人类外周血淋巴细胞培养

人类外周血淋巴细胞培养 实验一 人类外周血淋巴细胞培养 一、实验目的 1. 掌握人类外周血细胞培养的原理。 2. 学习人类外周血淋巴细胞的培养方法。 二、实验原理 通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。外周血 中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝 素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外 周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。 用秋水仙素（细胞分裂阻断剂）积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或 早中期，从而获得足够的可供 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的中期分裂相。 三、实验准备 1. 实验器材： 超净工作台、37?恒温培养箱、酒精灯、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、针头、培养 瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、止血带、离心机、定时钟、试管架、 手术镊子 2.实验材料： 人外周静脉血（肝素抗凝） 3.试剂 抗凝剂：肝素溶液（500U/ml） 培养基：RPMI1640, 按照说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 配制后抽滤、分装，冻存备用。 小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56?水浴条件灭活。 植物血球凝集素（PHA）：市售，按说明书要求使用 抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml，均用无菌生理盐水配制。培养液中的终浓度均为100 U/ml 5%NaHCO 3 四、实验步骤 （一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）； 每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含： 1 RPMI1640 4ml 灭活小牛血清 1ml PHA 2.5mg 青霉素 500U 链霉素 500ug 依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用5%NaHCO调节培养基的3pH值至7.2-7.4。 （二）血样本的采集：先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1ml。转动针筒以混匀肝素 （三）接种：常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37?恒温箱内静置培养72h。 五．注意事项 1. PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取 物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。浓度一般用1％～2％，每毫升培养液加0.2～0.4ml；浓度过高可能会导致红细胞凝集。 2．培养箱的温度应控制在37?0.5?，温度过高或过低均会影响细胞生长。 3.培养基的pH值应该在7.2-7.4左右，低了细胞生长不良，高了细胞则会出现轻度的 固缩。 六．思考题 1. 结合自己的实验操作，总结一下全血培养过程的要点，有哪些需要特别注意的问 题？ 2.在外周血培养过程中，加入植物血凝素的作用是什么？ (刘奇迹 陈丙玺) 2 一．实验目的 掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法。 二．实验原理 处于增殖期的培养淋巴细胞经过秋水仙素处理，可停留在分裂中期或早中期，这一时 期的染色体形态为棒状结构，是观察分析染色体的最佳时期。此时收获的淋巴细胞经过低渗、 固定等处理后，通过冰湿滴片法可获得较多的染色体的形态和分散良好的中期分裂相。 三．实验准备 （一）器材 1. 离心机 2. 37?恒温水浴锅 3. 尖底刻度离心管：常用的容量为15ml 4. 吸管、橡皮头、量筒、试剂瓶 5. 载玻片：厚0.8mm，用前预先将洁净的载玻片浸入蒸馏水中，放冰箱中冰冻（刚刚 结冰为宜）备用 6. 试管架、手术镊子、标本片架 7. 酒精灯 （二）试剂 1. 秋水仙素：20ug/ml 2. 低渗溶液：0.075mol/L氯化钾 3. 固定液：甲醇：冰乙酸（3：1） 四．实验步骤 1. 向经恒温培养68-72小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度为 0.05ug/ml,即每瓶（内装5ml培养基）中用7号针头倾斜45度角滴1滴，轻轻将液体摇匀，继续恒温培养2-3小时。 2. 