蜂毒素溶血过程及溶血作用的生化机理研究

蜂毒素溶血过程及溶血作用的生化机理研究 蜂毒素溶血过程及溶血生化机理研究 作者:李日清，林先丰，陈柏刚 指导老师:赵亚华 教授 (华南农业大学生命科学学院，广州，510642) 摘 要:观察了蜂毒素溶血过程并研究了其溶血作用的生化机理。 1,以荧光素FITC标记的蜂毒素作用于红细胞～用激光共聚焦扫描显微镜观察～发现蜂毒素迅速包围红细胞～吸附到细胞表面～该过程可能由静电作用介导。10min后细胞表面从圆盘边缘部位开始破损～破损程度和蜂毒素浓度与红细胞浓度的比值相关～达到一定比值时红细胞完全裂解。低浓度蜂毒素处理的红细胞～在扫描电镜下呈凹陷不规则形状～表面褶皱粗糙。 2,以SPQ为荧光探针测定蜂毒素作用下带3蛋白阴离子转运活性～结果显示转运活性比正常情况增加1倍以上。推测蜂毒素C端吸附带3蛋白负电荷糖化基～N端影响带3 跨膜域疏水区及膜脂流动性～促使阴离 ++子转运活性显著增强～引起红细胞内环境酸化。 3,采用钼蓝法测定Na/K-ATPase ++活性。在蜂毒素附着血红细胞质膜或游离于反应溶液的反应条件下～Na/K-ATPase活性均受到抑制～后者的抑制可通过加入EDTA得到部分解除。 蜂毒素一方面插 ++入质膜促使Na/K-ATPase二聚体解离～破坏酶结构～另一方面通过正电荷残基 ++,Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24,与ATP产生静电吸引～跟Na/ K-ATPase竞争底物～抑制其活性～从而引起红细胞内离子环境失衡。 4,分光光度计测定G-6-PD活性～发现蜂毒素抑制G-6-PD活性～当其浓度达到或大于10μmol/L时强烈抑制～加入EDTA可迅速解除部分抑制。反应启动前和反应启动时两个时刻加入蜂毒素～G-6-PD活性无明显差异～说明蜂毒素对G-6-PD二聚体无破坏作用。底物G-6-P或辅酶NADP与蜂毒素混合后加入反应系统均出现G-6-PD活性检出滞后现象～表明蜂毒素与G-6-P及NADP都具有亲和性～它是通过与G-6-PD竞争底物及辅酶来抑制G-6-PD活性的。蜂毒素抑制G-6-PD活性从而阻碍红细胞HMP途径～损害红细胞还原系统。 ++关键词: 蜂毒素 膜活性 溶血活性 带3蛋白 G-6-PD Na/K-ATPase Melittin-induced hemolytic Process and 1 the Study of biochemical Mechanism of Hemolysis induced by Melittin Author: Riqing Li, Xianfeng Lin, Baigang Chen Director teacher: Yahua Zhao (South China Agricultural University, College of Life Science, GuangZhou, 510642) Abstract: Melittin-induced hemolytic process was observed, then its biochemical mechanism was studied. 1) The treatment of erythrocytes with FITC-marked melittin, as observed by laser confocal scan microscope, showed that melittin surrounded and adsorbed the surface of erythrocytes quickly, which might be induced by static gravitation. The verge of cellular surface began to stave in 10min, and the degree of this process was related to the ratio of concentrations of melittin and erythrocytes. Erythrocytes collapsed when the ratio reached to a given value. As observed by scanning electron microscope, erythrocytes appeared lacunose and coarse after they were disposed with melittin with low concentration. 2) By measuring anion transport activity of band 3 with SPQ, it’s showed the activity was enhanced over two folds than the normal level. A mechanism is proposed that melittin adsorbs glycated groups of band 3 by its C-terminus, and influences hydrophobic region of transmenbrane domain of band 3 and lipid fluidity of plasma membrane by its N-terminus, then enhances anion transport activity, which induces inner acidification of erythrocytes. 