【doc】神经肽P物质促进增生性瘢痕中肥大细胞组胺释放的定量检测

【doc】神经肽P物质促进增生性瘢痕中肥大细胞组胺释放的定量检测 神经肽P物质促进增生性瘢痕中肥大细胞 组胺释放的定量检测 中国临床康复第70卷舅4朋2006—01—25出版 Chinese.IournalofClinicalRehabilitation,January252006Vo1.10No.4 神经肽P物质促进增生性瘢痕中肥大细胞组胺释放的定量检测? 陈亮,流沙,丛林,李世荣 113 ? 基础研究? 解放军第三军医大学西南医院,整形外科中r心,内分泌科,重庆市 4O0038 陈亮?,男,l978年生,吉林省吉林市人,汉族,解放军第三军医大学 在读博士,主治医师,主要从事瘢痕病的诊治研究: chenliang78309@tom.tom 中图分类号:R6l9.6文献标识码:A文章编号:l67l一5926(2006)04—01l3—03 收稿日期:2005—08一o9修回日期:2005—12—26{05—99—6—5120/N?Q) Quantitativeexaminationofthereleaseofhistamineinmas. tocytesofhyperplasticscarduetosubstanceP Chenkiang,LiuSha,Congun,LishI-tong, CenterofPlasticSurgery,ZDepanmentofEndocrinology,SouthwestHospi— ta1.Thjr(1MilitaryMedicalUniversityofChinesePLA.Chongqing 4O0038.China Che13kiang-~-,Studyingfordoctorate,Attendingphysieian,CenterofHas— ticSurgery.SouthwestHospital,ThrdMilitaryMedicalUniversityofChi— nesePLA.Chongqing400038.Chinaehenllang1978309@tom.tom Received:2005—08—09Acce?pted:2005一l2—26 Abstract A?:NeuropeptidesubstancePcanacceleratethereleaseofmastocyte histamineinhumanhyperplasticseal".Toanalyzequantitativelytheeffect ofconcentrationofneuropeptidesubstancePinthisprocessandexplore theinteractionandeffectconditionsbetweensubstancePandmastocytes inhyperplastiescar. METH0DS:TheexperimentwasconductedfromJanuarytoOctoberin 2005atcentrallaboratory.SouthwestHospita1.ThirdMilitaryMedica1Uni— versityofChinesePLA.Hyperplastiescartissuesofburnpatientsfrom PlasticSurgery.SouthwestHospitalwerecutinto0.5minx0.5mmx0.5am tolminXlmaxlmmsize.Patientsortheirguardianagreedtotakepart intheexperiment.Thetissueblockwasputinto0.5mLDMEMliquor with10.6,5xl0'6,l0,,5xl0andl0mol/LsubstanceP.0mol/Lsub— stancePwasconsideredascontrolgroup.Atier30minutes.supernatant wasextractedassamplehistamine,andthentissueblockswereaddedwith D.5mLsoftwater.heated,andboiledfor20minutesfdesti'oyingthecells