光合细菌菌种的分离、富集培养、纯化和菌种鉴定及净化水质的研究

0 ¨ t 一 光合细菌菌种的分离、富集培养、纯化和菌种鉴定及净化水质的研究 ， 山东大学微生物技术国家重点实验室(济南，250100) 施安辉 ⋯ ； 泰宝来利来生物_ 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 腰份有限公司(泰毒，271000) 李桂杰 徐海燕 吕明霞 崔景丽 李军训 々 ⋯ 一 。 ’ ：。 。 。。 光合细菌一般生长在湖底土、河流底土、海底土和 水田等地，笔者选择有机物污染较为严重的东平湖畔 的河流底 土，经富集培养 、纯化 ，最后经菌种鉴定获得 了沼泽红假单胞菌、胶质红假单胞菌、球形红假单胞菌 和绿色红假单胞菌4株净化养鱼池水质较为理想的菌 株 。 1 试验材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1．1 富集用培养基 NH C1 1克 ，M l2 0．2克 ，酵母膏 0．1克 ，K2HPO4 0．5克，NaC1 2克，水 900毫升，灭菌。 经过滤灭菌的 NaHCO3 5克／50毫升水； 50毫升经过滤灭菌的酒精、戌醇或 4％的丙氨 酸，用过滤灭菌的 0．1摩／升 H3P0 调 pH值至 7．0。 1．2 分 离用培养基 NH C1 1克 ，MgC12 0．2克 ，酵母膏 2克 ，K：HPO 0．5克，NaC1 2克 ，琼脂 20克，水 900毫升。 配法同富集培养基，但加入 NaHCOa的量为 2克／ 50毫升，调 pH值到 7．0后 ，加入 Na S·9H：0 1．0克 50毫升水，1千克／厘米 灭菌 15分钟，以便降低培养 基的氧化还原值。酒精或戌醇或 4％丙氨酸的用量同 富集培养基 。 1．3 光合细茵的富集和分 离 1．3．1 光合细菌富集 富集和分离不同类型的光合 细菌所用培养方法不完全相同。首先，取 50 100克生 长光合细菌的土壤，灭菌后装入玻璃量筒内，再加入采 集的样品水 。 根据欲要分离的不同光合细菌选用上述相同的培 养基 100～200毫升 ，并与土壤搅拌均匀 ，然后加流体 石蜡隔绝空气，造成厌氧的环境。 在 25—35℃温度下，用 5 000 10 000勒克斯的 光照强度进行光照培养 2—8周(生活在海水中的菌株 生长较缓慢 ，需要培养 1—3个月 )。这时 ，光合细菌在 玻璃避上呈菌落状 ，布满全部 ，呈红色或绿色。然后 ， 用吸管在细菌生长良好的泥土层吸取泥水样和细菌， 移植至约 50毫升的试剂瓶中，再加入上述培养液 ，继 续培养。用试剂瓶培养时，先装人泥状溶液，再把各种 培养液装满瓶子，然后塞紧塞子，防止培养液溢出，保 持厌氧条件。试验瓶的橡皮塞用胶布封好，以防止长 时间培养液蒸发 。 在这个试剂瓶中不断进行富集培养，并将生长良 好的光合细菌悬浮液适 当稀释 ，在厌氧条件下继续进 行光照培养 。 1．3．2 光合细菌 的分离 1．3．2．1 用碱性没食子酸法进行厌氧平板培养 ，在 2 000—5 000勒克斯光照条件下进行。具体操 ：把干 燥器内的空气用真空泵减压到 1／3，再通人无菌的氢 气，进行气体置换造成厌氧条件。然后用碱性没食子 酸把残余的氧气除去。 1 3．2．2 把悬液和琼脂培养基混匀后装入已灭菌的 细玻璃管中凝固，把玻璃管 口两端用橡皮塞塞紧后进 行光照培养。培养结束后，在无菌条件下推出凝固琼 脂，或打碎玻璃管，但要注意别污染杂菌。 1．3．3 光合细菌 的纯化 把以上分离到的不 同形态 的菌株 ，进行反复分离纯化，直到在显微镜下观察菌体 形态基本一致 ，纯化工作才结束。菌株做鉴定备用。 1．4 光合细菌的菌种鉴定 以 《简明第八版伯杰细菌鉴定》⋯ 为主要鉴定手 册同时，参照《细菌学概论》⋯，进行菌种鉴定。 1．5 净化水质技术的研究 按污水体积 10 x 10 的量加人人工培养的光合 细菌培养液 (30,fL／毫升以上)。每隔 10天投放 1次， 共投放4次，即40天为一个处理周期。 