3) Measuring ++Na/K-ATPase activity by Molybdenum-blue Spectrophotometry showed that the ++activity of Na/K-ATPase was restrained when melittin targeted to the plasma membrane of erythrocytes or when melittin was dissociative, and the latter restraining was weakened when EDTA was added to the reaction. Melittin can inserts the plasma ++membrane of erythrocytes, which leads to the breakage of Na/K-ATPase. On the other ++hand, melittin statically attracts ATP and restrains the activity of Na/K-ATPase. The restraining will break cellular ion balance. 4) Measuring G-6-PD activity by a spectrophotometer showed that the activity of G-6-PD was restrained seriously when the concentration of melittin was 10μmol/L or higher. However, this restraining effect was reduced in the presence of EDTA. Melittin did not damage the dimmer configuration of G-6-PD. A lag of activity mensuration was observed when a pre-mixture of G-6-P or NADP with melittin was set in the reaction system. This demonstrates that there is affinity between melittin and G-6-P and NADP separately, and melittin restrains the G-6-PD activity by competing G-6-P and NADP. The restraining checks cellular HMP, and damages the ability of deoxidization of erythrocytes. Key words: melittin membrane activity hemolysis activity band 3 protein ++Na/K-ATPase G-6-PD 蜂毒素,melittin,是一种由26个氨基酸残基组成的两亲性α螺旋 2 抗菌肽,antimicrobial peptide,分子，是蜂毒,bee venom,中的主要成分～其分子量为2840D。蜂毒素具有极强的广谱抗菌消炎活性～能结合到磷脂膜上～裂解各种类型的细胞和脂质体～还有抗癌、抗电离辐 [1][2]射的功能～以及有抗艾滋病毒的作用。随着传统抗生素广泛使用～出现了细菌耐药性～耐药菌株愈来愈多～甚至出现能对抗所有抗生素 [3,4]的耐药菌。研发具有抗耐药菌的新一代抗生素已经是迫切的课题。抗菌肽通过作用于细菌细胞膜而抑制或杀死细菌～不易诱发细菌耐药 [5]性～而有望替代传统抗生素成为新一代抗生素。蜂毒素因其生物活性高～且结构特殊～已经成为生物学界研究这类抗菌物质的模式 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 。然而蜂毒素具有溶血副作用～极大地限制了其在医药方面的应用。在蜂毒素抗菌机制和溶血机理研究的基础上～通过生化或基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 手段改造蜂毒素分子以保留其抗菌活性和消除其溶血活性已成为研究热点[6,7]。蜂毒素的溶血机理的研究是其分子改造的理论基础。目前主要通过蜂毒素与脂质体、合成磷脂双层膜或天然质膜的作用关系来研究其 [8,9]溶血机理。研究认为蜂毒素溶血活性主要是基于穿孔机制。但是蜂毒素与红细胞膜上以及细胞内重要酶的作用关系目前还没有深入研究～使得蜂毒素溶血机理尚不完备。笔者通过激光共聚焦扫描显微镜直接观察蜂毒素的溶血过程～进而研究蜂毒素对红细胞膜上和胞质重要酶的生化作用关系～从而全面阐述蜂毒素溶血机理～探索其溶血活性的生化基础～为蜂毒素分子改造、溶血活性消除提供理论依据。 带3蛋白是红细胞整合蛋白～在红细胞膜骨架形成和稳定中起重 ,,要作用。同时具有介导Cl/HCO离子交换的活性～维持红细胞内环3 3 ++境pH值稳定。钠钾ATP酶,Na/K-ATPase,是红细胞膜上重要的ATP酶～维持红细胞的渗透性和静息电位、保持细胞体积及可塑性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,G-6-PD,是磷酸戊糖途径(HMP)的限速酶～能催化产生红细胞还原当量NADPH～从而保护红细胞免受氧化损伤。这些蛋白和酶在血红细胞稳定及避免溶血中起着关键作用。研究蜂毒素对带3 ++蛋白、Na/K-ATPase和G-6-PD的作用机理将有助于蜂毒素溶血机理的阐明。 1 材料与方法 1.1 材料 新鲜肝素,Heparin,抗凝鸡血,每100mL血液加入20mg肝素,。Melittin、Heparin、FITC、SPQ、G-6-P、NADP、Ouabain、ATP-Na2均为Sigma公司产品。