从培养箱中取出培养瓶，用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入刻度离心管内，相 对离心管平衡后放入离心机，离心10min（1500转/分），吸去上清液，留下沉淀物。 3．低渗处理：向离心管中加入5-6ml预温（37 0 C）的0.075mol/LKCI低渗液，用吸管 轻轻吹打使细胞均匀悬浮于低渗液中，放回37?恒温水浴锅（或培养箱）中，静置15～20min， 3 使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。 4．预固定：向离心管中加入固定液1～2ml，轻轻吹打均匀，在室温下放置5分钟。 5．再离心：1500转/分离心10min，吸去上清液，留下沉淀物。 6．固定：沿离心管壁加入新配固定液5ml，吹打均匀，室温放置15-20分钟，1500转/ 分离心10分钟，吸去上清液，留下沉淀物。 7．重复固定一次。 8. 制片：加入新配制的适量固定液，用吸管轻轻吹打细胞团。吸取细胞悬液，在一定 高度（约30-40cm）下垂直滴2-3滴于冰水预浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，在酒精 灯上过几次，吹风机吹干或气干。冰湿玻片上，轻轻吹散，在酒精灯上过火3-5次，晾干。 五．注意事项 1．在采血接种培养是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞 的转化和分裂。但肝素量也不应太少，以免发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结 构。这种膜状物一般在培养24小时左右出现，此时可在无菌条件下将它除去以免影响培养效 果。 2. 在普通培养箱内培养时，必须将培养瓶口盖紧，以免培养液的PH发生较大的变化。如果培养过程中，培养液酸化比较严重（培养液呈黄色时）将不利于细胞生长，此时可加入 适量无菌的0.14%碳酸氢钠溶液调整或再加入2～3ml培养液来校正。培养箱的温度应控制在37?+0.5?，温度过高或过低都会影响细胞的生长。 3. 染色体标本质量不佳的原因。如果淋巴细胞转化试验表明培养物生长发育良好，但制 成的标本质量不佳时，其原因可能为： ? 秋水仙素处理不当：一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理 时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多， 但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。 ? 低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染 色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数 分析。 ? 离心速度不合适：如果从培养瓶收集细胞后进行离心时的速度太低，细胞可能被丢 失；如果细胞被低渗后离心速度过高，往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相丢失， 以致制出的标本分裂相较少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。 ? 标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模 4 糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。 ? 载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且 细胞随液体流动而丢失。 ? 载玻片冷冻不够：合适的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。如冷冻 不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。 六．思考题 1. 在低倍镜下观察自己制作的未染色标本片，了解染色体的分散情况。 2. 在染色体制备过程中，秋水仙素和低渗液的作用是什么？ 3. 要制备出高质量的人类染色体标本，需注意哪些问题？ (刘奇迹 陈丙玺) 5 实验三 人类染色体G－显带 一、实验目的 1. 初步掌握人类染色体G－带的显示方法。 2. 了解人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 二、实验原理 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴 显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带， 人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构 变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因 此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 三、实验准备 1、器材 1）普通光学显微镜、擦镜纸、香柏油 2）恒温水浴箱、普通冰箱 3）立式染缸、染色架、扣染玻璃板、镊子 4）直头小吸管、橡皮吸头、吸水纸 2、试剂 1）胰蛋白酶溶液：用灭菌生理盐水配制成0.1%的胰蛋白酶溶液，用3%Tris溶液调节 pH至7.0。 