支原体

第18章支原体支原体（Mycoplasma）是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器、在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物。该微生物由Noccard等于1898年分离出来，1967年被正式命名为支原体。第一节概述支原体没有细胞壁，归属于柔膜体纲(Mollicute)支原体目（Mycoplasmatales）支原体科（Mycoplasmataceae），下分4个属。与疾病有关的是支原体属（mycoplasmama）和脲原体属（Ureaplasma），其中支原体属有132个种，脲原体7个种。从人体中分离出的支原体有16个种，其中对人类致病性支原体主要有肺炎支原体（M.pneumoniae）、人型支原体（M.hominis）、生殖支原体（M.genitalium）、嗜精子支原体（M.spermatophilum)；条件致病支原体主要有发酵支原体（M.fermentans）、穿透支原体（M.penetrans）、梨支原体（M.pirum）和解脲脲原体（Ureaplasmaurealyticum）。一、生物学性状（一）形态与结构菌体大小一般在0.3～0.5μm。基因组为环状双股DNA，在600~2200kbp之间（约为大肠杆菌的1/5），G+C含量低，仅25～40mol%。支原体无细胞壁，不能维持固定的形态而呈高度多形性，有球形、杆形、丝状和分枝状等多种形态（图18-1A）。革兰染色为阴性，但不易着色，一般以Giemsa染色较佳，染为淡紫色。支原体的细胞膜厚7.5～10nm，可分外、中、内三层，内外两层为蛋白质及糖类，中层为脂类，主要为磷脂。胆固醇位于磷脂分子之间，对保持细胞膜的完整性具有一定的作用。凡能作用于胆固醇的物质，如皂素、毛地黄甙、二性霉素B等均能破坏支原体的细胞膜而导致其死亡。有的支原体在细胞膜外产生一种由多聚糖构成的荚膜或微荚膜。有些支原体具有一种特殊的顶端结构，能黏附在宿主上皮细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面，与支原体的致病有关。（二）培养特性支原体对营养物质的要求高于一般细菌，需加入10%～20%人或动物血清以提供胆固醇与其它长链脂肪酸。多数支原体还需添加酵母浸液、组织浸液、核酸提取物、辅酶等才能生长。大部分支原体适宜的pH为7.6～8.0，低于7.0易死亡，但解脲脲原体最适的pH为5.5～6.5。支原体兼性厌氧，但大多数寄生性支原体在37℃时在微氧环境（含5%CO2和90%N2）中生长最佳。AB图18-1肺炎支原体（A电镜形态×10000、B菌落×500）支原体的繁殖方式多样，除二分裂繁殖外，还有分节、断裂、出芽或分枝等方式。繁殖时胞浆分裂往往落后于基因组的复制，故可形成多核丝状体。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，在合适环境中孵育，约3～4小时繁殖一代，在琼脂含量较少的固体培养基上，2~7天长出直径约10～600μm的典型的“荷包蛋样”菌落（图18-1B）。低倍镜下观察菌落呈圆形，中心致密隆起，深入琼脂，外周由颗粒包绕；在液体培养基中支原体增殖量不超过106~107/mL颜色变化单位（colorchangingunit，CCU，将支原体接种在一定量的鉴别培养基中，能分解底物并使指示剂变色的最小支原体量），故液体清亮。支原体有许多特性与L型细菌相似，如无细胞壁呈多形性、能通过滤菌器、对低渗敏感、“油煎蛋”样菌落，但L型细菌在无抗生素等诱导因素作用下易返祖为原菌，支原体则在遗传上与细菌无关。（三）生化反应根据支原体分解葡萄糖、精氨酸和尿素的能力，可鉴别支原体（表18-1）。