戊二醛、锇酸由华南农业大学测试中心电镜室提供。其他试剂为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 红细胞悬液的制备 新鲜的肝素抗凝鸡血～4? 3000rpm 离心20min得到积压红细胞～以4?预冷生理盐水洗涤3次～悬浮～制成5,红细胞悬液～4?保存,可稳定一周,。 1.2.2 溶血素的制备 取10mL 5%红细胞悬液～4? 5000rpm离心10min～去上清～沉淀用9.5mL 4?预冷双蒸水,每100mL加入5μL β-巯基乙醇,溶解～即可得到1 : 20溶血素～4?保存,不宜超过8h,。 4 1.2.3 红细胞膜的制备 按文献[10]中的方法制备红细胞膜～用0.75mmol/L蔗糖制成膜制剂溶液～用改良Lowry法测定蛋白浓度～-20?贮藏。 1.2.4 激光共聚焦扫描显微镜观察蜂毒素溶血过程 40μL 35μmol/L蜂毒素溶液加入1μL 1,FITC溶液,丙酮做溶剂,～混匀～25?避光标记2h。取其中10μL加到60μL 5,红细胞悬液中～涂布于鸡蛋清处理过的载玻片上～激光共聚焦显微镜下观察～λex=492nm～λenm=518nm～每15S扫描一次。 1.2.5 扫描电镜观察蜂毒素处理后红细胞 1mL 5%红细胞悬液加入30μL蜂毒素溶液～混合～37?水浴10min～1500rpm离心10min～弃上清～沉淀以等渗PBS洗3次。4%戊二醛溶液固定过夜～等渗PBS洗3次。1500rpm离心2min～沉淀以1%锇酸固定1h，70%乙醇洗3次。1500rpm离心2min～沉淀上台点样～CO2干燥～真空喷金。,以上步骤均在4?下进行。,样品在扫描电镜下观察拍照。 1.2.6 带3蛋白阴离子转运活性测定 采用文献[11]报道的方法。红细胞以低渗法转载SPQ荧光探针后～重悬于等渗溶液中,红细胞浓度2%,～加入蜂毒素,终浓度0.4μmol/L,～用F-4500型荧光分光光度计测定荧光强度～激发波长=320nm～发射波长=445nm～每5min记数一次。 ++1.2.7 Na/K-ATPase活性的测定 以500μmol/L KHPO为标准溶液～测定、绘制D值与磷,Pi,24660nm 5 ++浓度关系的标准曲线。Na/K-ATPase活性参考文献[12]报道的方法测定～以有和无Ouabain条件下水解ATP生成Pi的量的差值来表征。各组试验经三次平行测定～取平均值。 1.2.8 G-6-PD活性的测定 按文献[13]中的方法测定。蜂毒素与底物G-6-P或辅酶NADP混合加入反应体系以启动反应。各组试验均经三次平行重复～取平均值。 2 结果与分析 2.1 蜂毒素的溶血过程 荧光探针FITC标记蜂毒素在λex = 492nm条件下发射绿色荧光。将FITC标记蜂毒素加入红细胞悬液中～激光共聚焦扫描显微镜下动态观察蜂毒素与红细胞的作用过程和程度。FITC标记蜂毒素浓度为5μmol/L,可完全溶血,时～看到蜂毒素迅速聚集到红细胞周围～附着细胞表面～使红细胞呈现略黑的圆盘状。圆盘边缘附着蜂毒素最为密集,见图1,。10min后～红细胞圆盘边缘附着蜂毒素部位呈小碎片脱落～红细胞逐渐变薄、变亮。接着细胞边缘开始破损～裂解～并逐渐向细胞中央发展～直至细胞成为碎片状残骸。该过程在2min内完成。细胞裂解程度与蜂毒素浓度相关～降低加入蜂毒素的浓度时,<1μmol/L,～发现多数细胞被蜂毒素包围附着后并没有裂解～部分周围蜂毒素密集的细胞逐渐裂解～表明裂解程度与蜂毒素浓度以及红细胞浓度相关～当两者达到或超过一定比值时细胞被裂解。 6 图1 蜂毒素溶血过程的激光共聚焦扫描观察 a、b: 蜂毒素迅速聚集到红细胞周围～附着细胞表面, c、d: 10min后细胞膜出 现小孔状破损, e、f: 细胞外围开始裂解, g、h: 细胞塌陷瓦解。 Fig. 1 observe the process of melittin-induced hemolysis by LCSM a、b: melittin reached erythrocytes and adsorbed them quickly; c、d: the plasma membrane began to form small gaps in 10min; e、f: periphery of erythrocytes began to crack; g、h: erythrocytes collapsed. 蜂毒素附着红细胞一段时间,10min,后才使红细胞发生破损等显 [8]著变化～这与Seong-Cheol Park等描述的蜂毒素接近、附着脂质体表面～经过与磷脂双层膜一定作用过程后插入双层膜、α螺旋二级结构形成和聚集～最终形成环形空洞,toroidal pore,使双层膜裂解的过程相近。然而红细胞质膜组成比脂质体磷脂膜复杂。蜂毒素迅速附着红细胞表面,见图1a、b,～两者存在强的吸引作用～这可能与红细胞膜上负电荷糖蛋白相关,见本文2.2,。蜂毒素对红细胞蛋白和酶存在着广泛影响。 5%红细胞悬液经1μmol/L蜂毒素处理30min后～扫描电镜观察,见图2,～发现红细胞瘦瘪多凹陷～形状不规则～表面褶皱粗糙～表明细胞膜受到一定程度损伤～细胞渗透失去平衡,见本文2.2和2.3,。 7 图 2 蜂毒素作用后红细胞的扫描电镜图片 a、c: 正常红细胞, b、d: 1μmol/L蜂毒素处理后红细胞。 Fig. 2 electron microscopy scanning of erythrocytes disposed by melittin a、c: natural erythrocytes; b、d: erythrocytes disposed by 1μmol/L melittin. 2.2 蜂毒素对带3蛋白的作用关系 带3蛋白是红细胞跨膜蛋白～又称阴离子交换蛋白～由911个氨 [14,15]基酸残基组成～包括N端胞质域、跨膜域和酸性C端域～跨膜区 ,,是Cl/HCO离子交换的活性部位～对组织CO运输和CO排出过程322 [16]发挥重要作用。