2）Giemsa染液：磷酸缓冲液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml，用时配制。 3、材料 未染色的人类染色体标本片 四、实验方法与步骤 1、常规制备的染色体标本片室温放置3天（老化）后，转移到60?烤箱内干燥2～3小时， 自然冷却至室温后取出； 6 2、将标本片放入盛有胰蛋白酶溶液（预温至37?）的染色缸中消化（恒温）。先将一张标本 片分成三段进行预消化，以确定最佳消化时间，一般在8～12秒； 3、将消化过的标本片立即放入Giemsa染色液中，室温染色15～20分钟； 4、自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面）3～5秒钟，晾干； 5、镜下观察染色体分带及染色情况。 五、注意事项 下列因素对染色体G显带有一定的影响。 1、 胰蛋白酶溶液的浓度，是决定染色体消化时间的关键因素之一。浓度高时，消化时间短， 但极易消化过，故一般消化时间不宜少于10秒钟。 2、 胰蛋白酶溶液的温度：温度较高时，酶解反应速度较快。在有空调的实验室中，最合适 的温度是室温。在进行显带之前，胰蛋白酶溶液应当在室温至少稳定30分钟。对无空 调控温的实验室，也有把胰蛋白酶溶液温度稳定在4?的，有的甚至置冰箱中进行处理。 在温度较低的情况下，应当延长处理时间。如能把所有条件稳定下来，则可得到一致 的效果。 3、 胰蛋白酶溶液中的盐类成分：溶液中的二价阳离子会使反应减慢，但不能阻止反应。 4、 制作标本的方法：火焰干燥法制得的标本对胰蛋白酶处理的抵抗性较气干法标本要强些。 5、 标本的片龄：标本保存的时间越长，染色体对胰蛋白酶处理的抵抗性越大。片龄超过20 天以上的标本显带时，染色体往往呈斑点状，而不是显示带纹。 6、 染色：随着染色时间的延长，在染液表面会形成一层氧化膜（发亮）。染色完毕，应把标 本浸入水中洗去染液，或用自来水直接冲去染液。如直接倾去旧染液，这层氧化膜极 易附着在标本片上形成污秽，且不易去除掉。用染色缸染色时，染色前应先用小片滤 纸刮去液面的氧化层。另外，染液须现用现配，保存时间最好不超过48小时，旧染液 染色效果不好。Giemsa染液对pH极为敏感，pH合适才能获得好的效果，配制时需特 别注意。 7、 在确定胰蛋白酶的处理时间时，可在同一标本片上用2～3个时间段进行试消化，染色 后在镜下观察。如果标本呈现蓝紫色（与常规染色相似），说明胰蛋白酶的作用时间不 够；如果染色体标本为桃红色，那就差不多了。 8、 当需要在同一标本上显示不同的带型（如G带和Q带）时，应当先作Q显带，再作G 显带。 六．实验结果及思考题 7 1、观察自己制作的标本片中染色体的形态、颜色及其显带情况， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 并说明原因。 2、试述染色体G显带技术在人类染色体识别中的意义。 试述制备良好的G带染色体标本的关键步骤及应注意的问题。 （高贵敏 陈丙玺） 8 实验四 正常人类染色体G带核型分析 一、实验目的 1. 熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。 2. 初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。 二、实验原理 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色 体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征， 可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 三、实验准备 1、器材： 光学显微镜、香柏油、擦镜纸、剪子、镊子、胶水 2、材料 1）正常人类染色体G带标本片 2）正常人类染色体G带核型图 3）核型 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 纸 四、实验步骤 1、在低倍镜下选择染色体形态和分散良好的中期分裂相，移到视野中心，换高倍镜观察； 2、高倍镜下观察该分裂相中染色体的显带情况，选取染色体带纹清晰的分裂相，换油镜观察； 3、油镜下计数10个细胞的染色体数；观察各组染色体的形态，长、短臂及其着丝粒位置， 根据染色体的带纹特征仔细辨认每条染色体。 五．实验结果 1、计数10个细胞的染色体数； 2、绘出一套完整的中期分裂细胞的染色体图； 根据课堂提供的材料，排列初一份正常人类染色体G带核型图。 六、思考题 1、正常人类染色体共有几对？分几组？各组有何特点？ 9 2、试述正常人类染色体G带的主要带型特征。 附： 1、有关染色体参数的 计算公式 六西格玛计算公式下载结构力学静力计算公式下载重复性计算公式下载六西格玛计算公式下载年假计算公式 ： 染色体相对长度＝【单个染色体长度/1～22＋X染色体的总长度】×100％ 染色体臂比＝长臂长度(q)/短臂长度(p) 着丝粒指数＝【短臂长度(p) /染色体全长(p＋q) 】×100％ 10 2、附表－－人类染色体G带特征（约400条带） 染色体序号 短 臂（p） 长 臂（q） 1号 近侧1/2处有2条深带，远端着3～4条深带均匀分布，中央2条 色淡 最深，次缢痕染色深呈“?”