表18-1人类主要支原体的生化反应支原体葡萄糖精氨酸尿素pH吸附细胞肺炎支原体＋——7.5红细胞人型支原体―＋―7.3—生殖支原体＋――7.5红细胞嗜精子支原体―＋―7.5—发酵支原体＋＋―7.5―＋穿透支原体＋＋―7.5红细胞，CD4T细胞解脲脲原体――＋6.0红细胞aa：仅血清3型（四）抗原结构支原体细胞膜上的抗原结构由蛋白质和糖脂组成。各种支原体均有其特有的抗原结构，交叉较少，在鉴定支原体时有重要意义。用补体结合试验可检测糖脂类抗原，用ELISA试验可检测蛋白质类抗原。支原体的血清抗体可用于生长抑制试验（growthinhibitiontest，GIT）和代谢抑制试验（metabolicinhibitiontest，MIT）以鉴定支原体，特异性与敏感性高。GIT法的操作步骤与药敏试验的纸片法相似，将含有特异性抗血清的纸片贴于接种有支原体的琼脂平板表面，若两者相对应则纸片周围生长的菌落受到抑制。MIT试验是将支原体接种在一个含有抗血清与酚红的葡萄糖培养基中，若抗体与支原体相对应，则支原体的生长、代谢受到抑制，酚红不变颜色。应用这两种 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还可将某些支原体分成若干血清型，如解脲脲原体可分为14型。（五）抵抗力支原体因无细胞壁，对理化因素的抵抗力比细菌弱。对化学消毒剂敏感，但对结晶紫、醋酸铊、亚碲酸钾有抵抗力，在培养基中加入适当浓度的上述物质可作为分离培养时防止杂菌污染的抑制剂。支原体对影响细胞壁合成的抗生素如青霉素类天然耐受，但对干扰蛋白质合成的抗生素如强力霉素、交沙霉素等敏感，对作用于DNA旋转酶而阻碍DNA复制的喹诺酮类药物如左旋氧氟沙星、司帕沙星等敏感。二、致病性与免疫性（一）致病性支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病。对人致病的支原体主要通过以下机制引起细胞损伤：①黏附素有些支原体（肺炎支原体、生殖支原体等）具有黏附素，能黏附于呼吸道或泌尿生殖道上皮细胞的粘蛋白受体上，导致宿主细胞损伤；②荚膜或微荚膜，具有抗吞噬作用；③毒性代谢产物，如神经毒素、磷脂酶C、核酸酶、过氧化氢和超氧离子均能引起宿主黏膜上皮细胞或红细胞的病理损伤；④超抗原（superantigen），它是支原体产生的一类具有免疫调节活性的蛋白，能在感染部位刺激炎症细胞，分泌大量的细胞因子，开始为TNF-α和IL-1,随后为IL-6,从而引起组织损伤。另外，穿透支原体能黏附并侵入CD4＋T淋巴细胞，导致免疫损伤。（二）所致疾病不同支原体感染机体的部位不同，因而可引起不同类型的疾病（表18－2）。表18－2人类致病支原体的感染部位与所致疾病支原体感染部位所致疾病肺炎支原体呼吸道上呼吸道感染；非典型肺炎；支气管炎；肺外症状（皮疹、心血管和神经系统症状）人型支原体呼吸道、生殖道附睾炎、盆腔炎、产褥热、慢性羊膜炎，新生儿肺炎、脑炎、脑脓肿。生殖支原体生殖道尿道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎、不育嗜精子支原体生殖道不孕、不育发酵支原体呼吸道、生殖道流感样疾病、肺炎解脲脲原体呼吸道、生殖道尿道炎、尿路结石穿透支原体生殖道协同HIV致病（三）免疫性人体感染支原体后可产生特异的细胞免疫和体液免疫。抗膜蛋白的抗体包括IgM、IgG和SIgA，在抗支原体感染中发挥主要作用，特别是SIgA，在局部黏膜阻止支原体感染中起重要作用。细胞免疫主要是特异性CD4＋Th1细胞分泌细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF，活化Mφ清除支原体感染。免疫细胞在清除支原体的同时，释放大量炎症细胞因子，也能引起自身组织损伤。第二节主要致病性支原体一、肺炎支原体(一)生物学性状菌体大小为0.2～0.3μm，呈高度多形性，如球形、球杆状、棒状、分枝状和丝状等。基因组大小为835kbp，G＋C含量为38.6mol%。