应用csc-ge-80基因芯片筛查人子宫内膜早期异位种植的血管生长相关基因

应用csc-ge-80基因芯片筛查人子宫内膜早期异位种植的血管生长相关基因 *优秀文档,值得下载* 应用CSC-GE-80基因芯片筛查人子宫内膜早期异 位种植的血管生长相关基因 作者:王宁宁，张玉凤，张红霞，谭金凤，谢洪哲，姚书忠，庄广伦，牛刚，黄建昭，何勉 DLclass=page_txt STRONG【摘要】/STRONG【目的】探讨子宫内膜异位早期种植的相关基因，特别是与早期种植相关的血管生长基因。【方法】采用裸鼠人子宫内膜皮下种植的方法，建立裸鼠人子宫内膜异位症模型，在种植后14d，取出成模病灶与未种植内膜进行CSC-GE-80基因芯片筛查比较。【结果】在基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达谱中最有显著性上调基因50个，最有显著性下调基因47个，包括生长因子和细胞因子及其受体的变化，其中生长因子受体结合蛋白10(growthfactorreceptor-boundprotein10，Grb10)与丁酸盐反应因子1(butyrateresponsefactor1)中表皮生长因子(EGF-responsefactor1)上调明显，下调明显胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-likegrowthfactorbindingprotein7)。【结论】通过基因筛查我们初步考虑生长因子结合蛋白10(growthfactorreceptor-boundprotein10)有可能参与早期异位内膜的血管生长。 STRONG【关键词】/STRONG子宫内膜异位症;早期种植;裸鼠模型;基因 *优秀文档,值得下载* 芯片;血管生长 子宫内膜异位种植的原因，一直是人们是人们关注的热点。在我们前期的研究中，通过裸鼠进行人子宫内膜的异体异位种植，我们发现血管生成及其相关因子如血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在异位内膜的早期种植与生长的过程中，起十分重要的作用[1,2]。但子宫内膜异位种植的早期，究竟是哪些基因发生变化或者在这一过程中起到作用，仍不十分清楚。我们拟通过基因芯片筛查种植在裸鼠的人子宫内膜异位病灶，为早期的种植相关基因提供了一定的理论依据。 STRONG1材料与方法/STRONG 1(1实验动物 由中山大学实验动物中心提供SPF级饲养BALB/c裸鼠,雌性,体质量17~21g,实验过程饲养在清洁环境，(温度:22,24?，湿度:45%,70%，12h黑白交替)，每1只放1笼，共5只，饲养予以灭菌的水与饲料，每周添加鸡蛋、葵花籽以增加蛋白质等营养的摄入。 1.2人子宫内膜组织的获取 *优秀文档,值得下载* 子宫内膜取自子宫腺肌症伴盆腔子宫内膜异位症患者2例，年龄分别为43与47岁。手术前6个月未进行激素类药物Medicine治疗，在进行全子宫切除后立即进行内膜组织的刮取，种植前部分内膜进行HE染色组织病理分析。取材后将内膜无菌保存在德氏改良基础培养基(Dulbcco′smodifedeaglemedium，DMEM)培养液中，一部分剪成3mm×3mm大小，另 诊刮后60min内完成皮下种植术。一部分继续剪成0.5mm×0.5mm碎屑液, 两例患者术后病理均提示子宫腺肌症，分泌期子宫内膜。 1.3BALB/c裸鼠人子宫内膜异位症的模型建立 详细方法参照参考文献[1]进行,子宫内膜裸鼠皮下异位种植14d成模后取出进行检测。 1.4主要试剂 Cy3荧光素标记的单克隆抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(Cy3conjugatedmonoclonalanti-α-smoothmuscleactinclone,1?400)购自英国Sigma公司;FITC荧光素标记单克隆羊抗兔抗体(1?200)购自购自美国SantaCruz公司。DMEM培养液购自GiBco公司。TrizolReagent购自LifeTechnologies公司。