andsetfreehistamine).Aftershakingevenly,centrifuged(1500gfor10 minutes).Supernatantliquorwassucked.thatwas.thelefloverhistamine. Thereleaserateofhistamineofmastocytesinsupernatantwasdetected withfluorescentmethod『releaserateofhistamine=sampkhistamine/(sam— piehistamine+lefloverhistamine1x10o%1. RESULTS:ThereleaserateofhistamineinthesubstanceP10-6,5×104, l0,5×l0,10mol/Lgroupwashighermarkedlythanthatinthecontrol group【(49.78~3.56)%,(54.56~1.90)%,(57.12?1.49)%,(60.49~1.41)%, (63.16:~2.61)%,(43.96~3.18)%,P<0.011.Thehighertheconcentration ofsubstanceP,thehigherthereleaserateofhistaminewas(P<0.0lor 0.05. CoNCLUSION:Inhyperplastiescar.thedose—dependentsubstanceP canstimulatethereleaseofhistamineinmastocytes.WhenthesubstanceP reachesl0'6mol/L.therearealatofsignificantreleasesofhistaminein mastocytes.WiththeincreaseoftheconcentrationofsubstanceP.there— leaserateofhistamineelevates.also. ChenLtiuCangLkiSRQuantitativeexaminoilanafthereleaseafhislaminein mastacylesafhyperplasticscarduetasubstancePZhongguoLinchttangKangfu 200610(4):113—5[ChinaJ 陈亮,流沙,丛林,李世荣神经肽P物质促进增生性瘢痕中肥大细胞组胺释放的 定量检测UJ_中国临床康复,2006,10(4):113—51wwwzglckfcoml 摘要 目的:神经肽P物质可以促进人增生性瘢痕中肥大细胞组胺的释放,定 量分析在此过程中神经肽P物质浓度因素的作用,探讨增生性瘢痕中 神经肽P物质与肥大细胞的相互作用及{=E用条件. 方法:实验于2005—01/10在解放军第三军医大学西南医院中心实验室 进行.将取自于西南医院整形美容外科烧伤患者的增生性瘢痕活体组 织块切下后立即处理(患者或监护人同意),修剪成0.5mmxO.5mm ×0.5mm,lmmxlmmxlmm大小,将组织块放入05mL含l0.6,5×l0.6, l0,5×l0,10mol/L神经肽P物质的DMEM液中,以0mol/L神经肽 P物质为对照组.组织块作用30min后提取上清液,为样品组胺;提取 上清液后的组织块分别加入去离子水0.5mL,加热煮沸(破坏细胞,释 出组胺)20min,摇匀后离心(1500g,10min),吸出上清液,为剩余组 胺.荧光法测定作用后上清液中肥大细胞的组胺释放率【组胺释放率 = 样品组胺/(样品组胺+剩余组胺)x100%1. 结果:神经肽P物质l,5xl04,lO-S,5xl0-5,l0一mol/L组组胺释放率显 着高于对照组【(49.78~3.56)%,(54.56~1.90)%,(57.12?1.49)%,(6o.49 ?1.41)%,(63.16~2.61)%,(43.96~318)%,P<0.011,且神经肽P物质浓 度越高,组胺释放率越高(P<0.01或0.05). 结论:在增生性瘢痕中,神经肽P物质以剂量依赖方式刺激肥大细胞组 胺的释放,当神经肽P物质达到10mol/L时即有肥大细胞组胺的显 着释放,随神经肽P物质浓度提高,组胺释放率升高. 主题词:瘢痕;P物质;肥大细胞;组胺释放 0引言 增生性瘢痕不仅会严重破坏患者容貌,导致全身 各处功能障碍,其引起的疼痛,瘙痒和感觉异常也同样 给患者造成巨大的痛苦.