形， 多变异 2号 4条深带均匀分布，有时中央24～7条深带均匀分布，着丝粒着 条合并成1条 色浅 3号 中央1条浅带，其两侧各有1条中央1条浅带，其两侧各有1条中 深带 等着色带，远侧的带比短臂远侧的 带宽些 4号 中央1～2条深带 均匀分布的4条深带，近侧的2条 着色较深 5号 中央1条深带，较4号短臂的深中部有3条深带（常合并为1条， 带窄而深 较宽），远侧和近侧各有1条窄的 深带 6号 中段为一明显宽阔的浅带（这是4～6条深带均匀分布 6号短臂的特征），远侧和近侧 各有1条深带 7号 3条深带，远侧的1条较宽且色3条明显的深带，远侧1条较浅 深似“瓶盖” 8号 2条深带被1条浅带隔开（这是3～5条深带，中央和远侧的中等 8号短臂的特征） 着色，近侧的着色较浅 9号 3条深带，远侧的2条常融合为2条间隔均匀的深带，次缢痕不着 1条 色。长度变异大 10号 中央1～2条深带 3条深带均匀分布 11号 中央1条宽阔的深带 中部2条紧邻的深带，被1条浅带 隔开，但常融合为1条宽带，此带 与着丝粒间有1条宽的浅带 12号 中央1条宽的深带，比11号短近着丝粒处有1条窄的深带，中部 11 臂的深带更宽 有1条宽的深带，比11号长臂的 深染宽带更宽 13号 有随体，短臂深染，随体区着色可见4条深带，近侧第2条较宽且 不定 色深，中央2条中等着色 14号 有随体，短臂深染，随体区着色近侧2条带深，中段有1条较浅而 不定 窄的深带，远侧有1条明显的深带 15号 有随体，随体区着色不定 近侧1/2处有2～3条深带，远侧 1/2处有2～3条带着色浅 16号 整个短臂着色较浅，中部可有次缢痕深染，长度变异大，中部有 1～2条浅染的深带 1条中等着色带，该染色体多变异 17号 远侧有1条窄的深带 近着丝粒处有一窄的深带，远侧有 一中等着色带 18号 有一窄的中等着色带 远侧和近侧各有1条明显的深带， 近侧带比远侧带深些、宽些 19号 近着丝粒处有一中等着色的窄近着丝粒处有一中等着色的带，较 带， 短臂的更窄 20号 有1条明显的深带 有2条深带，但着色较浅 21号 随体着色不定 近侧有1宽阔浓染的深带 22号 随体着色不定 中部有1条窄的深带 X 中央有一明显的深带，如“竹节”3～4条深带，近侧1条着色深， 状 远侧2条中等着色 Y 末端有1条窄的深带 远侧深染，有时可见2条深带 （高贵敏 陈丙玺） 12 实验五 人类遗传性状分析 一、实验目的 1. 了解人类遗传性状的记录分析方法。 2. 掌握遗传性状基因型与表现型的关系。 3、掌握基因频率和基因型频率的计算方法。 二、实验原理 本实验通过调查已知的人类遗传性状，了解这些性状的遗传特性。 1、苯硫脲的味觉感受能力 苯硫脲（phenylthiourea），又称苯基硫代碳酰二胺（phenylthiocarbamide, PTC），是一种对人体无毒副作用的白色结晶物质。人类味觉对PTC的敏感性由一对等位基因（T、t）控制，属不完全显性遗传。基因型不同的个体尝出含PTC溶液的浓度有明显的差异。基因型为TT的个体能尝出PTC浓度为1/750000～1/300000的苦味；基因型为Tt的个体只能尝出PTC浓度为1/50000～1/40000的苦味；而基因型为tt的个体对PTC浓度大于1/24000的溶液仍然感觉无味。为便于研究，将能尝出PTC浓度在1/50000以下苦味者称为尝味者，对PTC浓度在1/24000以上仍感觉无味者称为味盲者。 PTC浓度 基因型 表现型 1/750000 TT 尝味者 1/50000 Tt 尝味者 1/24000 tt 味盲者 另一种简单的方法是检测人们对较高浓度的PTC的感觉，即将PTC配成1/12500的溶液，检测时滴一小滴于舌尖上即可。在此浓度下，有人感觉极苦(TT)，有人感觉甜(Tt)，而有人却感觉完全无味(tt)。 2、人类ABO血型系统的遗传 存在于人类红细胞表面的抗原性质是ABO血型划分的基础，这种抗原决定于9q34上的一对复等位基因：IA、IB和i，且IA和IB对i为显性，IA和IB为共显性。IA决定红细胞表面有抗原A，IB决定红细胞表面有抗原B，i决定红细胞表面无抗原A和B。根据红细胞表面是否含有抗原和所含抗原类型的不同，将人类的ABO血型系统分为A型、B型、AB型和O型四种。此外，在不同血型人的血清中所含抗体不同，即A型血清中含有抗B抗体（ 13 抗体），B型血清中含有抗A抗体（抗体），O型血清中同时含有两种抗体，而AB型血清中则不含有这两种抗体。由于在相应的抗原抗体之间会发生凝集反应，故在输血时对供血、 受血者的血型有一定的限制（见下表），输血前一定要进行血型的配型。 血基因型 红细胞 表血清中抗可凝集的 红细胞输血时能 接受型 面抗原 体 类型 血型 A IAIA、IAi A B、AB A、O B IBIB、IBi B A、AB B、O AB IAIB A、B － － A、B、O O ii － 、 A、B、AB O 三、实验准备 1、器材： 光学显微镜、双凹（或普通）载玻片、三棱针、70％的酒精棉球、吸管、小试管、记 号笔或玻璃蜡笔、消毒棉签、消毒牙签 2、材料 外周血（取自无名指尖或耳垂部位） 3、试剂 1）1/750000、1/50000、1/24000（W/V）三种PTC溶液 2）1/12500（W/V）PTC溶液 3）抗A和抗B血清 4）无菌生理盐水 四、实验步骤 1、PTC尝味 1）取无菌棉签，分别蘸取不同浓度的PTC溶液，自低浓度向高浓度依次进行尝味。