跨膜域细胞外侧被糖基化修饰。带3蛋白和血型糖蛋白经糖基化后携带负电荷的唾液酸～承载了红细胞表面绝大部分净 [17]负电荷。蜂毒素分子含有5个净正电荷,Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24,～其中C端末尾集中排列着四个正电荷残基～推测和红细胞表面存在静电作用。图1显示FITC标记蜂毒素迅速聚集包围红细胞～说明两者之间存在强的吸引～这与静电吸引的推测相符。 蜂毒素若吸附带3蛋白糖化基～对带3 蛋白阴离子转运活性可能 8 造成影响。红细胞在溶液?,NaCl 101mmol/L, KCl 5mmol/L,GaCl 22mmol/L, MgCl 2mmol/L,甘露醇 50mmol/L～葡萄糖 5mmol/L～pH7.4 2 Hepes-Tris 5mmol/L,中装载2.85mmol/L SPQ荧光探针后～重悬于溶液?(NaNO 101mmol/L, KNO 5mmol/L, Ga(NO) 5mmol/L, 3332Mg(NO) 2mmol/L, 葡萄糖 5mmol/L～pH7.4 Hepes-Tris 5 mmol/L,中～32 ,加入蜂毒素,终浓度0.4μmol/L,～测定荧光强度,见图3,。Cl对SPQ ,有淬灭作用～细胞内荧光强度增加可表征Cl转运出胞作用增强～即带3蛋白阴离子转运活性增强。图3中可看到～0.4μmol/L蜂毒素作用下 ,带3蛋白Cl转运活性在反应初期增加了超过1倍。随着蜂毒素作用时间增加～转运活性呈现较高水平～而且很平稳。 图3 蜂毒素作用下红细胞带3蛋白的阴离子转运活性 a: 蜂毒素作用下红细胞胞内荧光强度, b: 正常红细胞胞内荧光强度。 Fig. 3 the activity of band 3-mediated anion transport of erythrocytes being treated with melittin a: intensity of fluorescence in erythrocytes being treated with melittin; b: intensity of fluorescence in natural erythrocytes. [18]张振纲等对比研究了DIDS,阴离子转运抑制剂,和Concanavalin A,Con A,对带3蛋白阴离子转运活性的影响:DIDS进 9 入带3膜内疏水区引起共价交联～使带3蛋白构象紧密～不可逆地抑制带3转运活性,Con A结合带3蛋白疏水糖化基～使带3蛋白结构松散和膜脂流动性增加而促使带3转运活性增强。蜂毒素使带3转运活性增强～推测其C端4个正电荷残基吸附带3蛋白糖化基的负电荷唾液酸～N端影响带3 跨膜域疏水区及膜脂流动性～引起带3转运活性 ,,增强。而这将加速Cl出胞、HCO入胞的过程～促使细胞内pH值迅3 速降低～细胞内环境酸化。 ++2.3 蜂毒素对Na/K-ATPase的作用关系 ++Na/K-ATPase是低聚体跨膜蛋白～对红细胞内外离子浓度、红细 [19]胞膜电势以及细胞内外渗透压平衡的维持与调节具有重要作用。 ++++Na/K-ATPase由α、β、γ亚基组成～其中Na、K等阳离子以及ATP [20,21]结合位点、磷酸化调节位点均位于α亚基,见图4,。Ouabain是 ++[20]Na/K-ATPase的特异性抑制剂～其结合位点位于α亚基N端前两个α螺旋的质膜外侧。 ++图4 Na/K-ATPase结构,不包括γ亚基, ，，A: Ouabain结合位点,B: K结合位点,C: Na结合位点,D:ATP结合位点 ++Fig.4 The structure of Na/K-ATPase ，，A: Ouabain binding site; B: Kbinding site; C: Nabinding site; D: ATP binding site 10 ++Melittin作用于Na/K-ATPase时～可能作用于膜外侧,Ouabain ，，结合位点、K结合位点等,～或者膜内侧,ATP、Na结合位点等,。由 ++于melittin具有膜活性,附着并插入磷脂双层膜中,～同时Na/K-ATPase活性依赖于质膜的完整性～melittin可能通过插入质膜影响膜性质而影 ++响Na/K-ATPase结构和功能。在反应体系中～melittin与细胞质膜存在三种关系模式:?melittin附着或插入质膜中,?melittin游离于质膜外的溶液中,?插入,附着,质膜与游离两种形式并存。表1中测定 ++了Na/K-ATPase在第一种模式,a组,和第三种模式,b组:melittin插膜之后进行反应,c组:melittin插膜过程与反应同时进行,的活性变化。表中显示a组比对照组,d组,活性下降了35.8,～B组下降43.6,～c组下降46.1,～表明melittin插入,附着,在细胞膜上可致使 ++++Na/K-ATPase受到抑制～游离melittin也对Na/K-ATPase产生抑制作用,因为b和c组酶活性均比a组下降更多,。 11 ++表1 不同存在模式下melittin对Na/K-ATPase活性的影响 ++Table 1 Effects of Na/K-ATPase activity caused by melittin in different pattern a b c c′ d d′ 试剂(μL) 100 100 100 100 100 100 膜制剂 490 500 500 500 500 500 0.7mol/L蔗糖溶液 60μmol/L Melittin 10 ― ― ― ― ― 37?