皮肤的瘙痒和炎症反应与肥 大细胞脱颗粒和神经肽P物质神经纤维密切相关,在 增生性瘢痕组织中肥大细胞的数目和神经肽P物质 含量均高于正常皮肤.神经肽P物质促使肥大细胞脱 颗粒释放组胺,此效应已先后在小鼠,大鼠和人的正常 皮肤肥大细胞上得到证实,但人增生性瘢痕中神经肽 P物质与肥大细胞的相互作用仍属空白.本实验定量 分析神经肽P物质对人增生性瘢痕中肥大细胞组织 胺释放的影响,探讨增生性瘢痕中二者的相互作用及 作用条件. 1材料和方法 设计:非随机对照的实验. 单位:解放军第三军医大学西南医院整形外科. 材料:实验于20o5—01/10在解放军第三军医大 学西南医院中心实验室进行.胎牛血清:美国Hyclone 公司;神经肽P物质:美国Sigma公司.增生性瘢痕标 本8例,均取自西南医院整形美容外科烫伤或烧伤患 者,因瘢痕孪缩畸形需行手术患者.取材时限:烫伤或 烧伤后7—12个月.其中男4例,女4例,年龄4一ll 岁,平均6.7岁.术前征得患者及监护人同意. 设计,实施,评估者:设计为第一作者,实验干预为 全部作者. 方法:新鲜切除的增生性瘢痕组织标本,用生理盐 水清洗3次去除血污,用眼科剪去除皮下脂肪后取 7g标本,生理盐水冲洗后,放置于有DMEM(含10g/L 114 ISSN1671—5926CN21—1470/R神经肽P物质促进增生性j虽痕中肥大细胞组胺 释放的 . z~comkf23385083@sina.com卧晃,寺'是量釜测.,…'…一………… 抗菌液)溶液的培养皿中,将其修剪成0.5mmx0.5mm. x0.5mm,1mmx1mmx1mm大小的组织块,Hanks液 漂洗3次,各取湿重0.4g组织块分装于EP管中,等 待加液.以上步骤需在4h内完成. 用DMEM液配制不同神经肽P物质浓度溶液,分 别为10.6,5x10.6,10,5x10,10.4mol/L神经肽P物质 及对照组0mol/L神经肽P物质各0.5mE,即DMEM液 0.5mL,分别加入组织块,作用30min. 肥大细胞组胺释放的提取及测定llI:分别提取上 清液,为样品组胺,是不同浓度条件下神经肽P物质 对肥大细胞组胺释放的影响.提取上清液后的组织块 分别加入去离子水0.5mL,加热煮沸(破坏细胞,释出 组胺)20min,摇匀后离心(1500g,10min),吸出上清 液,贮存于一70cc冰箱直至组胺分析,此为组织块中剩 余的组胺.用F.2500型荧光分光光度计,在激发波 360nm,荧光波450nm下测定荧光强度[21. 组胺释放率的计算:组胺释放率=样品组胺/(样 品组胺+剩余组胺)×100% 主要观察指标:不同神经肽P物质作用浓度下组 胺释放率. 统计学分析:结果均用X+S来表示,采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析,组问比较用单因素方差 分析,两两比较用t检验.P<0.05为差异显着,P <0.O1为差异非常显着,P>0.05为差异不显着.统计 学处理由解放军第三军医大学统计学教研室完成. 2结果 2.1不同浓度的神经肽P物质刺激肥大细胞组胺释 放率比较用不同浓度的神经肽P物质刺激肥大细 胞一定时间,其组胺释放率均明显高于对照组,各组 间有显着差异,见表1.对照组为增生性瘢痕中肥大细 胞的自发性组胺释放率,样品组与对照组之差则为在 神经肽P物质作用下,组胺释放率的增加. 表1神经肽P物质浓度对增生性瘢痕中肥大细胞组胺放率的影响 (.n=8.%) 组别组胺释放率 对照组 神经肽P物质10mol/L组 神经肽P物质5×10mol/L组 神经肽P物质10mol/L组 10mol/L组 神经肽P物质5× 神经肽P物质10.mol/L组 与对照组相比,<0.01;与神经肽P物质10mol/1.组相比,<0.Ol;与神经 肽P物质5×l0mol/L组相比,'l,J<0.05;与神经肽P物质10mol/L组相比,P <0.0l;与神经肽P物质5×l0mol/l组相比,'l,J<0.05 2.2神经肽P物质浓度增加后肥大细胞组胺释放率 的变化趋势见图1.图1提示肥大细胞组胺释放率 随神经肽P物质浓度增加而升高,表明肥大细胞组胺 释放有神经肽P物质浓度依赖性. 3讨论 肥大细胞广泛存在于人类皮肤中,是皮肤速发 型过敏反应,宿主防御性免疫反应,炎症反应过程及 正常生理过程中的主要效应细胞.