zucchini ;3-5: Tissue culture sample ; 3 结论 马铃薯 Y 病毒属病毒(Potyvirus)一直是危害葫芦科作物的主要病毒。我国报道的侵染 葫芦科作物的病毒有 ZYMV、WMV、SqMV、CMV 等,其中优势病毒为 ZYMV 和 WMV 两 [6]种.吊瓜作为新兴的产业，近年来病毒病的广泛传播致使吊瓜产业的发展受到抑制。我们对 采回的吊瓜样品检测病毒，发现均为马铃薯 Y 病毒属病毒,主要有 ZYMV、PRSV 和 PLDMV 的单独和复合侵染。 [7] 番木瓜畸形花叶病毒在日本，于 1954 年开始发生。并且，PLDMV 症状与 PRSV 的 相似,认为是由 PRSV 引起的症状。但后来鉴定为新病毒，重新定名为番木瓜畸型花叶病毒， [8]而且为侵染番木瓜的主要毒源。1995 年,我国台湾省也报道有 PLDMV 发生，其寄主为番 [9,10]木瓜。通过番木瓜病毒调查发现，大陆华南地区番木瓜病毒病主要是由 PRSV 引起,未 [11,12]发现有 PLDMV 的存在。到目前为止，大陆尚未有关于存在 PLDMV 的报道，且吊瓜纯 属国内野生品种驯化而来，因此 PLDMV 可能与其他国外报道的株系差别较大, 具体的序列 的全长测序及序列比较分析，有待进一步深入。 侵染吊瓜的病毒主要为马铃薯 Y 病毒属病毒，该属病毒的防治方法一般为构建弱病毒 株接种防治，目前该方法已在 SMV、CTV、PRSV 的防治上获得成功，但由于该方法只能 [13,14,15]单一的防治一种病毒，具有一定的局限性。对单一病毒侵染的吊瓜可以使用该方法。 同时，我们检测出的组培吊瓜出现了 PRSV 和 PLDMV 复合侵染的情况，病毒的属内协生加 [16]重了对寄主植物的危害，因此，对于 2 种或 2 种以上病毒复合侵染的防治方法还需要进 一步的研究。 4 致谢 感谢浙江省绍兴市农业科学院提供吊瓜组培苗及扩繁体系。 [参考文献] [1] 吴文安,周秋菊.(2007).吊瓜栽培技术[J].江苏农业科技报.第 3 版. 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