水浴20min～12 000rpm离心10min～去上清, 0.7mol/L蔗糖溶液重悬～12 000rpm离心10min～去上清 60μmol/L Melittin ― 10 ― ― ― ― 350 340 340 310 350 320 蒸馏水 37?水浴20min 10μmol/L Ouabain ― ― ― 30 ― 30 60μmol/L Melittin ― ― 10 10 ― ― 注1150 150 150 150 150 150 混合液 37?水浴60min TCA 300 300 300 300 300 300 混匀～12 000rpm离心5min～各取上清200μL加入注2 定磷液800μL 56?水浴10min～冷却后稀释4倍～测定OD660nm OD660nm 0.130 0.120 0.110 0.025 0.200 0.005 2.46 2.27 2.08 0.47 3.78 0.09 Pi生成速率(μmol/L Pi/g?h) 2.37 2.08 1.99 ― 3.69 ― 酶活力(μmol/L Pi/g?h) a:插膜模式～melittin处理细胞膜20min～离心去除溶液中游离的melittin,b:插入,附着,质膜与游离两种形式并存模式～melittin处理细胞膜20min后启动反应,c:melittin插膜过程与反应同时进行模式～在启动反应时加入melittin,d:不加melittin。 注1: 混合液成分为NaCl 1200mmol/L, KCl 200mmol/L, MgCl 30mmol/L, 2Tris-HCl(pH7.4) 1200mmol/L, ATP-Na 40mmol/L, 加入混合溶液后～反应即被启动。 2 注2: 定磷液为2.5,钼酸铵:17,硫酸:10抗坏血酸:HO = 1:1:1:2。 2 a: inserting in plasma membrane; b: inserting in plasma membrane and being free in solution; c:melittin is added in when the reaction begins; d: contains no melittin. Note1: The mixed solution contained NaCl 1200mmol/L, KCl 200mmol/L, MgCl 2 30mmol/L, Tris-HCl(pH7.4) 1200mol/Lm, ATP-Na 40mmol/L, when it was added in, the 2 reaction was started. 若在启动反应时同时加入melittin,终浓度为1μmol/L,～反应0、5、10、15、20、25、30min时分别测定反应体系中的Pi 浓度～得到melittin ++存在时Na/K-ATPase活性随时间的变化情况,见图5,。图中曲线在10,15min的区间内酶活性急剧下降～0,10min以及15min以后则平缓稳定下降。10,15min大致与melittin插入细胞膜的时间吻合,见本 12 ++文2.1,～表明melittin插膜对Na/K-ATPase活性的破坏具有时间区间 ++性以及不持续性,游离melittin则持续稳定地抑制Na/K-ATPase。 ++图5 melittin作用下Na/K-ATPase的活性衰减曲线 ++ Fig. 5 attenuation curve of Na/K-ATPase activity caused by melittin 设臵四组反应(a、b、c、d组)～细胞膜均以1μmol/L melitin处理20min后～b、c、d组分别加入1mmol/L EDTA～a组不加～启动发应,调节启动反应时ATP加入量～使得a、b、c、d组ATP的终浓度分别为:2.0、1.8、1.9、2.0 mmol/L,～平行测定四组的酶活性变化曲线,见图6,。结果显示EDTA存在时～酶活性衰减相对减缓～降低反应体系中ATP的浓度时衰减减缓得到了回复。EDTA可阻止melittin与其他分子间的静电作用,见本文2.4,～由此推测ATP以其带负电荷磷酸基团与melittin ++存在静电亲和～抑制Na/K-ATPase。 13 ++图6 EDTA缓冲melittin对Na/K-ATPase的抑制作用 a: ATP 2mmol/L,不含EDTA,,b: ATP 1.80mmol/L,含EDTA,,c: ATP 1.90mmol/L,含EDTA,,d: ATP 2mmol/L,含EDTA,。 ++ Fig. 6 EDTA weakens the restraining of Na/K-ATPase caused by melittin a:ATP 2mmol/L(contains no EDTA);b:ATP 1.80mmol/L (contains EDTA); c: ATP 1.90mmol/L(contains EDTA);d: ATP 2mmol/L(contains EDTA). 另外～表1中c′组Pi生成速率大于d′组～表明melittin影响Ouabain ++对Na/K-ATPase的专一性抑制作用～估计melittin可作用于 ++Na/K-ATPase的Ouabain结合位点。 2.4 蜂毒素对G-6-PD的作用关系 G-6-PD是红细胞磷酸戊糖,HMP,途径中的限速酶～由两个亚基 [22]构成的二聚体～在底物葡萄糖-6-磷酸,G-6-P,与辅酶NADP存在的条件下～可将NADP还原为NADPH～同时生成6-磷酸葡萄糖酸。测定NADP被还原为NADPH的速率～可换算出G-6-PD的活力。NADPH生成量与G-6-PD活性成正相关～可表征G-6-PD活性变化情况,E=(100×ΔA×Vc )/(6.22×VH×Hb)～其中ΔA:在340nm每分钟的 14 吸光度变化,Vc:测定体系的总体积,VH:加入的溶血素的量,6.22:1mmol的NADPH在340nm的吸光度值,Hb:溶血素的血红蛋白浓度[13]。