初次分离应培养于含足量血清和新鲜酵母浸出液的培养基中，一般10天左右长出菌落，呈致密圆形，深入琼脂，无明显边缘。多次传代后，生长加快，菌落呈“油煎蛋”状。肺炎支原体能发酵葡萄糖，不能利用精氨酸与尿素，能产生过氧化氢，对豚鼠红细胞呈现β溶血环，对美蓝、醋酸铊、青霉素不敏感。（二）致病性与免疫性肺炎支原体主要经飞沫传播，一年四季都可发病，但大多数发生于夏末秋初，以5～15岁的青少年发病率最高。肺炎支原体依靠其顶端结构中的P1表面蛋白（170kDa）和P30(32kDa)黏附于呼吸道上皮细胞，定居后进入细胞间隙，产生代谢产物过氧化氢，使宿主细胞的触酶失去活力，纤毛运动减弱、停止乃至脱落消失，RNA及蛋白质合成减少，功能受损以至死亡脱落。肺炎支原体具有超抗原作用，能刺激炎症细胞在感染部位释放大量的淋巴因子（如TNF-α、IL-1、IL-6）引起组织损伤。肺炎支原体感染引起的病理改变以间质性肺炎为主，又称原发性非典型性肺炎（primaryatypicalpneumonia），临床症状较轻，以咳嗽、发热、头痛、咽喉痛和肌肉痛为主。5～10天后消失，但肺部X线改变持续4～6周才能消失。有时并发支气管肺炎，个别病人可见呼吸道外的并发症，如皮疹、心血管和神经系统症状，这可能与免疫复合物的形成和自身抗体出现有关。肺炎支原体感染后可产生血清特异性IgM、IgG及SIgA和致敏的淋巴细胞。但体液抗体保护作用不完全。呼吸道局部黏膜产生的SIgA对防止再感染有较强的保护作用。肺炎支原体感染后可出现IgE介导的I型超敏反应，促使哮喘病急性发作。婴儿有从母体获得的抗体，以后逐渐消失。（三）微生物学检查法1．分离培养取可疑患者的痰或咽拭子接种在含血清和酵母浸液的琼脂培养基或SP-4培养基，在5%CO2与90%N2的环境中，37℃培养1～2周，挑选可疑菌落经形态、糖发酵、溶血性、血细胞吸附试验进行初步鉴定，进一步鉴定需用特异性抗血清做GIT与MIT。肺炎支原体的分离培养阳性率不高，且需要时间长，故不适宜用于临床快速诊断。2．血清学检查临床上常用冷凝集试验（即用病人血清与人O型血RBC或自身RBC混合，4℃过夜时可发生凝集，而在37℃时其凝集又分散开），但仅50％左右患者出现阳性。此反应为非特异性，感染呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、流感病毒等时也可出现冷凝集现象。3．快速诊断目前临床诊断倾向抗原和核酸检测。方法有：①应用P1蛋白和P30蛋白的单克隆抗体通过ELISA从患者痰、鼻洗液或支气管灌洗液中检测肺炎支原体；②用PCR技术从患者痰液标本中检测肺炎支原体的16SrRNA基因或P1蛋白基因。此法快速，特异性和敏感性高，适宜大量临床标本检查。（四）防治原则肺炎支原体减毒活疫苗和DNA疫苗在动物实验中有一定的预防效果，但在人群中的应用尚未见报道。目前肺炎支原体感染多采用大环内酯类药物如罗红霉素、克拉霉素、阿齐霉素或喹诺酮类药物如氧氟沙星、司帕沙星等治疗有效，但有耐药株产生。二、人型支原体(一)生物学性状人型支原体形态结构为球杆状，基因组大小为700kbp，G＋C含量为33.7mol%。能分解精氨酸，不分解尿素和葡萄糖。最适pH为7.2～7.4。对1:2000的醋酸铊与红霉素（100mg/L）不敏感，对四环素与林可霉素敏感。在液体培养基中，人型支原体能分解精氨酸产生氨使pH增至7.8以上而死亡。在固体培养基上，形成200～300μm的较大菌落，呈典型的“油煎蛋”状。（二）致病性与免疫性人型支原体是寄居于泌尿生殖道的一种支原体，主要通过性接触传播，在男性可引起附睾炎，女性主要引起盆腔炎、慢性羊膜炎和产褥热，新生儿可引起肺炎、脑炎及脑脓肿。（三）微生物学检查法人型支原体实验室检查最好的方法是分离培养与核酸检测。1．