在经过一些免疫 性或非免疫性物质的刺激后,肥大细胞被激活并释 放一系列预先合成的或受激活后立即合成的介质, 包括组胺,蛋白酶(包括类胰蛋白酶,食糜酶等)以及 一 些细胞因子如肿瘤坏死因子和白细胞介素等,以 参与皮肤的免疫和炎症反应,它参与I型变态反应 的发生,并和许多皮肤性疾病如银屑病,特应性皮 炎,白癜风等疾病的病理过程密切相关.皮肤内的神 经多肽如神经肽P物质,血管活性肠肽和生长激素 释放激素能导致肥大细胞脱颗粒释放递质,如引起 组胺的快速释放;并能直接介导肥大细胞引起一系 列组织反应.神经肽P物质是除经典神经递质(乙酰 胆碱,单胺类,氨基酸)外的第三类神经活性物质,它 不是在神经末梢合成,而是在胞体的核糖体上合成 无活性的大分子前体蛋白,合成后被转送至内质网, 高尔基复合体和分泌颗粒或囊泡,装入囊泡后经轴 浆转送到神经末梢,受刺激时即可释放.神经冲动传 导时引起离子通道开放,外钙内流,促使囊泡释放神 经肽P物质.小的初级感觉神经元含有神经肽P物 质,高钾等可引起初级感觉神经元的Ca依赖性神经 肽P物质的释放,神经末梢释放后,不能被重新吸 收,其作用的终止主要依靠酶的降解和释放.神经肽 与肥大细胞的相互作用近年才引起国内外学者的关 注,特别是神经肽P物质作为首次发现的神经肽,可 显着促肥大细胞脱颗粒.众多的实验研究神经肽P 物质与正常皮肤及病理性皮肤中肥大细胞的相互作 用,分析神经肽P物质与肥大细胞的作用条件,并推 测二者的作用机制以指导临床工作.已经证实神经 肽P物质与肥大细胞的相互作用,与许多皮肤性疾 病相关,外用神经肽P物质拮抗剂可治疗一些与肥 大细胞相关的皮肤病如银屑病,特应性皮炎,寒冷性 荨麻疹等I.但在国内外研究中,人增生性瘢痕中神 经肽P物质与肥大细胞的相互作用仍属空白. 一 褂 挺 进 整 神经肽P物质浓度(mot/L1 图1神经肽P物质浓度对增生性瘢痕肥大细胞组胺释放率的影响 本文结果表明,人增生性瘢痕中肥大细胞脱颗粒 组胺释放存在神经肽P物质剂量依赖性,即当神经肽P 物质达到一定浓度时,肥大细胞组胺释放率随神经肽P 1J1Ji2 卯?? ISSN1671-5926CN21—1470/Rw帮出中国l临床康复2006年1月25日第10卷第 4期 物质浓度增加而升高.这与以往在小鼠,大鼠皮肤及黏 膜和人的正常皮肤肥大细胞实验得到的结论相同141,但 同等神经肽P物质浓度的作用效果有显着的差异.在 增生性瘢痕中神经肽P物质作用效果强于人的正常皮 肤.Weidner等151用微透析法研究人皮肤中神经肽P物 质结果证明:神经肽P物质超过10mol/L有蛋白溢 出,神经肽P物质10墙,10mol/L使蛋白溢出且无组织 胺的释放,只有当神经肽P物质达到10mol/L才能 致使肥大细胞组胺显着释放;本文结果显示当神经肽 P物质达到10mol/L时即有肥大细胞组胺的显着释 放,与其作用条件相差10倍.Ebertz等llI研究人皮肤皮 片结果肥大细胞自发性组胺释放率仅为10.3%,神经 肽P物质浓度10mol/L到5x10.4mol/L,组胺释放 率增加1.3%到25.1%,本研究结果增生性瘢痕中肥 大细胞自发性组胺释放率为43.96%,神经肽P物质 浓度10mol/L到10.4mol/L,组胺释放率即增加 5.8%到19.2%.可见增生性瘢痕与正常皮肤比较,肥 大细胞更易脱颗粒,并且神经肽P物质与肥大细胞 作用更显着. I~mbecktI提出轴突反应模式和张保真l提出的轴 突反射,接力联动模型,他们的基本环节是当皮肤某 一 点受刺激时,受刺激局部肥大细胞释放组胺,舒血 管缓激肽及前列腺素等使局部的神经末梢兴奋,经轴 突反射使另一神经侧支神经肽P物质释放,与之相连 的肥大细胞脱颗粒释放活性物质引起与它相连的另 一 通过轴突反射重复上述过程,再引 神经末梢兴奋, 起与这一侧支相邻的肥大细胞释放生物活性物质.增 生性瘢痕组织中肥大细胞的数目高于正常皮肤,丛林 等II研究显示,神经肽P物质在增生性瘢痕组织中的 分布比正常皮肤及非增生性瘢痕组织中明显增多.由 上可见,增生性瘢痕中肥大细胞和神经肽P物质数量 的增多能够使轴突反射增强扩散,促进组胺释放,可 能是瘢痕中神经肽P物质对肥大细胞作用强于正常 皮肤的原因或原因之一. 但在正常血浆中神经肽P物质浓度约为10~10, 在神经肽P物质对大鼠腹膜肥大细胞作用的研究中, 神经肽P物质引起腹膜肥大细胞组胺释放的浓度更 低,这可能是因为体外瘢痕组织块有一定的厚度,神 经肽P物质的渗透作用需一定的时问,并且渗透和作 用的速度与神经肽P物质浓度密不可分.