对比体系加入与不加入蜂毒素,其在反应体系中的终浓度为1.76μmol/L,时NADPH的生成速率,操作见表2,～发现反应体系中存在1.76μmol/L melittin时～40min内G-6-PD活性下降了18.3,～同时出现G-6-PD活性检出滞后的现象,见图7,～图中可看到活性检出滞后时间约为2min。 表2 G-6-PD活性的测定 Table 2 The activity mensuration of G-6-PD 试剂(μL) a b c 1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 200 200 200 5mmol/L EDTA 200 200 200 2mmol/L NADP 200 200 200 1mmol/L MgCl200 200 200 2 1:20溶血素 40 40 40 蒸馏水 960 860 860 37?温育10min 6mmol/L G-6-P 200 , 200 6mmol/L G-6-P与35μmol/L , 300 , Melittin 2:1混合液 35μmol/L Melittin , , 100 a组为对照～不含melittin,b组melittin和G-6-P混合, c组melittin与G-6-P不 混合。各试剂加于石英比色杯中～反应启动后马上读取光密度值。 a: antitheses, contained no melittin; b: melittin and G-6-P were mixed; c: melittin and G-6-P were disjoined. 15 图7 以底物启动发应时G-6-PD催化NADPH生成速率随时间的变化 a:以G-6-P启动反应,b:以melittin和G-6-P混合液启动反应,c:melittin 与G-6-P分开～但同时加入反应体系启动反应。 Fig.7 Velocity of NADPH formnation catalyzed by G-6-PD when the reaction was started with G-6-P a: reaction started with G-6-P; b: reaction started with the mixture of melittin and G-6-P; c: melittin and G-6-P were disjoined, but added in at the same time. 活性检出滞后可看作G-6-PD活性的强烈抑制～滞后阶段以后反应呈现平稳受抑状态,见图7 b曲线,～说明6mmol/L G-6-P与35μmol/L melittin混合液,2:1体积比,加入反应体系后～先是G-6-PD活性强烈抑制～约2min滞后抑制发生突变～趋于稳定平缓。c组G-6-P和melittin分开加入反应体系中～没有出现活性检出滞后～但明显0,2min c曲线斜率低于2min之后的斜率。对比b和c～表明G-6-PD活性检出滞后由G-6-P与melittin混合发生相互作用引起的。 G-6-P与melittin混合液加入NADP、EDTA、MgCl、Tris-HCl之2 后,见表3 ?体系 d组。此时～d的溶液成分组成与d加入d′后的总反应体系的溶液成分组成一致,启动反应～没有出现G-6-PD活性检出滞后,图8 d′曲线,,若G-6-P与melittin混合液不含EDTA,表3 e组,～则出现活性检出滞后～表明EDTA存在时影响G-6-P与melittin的相互 16 作用。在G-6-P与melittin混合液中不含EDTA前提下～设臵melittin浓度梯度,6.65μmol/L、11.7μmol/L、23.4μmol/L～见表3 f、g、h组,～发现6.65μmol/L melittin与G-6-P混合不会引起G-6-PD活性检出滞后～11.7μmol/L和23.4μmol/L时则出现～并且随melittin浓度增加滞后时间相应增加～反应曲线斜率液随之减小。已有研究显示melittin在纯水中浓度低于10μmol/L时以单体形式存在～达到10μmol/L时开始聚集形 [23]成四聚体～且聚集程度随浓度增加而增加～50μmol/L达到最大值～ 24]溶液中离子的存在与增加会使melittin更易聚集[。图8中f′、g′、h′组的G-6-PD活性检出滞后时间与melittin浓度成正相关～且浓度低于10μmol/L时没有活性检出滞后现象～表明G-6-PD活性检出滞后与melittin四聚体的形成密切相关。对比图8中d′与e′组～d、e中melittin浓度均为11.7μmol/L(>10μmol/L)，e引发活性滞后,形成四聚体,～ 而d由于存在EDTA没有出现活性检出滞后～表明EDTA抑制melittin聚集形成四聚体。 17 表3 梯度浓度melittin与EDTA对G-6-PD活性的作用 Table 3 Effects of G-6-PD activity caused by melittin with concentration grads and EDTA ?体系 试剂(μL) d e f g h 1mol/L 30 30 30 30 30 Tris-HCl(pH7.4) 5mmol/L EDTA 30 , , , , 2mmol/L NADP 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 1mmol/L MgCl2 35μmol/L melittin 100 100 57 100 198 100mmol/L G-6-P 12 12 12 12 12 蒸馏水 68 98 141 98 , 混匀～37?