1．6 测 定 方法 亚硝酸盐的测定方法一 ．萘胺比色法 · 锄 · 《内陆水产>2o02年第 1O期 维普资讯 http://www.cqvip.com 氨氮 的测定方法一纳氏比色法 溶解氧的测定方法一碘量法或叠氮化钠修正法 COD的测定一酸性高锰酸钾法 2 结果和讨论 2．1 净化 水质的光合细菌菌株的富集与分离 2．1．1 净化水质的光合细菌菌株的富集 采用富集 培养基，在28—30cI=恒温、光照强度 5 000—10 000勒 克斯、厌氧的条件下 ，使光合细菌增殖富集 2—8周，直 到培养液完全呈红色 、深红色、橙色或绿色为止。 2．1．2 净化水质 的光合细菌菌株的分 离与纯化 采 用分离培养基 ，把生长 良好 的富集液适当稀释 ，在厌 氧的光照条件下，进行平板分离培养，反复进行纯化， 直至形态一致为止。 2．2 菌种鉴定 对已分离纯化的26株形态 、色泽不同的光合细 菌，从形态特征、培养特征及主要生理生化特征的初 步 研 究 ，其 中 17株 被 确 定 为 红 假 单 胞 菌 属 (Rhodopseudomonas)， 6 株 属 于 红 螺 菌 属 (RhodospiriIIum)，其它 3株无法确定。在 17株红假单 胞菌属中 ，有 4株属 于沼泽红假单胞菌 (兄 PaIustris)， 有 5株属于胶质红假单胞菌 (R．geIatinosa)，有 6株属 于球形红假单胞菌 (R．sphaeroides)，有2株属于绿色 红假单胞菌(R．uiridi．~)。 2．3 实验条件下，4种红假单胞茵净化水质能力 在实验条件下，采用 1 000毫升大三角瓶为处理 容器，装量为 1 000毫升污水，污水来源于泰安污水处 理厂，接种量分别为 5×10-6 10×10-6 15×10-6 20×10 (30亿以上／毫升)，10天后测定，实验结果 如下。 2．3．1 沼泽红假单胞菌净化水质能力见表 1 表 1 沼泽红假单胞菌净化水质 的效果 2．3．2 绿色红假单胞菌净化水质的能力见表 2 表 2 绿色红假单胞菌净化水质的效果 2．3．3 胶质红假单胞菌净化水质的能力见表3 表 3 胶质红假单胞菌净化水质的效果 2．3．4 球形红假单胞菌净化水质的能力见表 4 表 4 球形红假单胞菌净化水质的效果 总之 ，从以上 4种菌种单一的培养液净化水质的 效果来看，加人量以 10×10“为最经济，且效果好；加 入量 15×10 和 20×10 虽 然 效果 更好 ，但 成本 高。从单一菌株净化水质的效果看，沼泽红假单胞菌效 果最好，其次为胶质红、球形红和绿色红假单胞菌。 2．3．5 双菌种或多菌种净化水质能力 2．3．5．1 双菌种净化水质的效果见表 5 2．3．5．2 多菌种净化水质的效果见表 6 以上试验结果表明，在光合细菌菌液加人量相同 的条件下 (均 10×10 )，4个菌种的净化效果优于 3 个菌种 ，3个菌种的效果又优于双菌种 ，而双菌种又优 于单菌种 。 2．4 中试规模 4种红假单胞茵净化水质能力的研究 在以上实验条件下，经单一菌种、双菌种、3菌种 和 4菌种等组份的实验结果表明，4菌种 (1／4沼泽红 假单胞菌 +1／4胶质红假单胞菌 +1／4球形红假单胞 菌 +1／4绿色红假单胞菌)净化水质的效果比3菌种 (1／3沼泽红假单胞菌 +1／3球形红假单胞菌)的好， 而 3菌种的又比双菌种的任何一个组份好 (50％沼泽 红假单胞菌 +50％胶质红假单胞菌、50％沼泽红假单 胞菌 +50％球形红假单胞菌 、50％沼泽红假单胞菌 + 50％绿色红假单甩菌 )。所 以，中试规模的试验采用 4 菌种混合的工艺技术。 中试水池规模为 16米 。，试验时间从 2001年 8月 13日至9月22日(40天)，鱼种为鲤鱼，每池放 40尾 长 3—5厘米 。 采用 4个菌种的混合菌液 ，加人少量每次为 10× 10一，每 l0天加 1次，共加 4次，每 5天测 1次水质， 试验周期为 40天。对照池不加光合细菌液。