根 据本人所感受到苦涩味的最低浓度，确定自己的表现型和基因型。 2）统计本实验室全体同学PTC尝味的表现型和基因型，将统计结果填入下表。 PTC尝味结果统计 实验室名称 总人数 1/750000尝味者(TT) 1/50000尝味者(Tt) 1/24000尝味者(tt) 人数 频率 人数 频率 人数 频率 14 3）计算基因型频率和基因频率 由于PTC尝味性状为不完全显性遗传，表现型能直接反应出基因型。基因型和基因频率 的计算公式如下： 基因型频率＝（某种基因型个体数/样本总人数）×100％ 基因频率计算：设T的频率为p，t的频率为q p=TT+Tt/2, q=tt+Tt/2或q=1-p 2、ABO血型遗传分析 1）取冷冻的抗A和抗B血清，室温下化冻备用。 2）采血：用70％的酒精棉球消毒耳垂或无名指末端，再用三棱针快速刺破耳垂或无名指 末端的皮肤。待血液流出时（可稍用力挤压），用吸管吸取后加一滴到盛有无菌生理盐水 的0.5ml小试管内，轻轻振荡，使其成为淡红色的血球悬液。 3）取清洁的双凹载玻片一张，在其两端分别用记号笔标记抗A和抗B字样，用滴管分别滴加抗A和抗B血清各一滴于相应的凹面内。 4）用干净滴管吸取受检者血球悬液，分别向标明抗A和抗B的两个圆凹中各滴一滴（滴管末端不得触及标准血清），分别用牙签迅速搅拌使血球混悬，室温下静置10～15分钟。 5）混悬的血球若逐渐由混浊变为透明，且出现了大小不等的红色颗粒，表明红细胞已凝 集。如仍为淡红色混浊，不出现颗粒，则为无凝集现象。有时因比重不同血球下沉，貌似凝 集，但只要稍加摇动，样本又恢复混浊状态，这种情况则不是真正的凝集。如果分辨有困难， 可在低倍显微镜下观察（有时也可用生理盐水代替标准血清作对照）。 6）血型的判定：根据下表确定血型。表中“＋”表示有红细胞凝集，“－”表示无红细 胞凝集。 血型检验结果判定 血清类型 抗A血清 抗B血清 血型 A ＋ — B — ＋ AB ＋ ＋ O — — 7）将本实验室全体同学的血型检查结果填入下表。 15 实验室名称 受检总人数 A型人数 B型人数 AB型人数 O型人数 五、注意事项 1、进行PTC尝味，三种浓度溶液的顺序一定从低到高，不可颠倒！ 2、进行血型检测时，带血滴管的末端绝对不得触及标准血清！ 3、血型检测态度一定要严肃认真，一丝不苟，当检测结果不能确定时，必须重做。 六、实验结果与作业 1、计算PTC尝味和ABO血型的基因型频率和基因频率。 2、根据PTC尝味实验的结果，理解不完全显性遗传的特点。 3、掌握ABO血型系统的原理、检测方法、结果分析和血型判定。 4、理解ABO血型系统的配型原则及临床应用意义。 （高贵敏 郭辰虹） 16 (STR) 一、实验目的 1、 熟悉短串联重复序列多态性分型的原理 2、 掌握用短串联重复序列进行基因型分析 二、实验原理 微卫星DNA（microsatellite DNA），属于短串联重复（Short Tandem Repeat，STR）序列，它和小卫星DNA（minisatellite DNA）一样，都是由重复序列串联构成的DNA重复序列，又被称为第二代多态性标记。由于其广泛地分布于几乎所有的染色体的不同部位（有的 在基因序列内部，有的在相邻的基因序列之间），按照孟德尔方式遗传，且其重复序列的拷贝 次数在个体间呈现高度变异性（具有多态性和高频率），又可采用重复序列两侧的特异性单拷 贝序列作为其在基因组中的定位标记（用以合成引物）进行PCR扩增，然后通过直接观察电泳条带的迁移率来判断其大小，因而在遗传分析（基因定位）、个体识别（DNA指纹分析）和遗传病的连锁诊断中均得到了广泛的应用，成为目前最有价值的遗传性标记。 对STR多态性的检测，通常采用PCR扩增结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段 的长度多态性（amplified fragment length polymorphism，Amp-FLP）的方法。即首先按重复序列两侧的单一序列设计特异性引物，用PCR扩增包含特定重复序列的DNA片段；再用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，根据凝胶上DNA片段的大小确定个体的基因型。本实验着重讨论扩增片段的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离方法和基因型分析。 变性聚丙烯酰胺凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶一样，都是由丙烯酰胺单体先在催化剂过 硫酸胺和加速剂四甲基乙二胺（TEMED）作用下，聚合成长链， 交联剂亚甲双丙烯酰胺（Bis）使其发生交联而形成凝胶。 聚合链的长度与丙烯酰胺的浓度有关，交联度由Bis和丙烯酰胺的比例决定，比值越大，网孔越小，分辨率越高，越有利于分离较小的分子，故变性聚丙烯 酰胺凝胶的浓度通常在6-10%之间，丙烯酰胺与Bis的比例为19 ：1。所不同的是变性聚丙烯酰胺凝胶中含有高浓度的变性剂（7M的尿素），且电泳是在高电压或较高功率（维持胶面 温度在50?