病原体检测取泌尿生殖道标本0.1～0.2ml接种于液体培养基，培养24～48h小时后，分解精氨酸产碱，酚红指示剂由淡红色变为红色，再取0.2ml培养物转种于固体培养基，在5%CO2和90%N2的环境中经37℃培养24～48小时，用低倍镜观察菌落；取可疑菌落经形态、pH、锰盐的氧化和生化反应做初步鉴定，进一步鉴定需用特异抗血清做GIT与MIT。2．核酸检测用PCR从患者泌尿生殖道标本中检测16SrRNA基因。此法快速、特异，适宜于大批量标本检测。（四）防治原则加强宣传教育，注意性卫生，切断传播途径。人型支原体对大环内酯类抗菌药物不敏感，感染者可用四环素类、喹诺酮类药物治疗，但有耐药株产生。三、生殖支原体生殖支原体基本形态为烧瓶状，长0.6～0.7μm，底宽0.3～0.4μm，顶宽0.06～0.08μm，有一明显的颈部，宽约7nm。基因组大小为580kbp，G＋C含量为32.4mol%。生殖支原体能发酵葡萄糖和其它碳水化合物使培养基变酸，不分解尿素和精氨酸。在普通支原体培养基中不生长，须在不含醋酸铊的SP-4培养基中生长，但生长缓慢，菌落呈典型的“油煎蛋”状。生殖支原体的顶端结构有黏附素MgPa，其分子量为140kDa，与肺炎支原体P1黏附蛋白在血清学上有明显的交叉反应。生殖支原体能通过性接触传播，能黏附在人类泌尿生殖道上皮细胞上，主要引起尿道炎、宫颈炎、子宫内膜炎和盆腔炎，与男性不育有关。该支原体较难培养，生长慢，不适宜于常规实验室分离培养。实验室最好的诊断方法是核酸检测。目前已用于PCR检测的基因有16S-rRNA和MgPa基因，此方法特异性、敏感性高。四、穿透支原体穿透支原体的形态为烧瓶状，宽0.2～0.4μm，长0.8～2μm。一端为顶端结构，具有黏附与穿入细胞的作用。基因组大小为1,358kbp，G＋C含量为30.5mol%。穿透支原体能发酵葡萄糖，分解精氨酸，不分解尿素，四氮唑盐还原阳性，具有磷脂酶活性。在SP-4培养基上生长较慢，形成典型的“油煎蛋”状菌落。目前认为穿透支原体是一种条件致病菌，可能是AIDS发病的一个辅助因素。＋该菌依靠顶端结构黏附于人尿道上皮细胞、单核细胞、CD4T淋巴细胞，并能穿过细胞膜进入细胞内繁殖，导致宿主细胞受损或死亡。五、解脲脲原体（一）生物学性状解脲脲原体直径0.05～0.3μm，多为单个或成双排列。基因组大小为750kbp，G＋C含量为27.5～28.5mol%。生长除需要胆固醇外，还须添加酵母浸液。在固体培养基上，48小时后长出直径15～30μm的“油煎蛋”状菌落。能分解尿素，不分解糖类和精氨酸，磷脂酶阴性，四唑氮盐还原阴性。最适pH为5.5～6.5。对1∶2000的醋酸铊不敏感。在液体培养基中生长分解尿素产生NH3，使pH上升而死亡。根据细胞膜多带抗原（MB-Ag）不同，将解脲脲原体分为14个血清型，2个生物型，1生物型（2、4、5、7、8、9、10、11、12、13型）均有16kDa和17kDa多肽；2生物型（1、3、6、14型）仅有17kDa多肽。根据16SrRNA基因和16S-23SrRNA间区将14个血清型分为2个种，即，解脲脲原体和微小脲原体（Ureaplasmaparvum）。（二）致病性与免疫性解脲脲原体为条件致病菌，主要通过性接触传播，引起非淋菌性尿道炎、尿路结石。其致病物质及机制主要包括以下几个方面：①黏附于宿主细胞表面，从宿主细胞膜吸取脂质与胆固醇，引起细胞膜损伤；②定居在泌尿生殖道上皮细胞，产生毒性代谢产物如NH3，对宿主细胞有急性毒性作用；③具有人IgA特异蛋白酶，降解IgA1，使粘膜屏障受损；④具有磷脂酶，以宿主细胞膜上的卵磷脂为底物，溶解磷脂，损伤宿主的细胞膜，影响膜的生物合成与免疫功能。解脲脲原体感染后，可检测到IgM、IgG和SIgA类抗体。在急性期，有83%患者的IgM升高，这对早期诊断有一定意义。IgG只能作流行病学调查，SIgA对防止再感染有保护作用。（三）微生物学检查与防治原则解脲脲原体病原体检测与防治原则与人型支原体相同，核酸检测可从患者泌尿生殖道标本中检测尿素酶基因、多带抗原（MB-Ag）基因和16SrRNA基因。（吴移谋）