在生理情况 115 下,含神经肽P物质的神经纤维与肥大细胞连接作用 时,神经肽P物质释放的真实浓度有待于进一步的研 究.但可以预想少了组织障碍,其所需浓度将更低,作 用会更快. 本实验对活体组织直接进行研究具有排除外界因 素干扰,保持组织活性,能充分控制实验环境等优点. 但由于实验技术的限制,不能避免组织块所产生的屏 障作用,使作用因素需通过渗透到达作用细胞,结果与 体内研究会有所出入,是此方法的缺点.但还是可以正 确地体现作用效果. 瘢痕增生过程实质是胶原大量合成的过程,组胺 有促进成纤维细胞合成胶原纤维的作用,神经肽P物 质是促使成纤维细胞有丝分裂的重要因素之一,并且 组胺和神经肽P物质是引起瘙痒潮红的重要介质.含 神经肽P物质的神经纤维与肥大细胞直接联接,神经 肽P物质可诱导肥大细胞脱颗粒释放活性物质,引起 免疫反应和瘙痒炎症,加重增生性瘢痕患者痛苦.有研 究表明应用神经肽P物质拮抗剂可治疗与神经肽P 物质和肥大细胞相关的皮肤性疾病o】,起决定性作用 的是NK1受体拮抗剂Il".充分研究神经肽P物质与肥 大细胞的相互作用和作用机制,有利于揭示许多皮肤 性疾病,包括增生性瘢痕的发病机制,应用神经肽P 物质及神经肽P物质受体拮抗剂阻断二者的作用,有 望成为治疗增生性瘢痕的新方法,在临床有广阔的应 用前景. 4参考文献 1EbeazJM,HirshmanCA,KettelkampNS,eto1.SubstanceP-inducedhistamine re]easeinhllmancutaneousmas]cells.Jl~estDermatol1987;88(6):682—5 2向军俭,陈华粹.组胺的荧光测定法研究【J1l中国医学科学院,1981.4(3): 183-6 3陈亮+李世荣,丛林.皮肤中的肥大细胞与神经肽P物质【J1l中国l艋床康复, 2004,8(2):334—5 4HakansonR.1eanderS.AmderssonRG,eto1SubstancePantagonistsrelease histaminefromperitonealmastcellsMctaPhysiolScand1983;117:319—20 5WeidnerC,KledeM.RukwiedR,etol,Acuteeffects0fsubstancePandcalci. toningene-relatedpeptideinhumanskin—amicrodialysisstudy.JInvestDer- matol2000;115f6,:1015—20 6LembeckFMediators0fvasodilatationintheskin.肼JDermatol1983;1O9 supplment25:1—7 7张保真.关于经络线路皮肤反应和循经感染形态生理学问题的讨论一轴索反 射接力联动一说的建议【J1.西安医学院,1984,5(1):90—2 8丛林,李世荣神经肽P物质与HS[J].中同临床康复,2002,6(4):476—7 9ErinN.Ers0vY.ErcanF,etO1.NK一1antagonistCP99994inhibitsstress-in- ducedmastcelldegranulationinrats.ClinExpDermatol2004;29f6,:644—8 10MassaadCA.SafiehGB.PooleS.eto1.Involvement0fSUhstanceP.CGRPand histamineinthehyperalgesiaandcytokineupregulationinducedbyintraplan- tarinjection0fcapsaiclninrats.JNeuroimmunol2004;153(1—21:171—82 11DAndreaMR.SabanMR.GerardNP.etolLackofneurokinin一1receptorex- pressionaffectstissuemastcellnumbersbutnottheirspatialrelationshipwith nervesAmJysiolRegulIntegrCompPhysiol2005;288(2):491—50o