QiageneRT-PCR、Qiagene快速PCR纯化试剂盒购自Qiagene公司。AmbionmessageAmpaRNA试剂盒购自Ambion公司。CyScribecDNA荧光标记试剂盒购自Amersham生物制药技术有限公司。基 *优秀文档,值得下载* 因表达谱芯片CSC-GE-80由深圳微芯公司提供。 1.5种植病灶的基因芯片检测 1.5.1总RNA提取保护液中保存的小块新鲜组织采用Trizol的方法进行提取与微量扩增、纯化，把所得到的cDNA真空抽干至体积小于8μL，并保存在-20?。接着RNA的扩增aRNA的纯化参照试剂盒进行,将aRNA样品于-80?存放，取5,20μg进行反转录标记。 1.5.2探针标记与芯片杂交探针标记采用aRNA10μg,secondroundprimer1 μL,SpikeRNA2μL,DEPCwater加至10μL,70?5min变性，然后冰上冷却后，采用Buffer4μL,0.1mol/LDTT2μL,dNTPmix1μL,dye-dCTP1μL,RibonucleaseInhibitor1μL,RT1μL,42?连续2h,反应完毕后，用2μL0.5mol/LNaOH,处理后，然后用将pH值调为中性。采用QIAquickPCRPurificationKit纯化按照说明书进行。 芯片杂Traffic交通过将玻片放入片夹，将片夹放入染色缸，置于摇床上于室温缓慢摇晃20~30min，甩干与干燥，将标记好的探针(Cy3/Cy5)按等量混匀(各50pmol/L),抽干后，按顺序加入下列试剂:杂交缓冲液7.5μL，甲酰胺15μL，加灭菌水至总体积30μL;离心，95?水浴5min，立刻置于冰上1min，与样品结合，盖上盖玻片，42?孵箱中16h。迅速放入另一个预先盛有200-250mL预热至55?的洗脱液I染色缸中，将染色缸置于摇 *优秀文档,值得下载* 床上于室温缓慢摇晃20min;取出片夹，再重复洗涤，干燥。玻片完全干燥后，放入扫描片夹中，利用扫描仪(Generation?arrayscanner,AmershamPharmacia)进行扫描;扫描后将图像转化为基于荧光强度的数字信号(Imagequant5.0;ArrayVision6.0),随后进行数据分析和处理。 /DL 1(6统计学分析 Imagequant5.0,ArrayVision6.0进行基因芯片数据处理。检验水准α取0.05。 STRONG2结果/STRONG 我们取14d5个不同裸鼠体内异位病灶与已经保存的同批种植前分泌期人子宫腺肌症子宫内膜一同进行CSC-GE-80基因芯片种植前后的筛查如表1。 芯片结果中，按照我们的数据筛选标准有1061个基因发生了显著性变化(上下调2倍以上)，其中上调表达的基因有410个，下调表达的基因有651个。 在筛选出来的有显著性表达差异的基因中，按照主要的功能分类可以发现明显的特征首先是细胞骨架蛋白结构基因的变化，初步可以判断组织异位 *优秀文档,值得下载* 后细胞分化更明显，体现为平滑肌细胞相关的基因表达明显上调;其次是与细胞外基质相关的基因表达的变化，同时还包括生长因子和细胞因子及其受体的变化，包括生长因子受体结合蛋白10 boundprotein10)与丁酸盐反应因子1(growthfactorreceptor- (butyrateresponsefactor1)中表皮生长因子(EGF-responsefactor1)，下调明显是胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-likegrowthfactorbindingprotein7)。 STRONG3讨论/STRONG 3(1基因芯片在子宫内膜异位症中应用的现状与利弊 子宫内膜组织的异位种植原因探讨一直是人们所感兴趣的方向之一，既往的研究由于条件限制只能作单个基因的个别筛查，尚未有就内膜种植的多基因改变作方向性探讨。上世纪90年代，由美国Affymetrix公司的Lipshutz和Fodor[3]提出并开始使用基因芯片技术研究，至今，基因芯片技术在医学各个领域中的应用均已取得巨大突破。