左右，为保证DNA处于单链状态）下进行的，样品在点样前经过了高温变性和 变性上样缓冲液的处理，扩增的PCR产物在电泳过程中，一直处于变性（单链）状态,故变性聚丙烯酰胺凝胶分离的是单链DNA。变性的单链DNA在这种凝胶中的迁移速率几乎与其 碱基组成及序列完全无关，而只与其片段大小的lg对数值成反比。因此，变性聚丙烯酰胺凝 胶可被用来分离碱基差异较小（甚至相差1bp）的DNA片段。 变性聚丙烯酰胺凝胶对单链DNA分子的有效分离范围 17 abb尿素丙烯酰胺%(W/V) 单链DNA分离范围(nt) 溴酚蓝(nt) 二甲苯蓝(nt) 4 >250 30 155 6 60～250 25 110 8 40～120 20 75 10 20～60 10 55 a:Acr与Bis之浓度比为19：1 b:染料栏中标出的数字是与染料一起迁移的单链DNA的核苷酸数 变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺浓度与被分离寡核苷酸长度的关系 丙烯酰胺%abb（W/V） 寡核苷酸长度（nt） 溴酚蓝(nt) 二甲苯蓝(nt） 12 40～100 ～15 40 15 25～40 9～10 30 19 <25 6 22 a:Acr与Bis之浓度比为19：1 b:染料栏中标出的数字是与染料一起迁移的寡核苷酸的核苷酸数。 电泳结束后，要经过显色，才能观察到凝胶中的DNA条带。变性聚丙烯酰胺凝胶通常 采用银染法 。 等位基因分型：按照凝胶上所出现的所有单链DNA片段的位置，从小到大依次命名为1、2、3、„等。根据等位基因片段确定不同个体的基因型。 三、实验准备 （一）器材 1.高压电泳仪（具有稳压、稳功率及稳流功能） 2.垂直电泳槽及与之配套的制胶板（玻璃板）、垫片（亦称间隔片）、厚度介于0.4mm。 3.样品梳：有长城齿、鲨鱼齿等多种不同规格（与垂直电泳槽及间隔片配套使用）。 4.凝胶干燥器 5.与凝胶大小相匹配的方盘（染色及处理胶用） 6.照像机（拍摄电泳后的凝胶图谱）、紫外灯、观片器 7.量筒(5ml、10ml、50ml、100ml、200ml) 8.烧杯（250ml、500ml） 9.注射器(50ml及微量注射器)及针头（16 ##、20） 10.精密进样器、吸头 11.移液管（5ml、10ml）、滴管 12.胶带（封边用）、吸水纸 13.一次性手套、保鲜膜 14.大铁夹（数个） （二） 材料 18 PCR扩增产物 (三） 试剂 1.尿素 高纯度，M为60.06，终浓度为7mol/L 2.40%(w/v)丙烯酰胺（Acr:Bis=19:1） 丙烯酰胺（DNA测序级） 190g N,N’-亚甲双丙烯酰胺 10g 加蒸馏水至300ml,将溶液加热至37? 使试剂溶解，再将总体积定容至500ml,过滤， 贮于棕色瓶中，室温或4?冰箱保存 ：6% 变性聚丙烯酰胺（丙烯酰胺 ：亚甲双丙烯酰胺=19 ：1， 内含7M尿素和0.5 X TBE） 3.10×TBE（pH8.3）贮存液 Tris碱 108g 硼 酸 55g 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 40ml 加蒸馏水溶解并定容至1000ml，室温存放，出现沉淀时弃去。 ：0.5 X TBE（用10×TBE稀释） 4. 10%（W/V）过硫酸铵（Ap） 过硫酸铵 1g 加蒸馏水至 10ml 4?保存数日，不要超过一周。 5.四甲基乙二胺（TEMED），贮于4?冰箱。 6.甲酰胺上样缓冲液(0.5X TBE) 95%（V/V） 甲酰胺 0.05%(W/V) 溴酚蓝 0.05%(W/V) 二甲苯蓝 5%(V/V) 10×TBE（pH8.3） 7. 95%乙醇 8. 冰醋酸（分析纯） 9. 15% NaOH 10.20% AgNO 3 11.甲醛（分析纯） 12.无水乙醇（分析纯） （一）凝胶槽制作 1.选择适宜的制胶玻璃板、间隔片、梳子、铁夹等物品（包括滤纸、吸水纸） 2.用肥皂水清洗玻璃板、间隔片、必要时用KOH/甲醇清洗。KOH/甲醇是在100ml甲醇中 加入约5克片状KOH配制而成。取用KOH和KOH/甲醇溶液时应十分小心，并应带橡胶 19 手套，勿使接触皮肤。然后用去污剂，继之用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤玻璃板、 间隔片。应从边上拿取玻璃板，以免手套或手上的油脂污染玻璃板的有效工作面。最后 用乙醇冲洗，放置晾干。玻璃板必须彻底洗净，确保灌胶时不产生气泡。 3.用5％二氯二甲基硅烷对玻璃板进行硅化，应戴橡胶手套并在通风橱内操作，以防硅 烷蒸气吸入体内。方法是向板面上加2～3ml硅烷溶液用吸水纸将其在玻璃板上涂匀，直至彻 底干燥（也可在真空干燥箱内进行）。目的是防止凝胶与玻璃板贴的太紧，减少从胶槽中取胶 时凝胶破裂的可能（此步骤可省）。 4.制作凝胶槽的两块玻璃板大小不同，其中一块较小或带有凹口。制作时，将较大的一 块（无凹口）平放于桌面上，硅化面朝上；在玻璃板的左、右两边及底边放好间隔片；再将 较小的玻璃板（带凹口）放在间隔片上方，硅化面朝下。用胶带纸将两块玻璃板的两边及底边封紧，在两块玻璃之间形成不漏水的密封槽。要注意凝胶槽的角部，此 处最易渗漏。必要时用琼脂糖（1% 浓度）沿间隔片内侧及底边注入加以密封，并用铁夹子将 两边夹紧。