结果见表 (~~ 7RU)2oo2年第 10期 ·4l- 维普资讯 http://www.cqvip.com 7。 以上试验结果表明 ，沼泽红假单胞 菌、胶质红假单胞菌、球形红假单胞菌 和绿色红假 单胞菌 4种 混合菌液净化 鲤鱼养鱼池效果明显。氨氮含量对照池 开始为 1．40毫克／升，到试验结束 (40 天后)升至 2．90毫克／升，而试验池开 始为 1．09毫克 ／升 ，至 15天后 降至 O．21毫克 ／升 ，至 2O天后 氨氮含量未 检出。亚硝酸盐的含量 ，对照池开始为 0．15毫 克 ／升 ，至试 验 20天后 升至 0．75毫克／升 ，而试验池至 20天后氨 氮含量未检 出。COD对照池开始为 12．35毫克／升，试验结束 (40天后)升 至 35．60毫 克 ／升 ，而试 验池 开始 为 27．10毫克／升，试验结束 (40天后)降 至 18．9O毫克／升 。同时试验过程观察 ， 对照池的鲤鱼因缺氧而浮头 ，有 9尾鲤 鱼得烂鳃病 ，死亡 i尾 ，患病率为 22．5％，死亡率为 2．5％，而试验组没 发现烂鳃病和死亡。 表 5 双菌种净化水质效果 组份 (毫C克O ／ D 升)黼 ) ) 组份 (毫C克O ／ D 升) 弄) ) 表 7 4种光合细菌中试规模净化水质效果 总之，利用光合细菌净化养鱼水质 — — 的技术是成功 的 ，特别是利用 多种光合细菌效果更 4 佳 。 主要参考文献 1 郑士 民，颜望明 ，钱新 民 ．自养微生物 IM】．北京 ：科学 出版社，1988．80 107 o 2 刘如林，刁虎欣，梁风来 ．光合细菌及其应用IM】．北京： 中国农业出版社 ，1991．3 13，60 70，72 92，155 188 3 霍尔特主编 ．刘复今，等编译 ．简明第八版伯杰鉴定手 册 IM】．济南：山东大学出版社，1988．21 24 普雷沃著 ．刘 自容 ，等译 ．细菌学概论 IM】．济南 ：山东 科技出版社，1981，194 197 王应铨 ，徐福康 ．光合细菌培养技术探讨 IM1．北京：应 用微生物 ，1983．6：1 5 朱章玉，等 ．用光合细菌处理高浓度有机废水的研究 I J】． 上海交通大学学报 ，1985，19(6)：22 31 刘如林 ．光合细菌在高浓度有机废水处理中的应用 I J】． 环境科学，1991，12(2)：63 68 (发稿编辑 王冬武) 欢 迎 订 阅 2003年 中 国海 洋 报 《水 产 周 刊 》 ‘水产周刊》是《中国海洋报》主办的一张面向全国水产行业的专业性报纸。是 目前该行业发行量最大、覆盖面最广 的报刊媒介。以宣传水产业政策法规，传递市场信息，交流养殖、加工 、营销经验为宗 旨；以权威性、信息性 、服务性为办 报方针。<水产周刊》主要分布在水产业最为发达的地域 ，订 阅客户多为养殖户、经销商、水产技术推广人员及相关企事 业单位 ；其最大的优势是发行周期短 ，传达讯息及时快捷。《水产周刊》侧重于传递信息服务 ，塑造品牌形象 ，促进产品销 售 ，使企业能够更加迅速地 占领市场 。 目前设有 ：要闻版 、市场版 、技术版、企业版 。随着市场经济的不断发展 ，将陆续推出适应读者需要 的新版面 、新栏 目、新 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。 <水产周刊》为对开四版，每周五出版，随《中国海洋报》国内外公开发行 ，订《中国海洋报>即可每周见到《水产周刊》。 同办统 一 千U号 ：CN11—0171 邮发 代 号 ：1—149 国外 代号 ：13993 全 国各 地 邮局 均 可订 阅 ．全 年订 价 72．0O元 。破 季订 阅 。季价 18．00元 地址 ：北京复兴门外大街 1号 邮编 ：100860 电话 ：(010)68047744 传真 ：(010)68033233 广告经营许可证 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