基因芯片(genechip)又称DNA芯片(DNACHIP)、DNA阵列(DNAarrays)、寡核苷酸微芯片(oligonucleotidemicro-chip)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以pc计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检 *优秀文档,值得下载* 测，从而迅速得出所要的信息。达到对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知DNA分子。用于临床疾病的诊断、遗传相关基因的定位以及新基因的寻找。2002年Eyster[4]曾就子宫内膜异位症患者在位与异位内膜组织的基因变化作4133个基因检测，发现在3例子宫内膜异位症患者的在位与异位内膜之间有8个基因的差异显示，这8个基因分别β-actin, 2actin,vimentin,ribosomalMHC,Complement，L轻链，Iggermline，α- 除β-actin,α-2actin外，其余6个基因均是内膜的特异性基因。至今，已经有先后多个实验进行针对在位与异位人子宫内膜的基因差异进行比较[5-7]。但目前的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 缺陷在于只是限于人体内种植后多年的异位内膜检测，尚不能对其早期种植过程中参与基因进行筛查。 3(2基因芯片筛查人子宫内膜早期异位种植的血管生长基因 我们使用的CSC-GE-80人类表达谱基因芯片包括肿瘤、信号传导、免疫与代谢相关等几个方面共有或特异性表达的基因共8000个，其中包括VEGF-A、B、C、D、E与胎盘生长因子(Placentagrowthfactor，PIGF)，采用密度大于5E+08，比值大于2或小于0.5作标准。由于本组数据密度值在5E+08甚至更小，由此设定有意义值在上下2倍或更高。同时选用在裸鼠种植的14d的成模人子宫内膜异位病灶作为研究对象，本次实验结果中我们集中关注种植后异位内膜组织中细胞外基质基因变化，包括生长因子和细胞因子及其受体的变化。前期实验表明无论人体还是裸鼠体内种植的人子宫内膜中其血管生成均呈持续升高而无在位内膜的周期性变化，并 *优秀文档,值得下载* 与VEGF有关[1-2]。而早期内膜种植过程中还有哪些相关血管生长因子在发生改变值得我们关注。芯片结果表明，在14d种植的异位人子宫内膜中Grb10显著升高。Grb10参与内皮细胞和具有KDR受体的细胞在VEGF作用后的酪氨酸磷酸化，为SH2引发的信号通道过程所必需，与胰岛素受体无关，可能通过VEGF上调Grb10水平接着使KDR受体增加，从而参与VEGF作用增强[8,9]。芯片VEGF含量未能测出明显升高(仅升高1.8倍未达到明显差异)，可能与分泌期子宫腺肌症内膜VEGF的含量已经明显高于正常子宫内膜，异位后未能持续升高有关，因此不能排除其通过Grb10上调内皮细胞的KDR受体，从而促进血管生长，因此不能否认VEGF在内膜异位种植过程中的作用。有关在早期子宫内膜种植时VEGF升高的时间目前也有争议，KressinP[10]应用正常妇女的子宫内膜放置在鸡绒毛膜上作体外EMs模型观察，发现在体外培养中24h明显升高10倍，并且持续72h。而Nisolle[11]则发现在将正常妇女的子宫内膜种植在裸鼠腹腔后，于种植第1、3、5d并未见到腺上皮内VEGF蛋白含量增多，至第5d才在基质发现其内含量升高。因此在异位种植的内膜中VEGF的升高的时间以及除缺氧诱导与雌激素调控外是否存在Grb10的作用机制仍需进一步实验证实。 STRONG【参考文献】/STRONG 王宁宁，姚书忠，庄广伦，等.裸鼠人子宫内膜异位症模型建立与病灶血管形成相关检测[J].中山大学学报:医学科学版，2004，25(3增刊):43-45. 王宁宁，庄广伦，黄建昭，等.卵巢子宫内膜异位症微血管密度及血管内 *优秀文档,值得下载* 皮生长因子表达[J].中山大学学报:医学科学版，2004，25(3):264-267. 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