：要夹到间隔片上，以免将玻璃板夹坏。 5.将凝胶槽有凹口的一面朝上成45O倾斜放于桌面上，准备灌胶。 （二）配制适当浓度的凝胶 按所分离DNA分子的大小及目的选择合适浓度的凝胶，制备一定体积的丙烯酰胺溶液（不 加TEMED），将其装入抽滤瓶中，抽真空去除气体，直至溶液中不再产生气泡（此步可省）。 试 剂 不同浓度(%)凝胶所用试剂的毫升数 4.0% 6.0% 8.0% 10.0% 12.0% 40%丙烯酰胺(ml) 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 (Acr:Bis=19:1) 优级纯尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 10×TBE(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 10%过硫酸铵(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 加双蒸馏水至总体积为100ml,预温至尿素完全溶解。 用时取100ml丙烯酰胺溶液加50μl TEMED于一个干净的小烧杯内,迅速混匀，灌胶。 （三）灌胶及凝胶聚合 1.聚丙烯酰胺凝胶溶液（中型电泳槽用50ml）配制完毕，按表中比例加入TEMED后，应迅速旋转混合均匀。 2.用注射器（50ml）吸取凝胶溶液并注入凝胶槽（两块玻璃板之间）中。当凝胶液注满 胶槽溢出时，将胶床直立，再补加凝胶液至稍溢出。剩余的凝胶液保存于4?冰箱，以减缓 聚合。灌胶时必须防止在凝胶在玻璃板之间产生气泡，如发现气泡可用镊子轻击气泡下部的 玻璃板，往上驱赶。若无法去除时，则需将凝胶溶液倒出，洗净玻璃板，重新配胶灌制。 3.将凝胶槽斜靠在架子上，与之大约成10 0角，这样可减少发生泄漏的机会并可最大限 20 度地减少凝胶变形。 4.立即插入适当的梳子。操作时，可先将梳子向一头倾斜，再插入凝胶中。密切注视梳 齿，防止带入气泡。梳齿顶端应略高于玻璃板上端。梳子放好后，用两只铁夹将其夹紧、固 定。必要时，用剩余的丙烯酰胺凝胶溶液完全充满胶槽。检查凝胶是否渗漏。 5.室温下放置1小时，使丙烯酰胺完全聚合。如发现凝胶明显收缩时，应补加丙烯酰胺 溶液。聚合完全后，梳齿下面可见有一条波纹状的折光线，即Schlieren线。此线是凝胶聚合是否完全的标志。 凝胶聚合后，存放1～2天仍可使用。方法是用1×TBE浸过的纸巾遮盖梳子及凝胶 的顶端，用保鲜膜将整个胶槽封好，4?存放。 （三） 电泳、PCR产物预变性 (一)预电泳 1.使用前，先小心拔出梳子，立即用水彻底冲洗加样孔，用刀片将凝胶槽底部胶带去掉 并取出底部的间隔片（如用滤纸时可不取）。 2.凝胶槽有加样孔的一端朝上，玻璃板有凹口一面与电泳槽后背贴紧，下端插入底部电 泳槽内，两边用夹子夹紧。 3.底、上两个电泳槽内分别倒入适量的0.5×TBE缓冲液（pH8.3）,并用缓冲液反复冲洗点样孔。如凝胶底部与缓冲液之间有气泡时，可用弯头毛细管将气泡除去。 4. 用与电泳时同样的电压（恒压500V）条件进行预电泳，时间一般为30分钟。 （二）PCR产物预变性 向待分离的PCR扩增产物中加入2倍体积的变性上样缓冲液，混合均匀。加样前于95?热变性10分钟（除去DNA分子的二级结构），取出后立即放冰浴，备点样用。 五、上样及电泳 停止预电泳，关闭电源。再次用缓冲液反复冲洗点样孔。用精密加样器吸取10μl变性后的PCR产物依次加入到样品孔内。加样完毕，凝胶槽顶部接负极，底部接正极，用于预电 泳时相同的电压（500V）或功率(稳功率)条件下继续电泳1.5～2小时，至二甲苯青泳至近电泳槽底部约2～3cm时停止电泳。 总之，待电泳的标准参照染料迁移到一定位置时，切断电源，拔出导线，终止电泳。吸 去上、下槽内的缓冲液，取出凝胶槽，用刀片除去两边的绝缘胶带，将凝胶槽平放于工作台 面上，带凹面的较小玻璃板在上。小心地撬起上面的玻璃板，连同两边的间隔片一起拿去。 这时凝胶仍附着在下面的玻璃板上。 六、聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的检测 (一)溴化乙锭（EB）染色 聚丙烯酰胺凝胶可能淬灭溴化乙锭的荧光，故被检测DNA条带所含DNA量小于10ng时，不易检出。 21 染色时，将凝胶连同玻璃板一起浸入含有0.5μg/ml EB的电泳缓冲液或蒸馏水中，浸染15～20分钟。此间应不时摇动染色盘。然后经蒸馏水漂洗，紫外灯（波长3570Å）下观察、照相记录DNA样品的电泳情况。 （二）银盐染色 此法灵敏度高，在室温下进行，适于对聚丙烯酰胺凝胶中的DNA或RNA染色。 1）先将凝胶转移到盛有200ml固定液的（内含10%乙醇和0.5% 冰乙酸）染色盘中浸泡6分钟，其间应不时摇动染色盘；重复一次。蒸馏水漂洗两次。 2）用200ml 0.2%（W/V）AgNO染色10分钟，蒸馏水漂洗1～2次。 3 3）用200ml 含有1.5% （W/V）NaOH和0.4%(V/V)甲醛溶液的显色液中显色10分钟， 其间应不断轻摇染色盘，并随时观察，待凝胶上的DNA条带显色满意为止。吸去显色液，蒸馏水漂洗凝胶2次。 4） 用0.75%(W/V)NaCO处理凝胶10～20分钟，中止显色。蒸馏水漂洗，观察、照相，3 也可将凝胶干燥、永久保存。 