水浴预热 ?体系中d、e、f、g、h的melittin浓度依次为11.7μmol/L、11.7μmol/L、6.65μmol/L、 11.7μmol/L、23.4μmol/L。d组含EDTA～其他组不含EDTA。d、e、f、g、h的Tris-HCl、 +NADP、Mg浓度与?体系d′、e′、f′、g′、h′是一致的。 In I system, melittin concentration of d、e、f、g、h were 11.7μmol/L、11.7μmol/L、 6.65μmol/L、11.7μmol/L、23.4μmol/L, respectively。d contained EDTA, and the others contained no. ?体系 试剂(μL) d′ e′ f′ g′ h′ 1mol/L 170 170 170 170 170 Tris-HCl(pH7.4) 5mmol/L EDTA 170 170 , , , 2mmol/L NADP 170 170 170 170 170 1mmol/L MgCl 170 170 170 170 170 2 1:20溶血素 40 40 40 40 40 蒸馏水 980 980 1150 1150 1150 37?温育10min ?体系试剂加于石英比色杯中。?体系d、e、f、g、h分别加到d′、e′、f′、g′、h′ 中启动反应,?体系不含底物G-6-P，而?体系含G-6-P，?体系加到?体系后启动 反应,～ 此时d′、e′、f′、g′、h′各反应体系中melittin的终浓度为:1.76μmol/L、1.76μmol/L、 1.00μmol/L、1.76μmol/L、3.52μmol/L。 In the ? system, all reagents were added in the respective quartz cup. d、e、f、g、h added in d′、e′、f′、g′、h′ separately and relevant reactions were started, when the melittin concentration of d′、e′、f′、g′、h′were 1.76μmol/L、1.76μmol/L、1.00μmol/L、1.76μmol/L、 3.52μmol/L, respectively. 18 图8 梯度浓度melittin及EDTA对G-6-PD活性的作用 d′、e′含EDTA～反应启动前melittin浓度为11.7μmol/L,f′、g′、h′不含EDTA～反应启动前melittin浓度分别为6.65μmol/L、11.7μmol/L、23.4μmol/L。 Fig. 8 Effects of G-6-PD activiry caused by melittin with concentration grads and EDTA d′、e′contained EDTA, the melittin concentration was 11.7μmol/L;f′、g′、h′contained no EDTA, the melittin concentration were 6.65μmol/L、11.7μmol/L、23.4μmol/L, respectively. G-6-PD活性检出滞后延续较短的时间～G-6-P与melittin混合液加入反应体系后～随melittin浓度降低,比如表3中d′组～浓度从11.7μmol/L变为1.76μmol/L,四聚体解体～活性检出滞后消失～G-6-PD进入平缓稳定的抑制期～表明melittin的不同结构形态,四聚体与单体,对G-6-P的相互作用差异悬殊。 将表2中2mmol/L NADP和6mmol/L G-6-P位臵对换～6mmol/LG-6-P与35μmol/L melittin混合液改为2mmol/L NADP与35μmol/L melittin混合液,即由NADP或者NADP与melittin混合液来启动反应,～进行表2的操作～结果出现跟图7类似的现象,见图9～曲线a′、b′、c′对应表2的 a、b、c,。 a′、b′、c′斜率分别低于a、b、c～b′的活性检出滞后时间约1.5min～略小于b,约2min,。可见G-6-P及NADP与melittin的作用关系是相同的。G-6-P、NADP、EDTA、melittin的分子结构如图10所示。G-6-P、NADP和EDTA的共同特点是带有 19 带负电荷的基团,磷酸基团和羧基,。Melittin肽链中Lys7, Lys21, Arg22, Lys23, Arg24等5个残基带正电荷～聚集为四聚体时～形成疏水中心～ [25]亲水面向外～正电荷均匀分布在四聚体分子周围。推测G-6-P、NADP 与melittin的相互作用是由磷酸基团与melittin正电残基的静电作用引 起的。Melittin单体,无规则卷曲肽链,的正电荷无序而分散～四聚体 的形成使得正电荷集中且均匀地分布～造成四聚体和单体对G-6-P和 NADP的作用差异明显。EDTA以四个空间分布特殊的羧基～阻止 melittin聚集形成四聚体～同时削弱了其与G-6-P和NADP的静电作用。 G-6-PD正常反应曲线、反应体系加入melittin或melittin与EDTA混合 液时的反应曲线,见图11,～与以上推测相吻合。 图9 以辅酶启动发应时G-6-PD催化NADPH生成速率随时间的变化 a′:以NADP启动反应,b′:以melittin与NADP混合液启动反应,c′:melittin 和NADP分开～但同时加入反应体系～启动反应。 