七、基因型确定、分析 根据凝胶上显示的条带位置，从凝胶的一端开始按照从小到大的顺序依次命名各等位基 因片段，根据每个个体等位基因片段的组成确定其基因型。 1.实验中使用的丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，且其作用具有累积性；称 取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须戴手套和面具。取用含上述化学药品的溶液也要 戴手套。尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒，但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍 应小心处理。 2.EB是一种DNA诱变剂，也是极强的致癌物，使用时要特别小心，操作必须戴手套。防 止皮肤接触。如有EB溶液溅到外面，应立即撒上漂白粉促使其分解。 3.紫外线对人的眼睛有很强的刺激作用，操作时要戴眼镜或有机玻璃防护镜。手、脸等 体表部位也应尽量避免紫外线过多照射。 4.拔出梳子后，应立即用水将形成的点样孔冲洗干净，以免析出的尿素沉入点样孔内或 未聚合的丙烯酰胺进入样品孔重新聚合，造成样品孔不规则。确保点样时，样品能顺利集中 地沉到样品孔底部。 5.变性凝胶电泳点样前，先用2～5μl上样缓冲液（不含DNA或反应物）加入点样孔内，500V恒压电泳，直到染料前沿进入凝胶几厘米，此法可在分离电泳时保持凝胶温度，并检查 点样孔是否有渗漏。 其余的注意事项参见实验九。 记录并分析本实验室的实验结果，确定每个个体在该位点的基因型。 简述STR在遗传分析中有何实际意义？ 22 变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的主要区别是什么？各自适合在什么情况下被应 用？ (刘奇迹 陈丙玺) 23 一名妇女的一个儿子患有假肥大型肌营养不良（DMD）疾病，她的一个同胞弟弟也患有该病，现在该妇女又已经怀孕，前来咨询并要求做产前诊断。（通过对突变分析 证实，这两名患者皆由于外显子20中发生了一点突变导致，该突变导致一EcoRI酶切位点丢失。） 一、实验目的 1．掌握利用系谱与DNA检测所得到的信息相结合用于产前基因诊断的方法； 2．了解DNA分析技术在遗传病产前基因诊断中的应用。 二、实验原理 PCR-RFLP分析技术是在PCR技术基础上，根据限制性内切酶识别位点改变而导致的酶 切位点增加或消失的特点，对DNA进行鉴定；利用PCR特异扩增的 DNA片断中包含某个碱基突变，经特定限制酶切割后, 通过凝胶电泳分离酶切产物大小，比较分析与对照样本的异同， 判断该DNA是否存在突变。应用PCR-RFLP分析技术可以检测已知的点突变，也可以在家系中 连锁分析进行基因诊断。 根据DMD基因序列，本实验利用PCR结合RFLP设计了一对特异性引物，首先扩增出DMD基因长度为389的特异性片段，然后选择EcoRI限制性核酸内切酶对扩增产物进行消化， 野生型基因拥有限制性核酸内切酶EcoRI的酶切位点，可被切为253bp和136bp两个片段；而突变型基因没有限制性核酸内切酶EcoRI的酶切位点，不会被切断，酶解后仍为389bp的片段；如果酶解后389bp、253bp和136bp片段均出现，说明是野生型基因与突变型基因 的女性杂合子。 三、实验准备 （一）试剂 1．DNA提取试剂、引物?和?（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5u/μl）、10XPCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、限制性内切酶EcoRI(20Ｕ/μl)、10X酶切缓冲液。 2．琼脂糖粉、10XTAE、 6X上样缓冲液、DNA分子量标记、5mg/ml溴化乙锭（EB）染液。 （二）实验用品 1.孕妇羊水、家系中患者的外周血、孕妇外周血、家系中正常男性外周血 （三）仪器和设备 PCR自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器、枪头及离心管、容器盒、恒温水浴箱、 24 四、实验方法与步骤 （一）羊水与外周血DNA提取（略） （二）基因组DNA定量（略） （三）PCR扩增（略） （四）琼脂糖凝胶电泳（略） 五、注意事项 1．聚丙烯酰胺和溴化乙锭（EB）是有毒的，需戴手套操作，避免污染。 2．每组有患者、患者父母和胎儿DNA 样本，分别进行PCR扩增． 六、预期实验结果与分析 根据患者及其相关成员的亲属关系画遗传系谱图，观察并记录聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 的DNA片段长度，画出家系各成员DMD基因EcoRI RFLP等位片段与系谱相关图，进行连锁分析，判断其所生子女患假肥大型肌营养不良的可能性。 （刘奇迹） 25 实验八 医学遗传学创新实验 唐氏综合征又称21三体综合征，是一种发病率较高的染色体病，发病率为1/800-1/600,由于该病目前尚无有效治疗方法，通过产前诊断预防患儿的出生是避免该病发生的一种有效 途径，经典的方法是通过抽取孕妇羊水做细胞培养，对胎儿进行核型分析。请利用所学医学 遗传学知识设计另外一种方法进行产前诊断。 （刘奇迹） 26