Fig.9 Velocity of NADPH forming catalyzed by G-6-PD when the reaction are start with NADP a′: reaction started with NADP; b′: reaction started with the mixture of melittin and NADP; c′: melittin and NADP were disjoined, but added in at the same time. 20 图10 G-6-P、NADP、EDTA、ATP、melittin分子结构 Fig.10 The molecular structures of G-6-P、NADP、EDTA、ATP and melittin 图11 EDTA对G-6-PD活性的影响 i:正常反应,不含melittin,, j:加入2μmol/L melittin和0.5mmol/L EDTA, k:加入2μmol/L melittin。 Fig.11 The G-6-PD activity effected by EDTA i: contained no melittin; j: contained 2μmol/L melittin and 0.5mmol/L EDTA; : contained 2μmol/L melittin. k 以2μmol/L melittin处理溶血素,含G-6-PD,30min后启动反应～与不经melittin处理而在启动反应时加入2μmol/L melittin～两种反应条件下的G-6-PD活性没有明显差异,见图12,～表明melittin不会损伤G-6-PD二聚体～而是通过与其底物,G-6-P,及辅酶,NADP,的静电 21 作用来抑制G-6-PD。 图12 melittin对G-6-PD二聚体的影响 m: 2μmol/L melittin处理G-6-PD 30min后启动反应, n: 不经melittin处理而 在启动反应时加入2μmol/L melittin。 Fig.12 The effect of melittin on G-6-PD dimmer formation m: 2μmol/L melittin was added 30 min before the start of reaction; n: 2μmol/L melittin was added at the time the reaction started. G-6-PD存在辅酶结合位点和底物结合位点～辅酶结合位点与辅酶NADP亲和作用极强～极低NADP浓度下即可反应～NADP的浓度变化对G-6-PD活性影响不明显,底物结合位点对G-6-P亲和性较弱～G-6-P浓度降低时G-6-PD活性下降显著。在NADP为40μmol/L的情况下～若G-6-P浓度从600μmol/L下降至250μmol/L～G-6-PD活性则减少53.6,。melittin静电吸引G-6-P～降低溶液中G-6-P浓度而影响G-6-PD活性。在血红细胞内～[NADP]/ [NADPH]=1/71～NADPH稳定 [26]浓度为65μmol/L～NADP浓度约为1μmol/L～G-6-P浓度为 [27]83μmol/L～由于在红细胞内环境中NADP、G-6-P浓度很低～1μmol/L melittin将几乎完全抑制G-6-PD的活性。 22 3 结 论 蜂毒素溶血过程里～蜂毒素分子首先迅速聚集并吸附在红细胞表面周围～推测该过程由蜂毒素C端正电荷残基密集部位与红细胞带3蛋白以及血影蛋白负电荷糖化基之间的静电作用引起。吸附红细胞表面的蜂毒素经过10min的作用过程～引发红细胞圆盘边缘开始破损、脱落。破损程度和蜂毒素浓度及红细胞浓度的比值相关～达到一定比值时红细胞被裂解。低浓度蜂毒素使红细胞膜受到一定程度的损害～细胞内外渗透平衡打破～使红细胞凹陷、不规则形状～表面粗糙。这与 ++红细胞带3蛋白及Na/K-ATPase活性受到蜂毒素影响相关。 蜂毒素可能通过正电荷残基密集的C端与带3蛋白负电荷糖化基作用～同时疏水N端引起带3蛋白结构以及其周围膜脂流动性变化～促 ,,使带3蛋白阴离子转运活性显著增加～Cl出胞、HCO入胞过程得以3 加速～将影响红细胞CO运转和排出功能～同时引起细胞内pH值迅速2 降低。Melittin以其膜活性破坏血红细胞质膜完整性～从而间接破坏 ++Na/K-ATPase活性～同时也通过与底物ATP的静电作用直接抑制 ++Na/K-ATPase的酶活。ATP是红细胞内的供能分子～melittin的作用将影响ATP参与的代谢反应～对红细胞代谢产生广泛的干扰,见图10,。 Melittin对G-6-PD的抑制作用基于其与辅酶NADP及底物G-6-P的静电作用,G-6-P、NADP的负电荷磷酸基团与melittin的正电荷氨基酸残基,～而对G-6-PD二聚体没有直接的损害。当melittin从无规则卷曲单体聚集形成四聚体时～由于正电荷排布的均匀及有序化～对G-6-P及NADP的亲和发生急剧变化。细胞内NADP的稳定浓度为 23 [26]1μmol/L ～低浓度melittin将几乎完全抑制G-6-PD的活性～中断红 细胞HMP途径～胞内还原系统受到抑制～红细胞于是容易受到强氧化 性分子的攻击而使细胞膜受损～诱发溶血。G-6-P既是G-6-PD的底物～ 也是血红细胞糖酵解,EMP,中的关键性中间产物～melittin与G-6-P 的作用干扰EMP途径～造成细胞内代谢干扰。 EDTA存在四个空间分布特殊的羧基～阻止melittin聚集形成四聚 体～同时也削弱melittin与NADP、G-6-P、ATP等分子的静电作用。 EDTA可作为melittin结构机理研究的一种工具性试剂。 [参考文献] [1] Zhao YH, Liu AS, Li RQ, et al. 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