RNA原位杂交实用技术

技术与方法 RNA 原位杂交实用技术 ① 徐云远　种　康 ②　许智宏　谭克辉 (中国科学院植物研究所　北京　100093) 摘要 　利用互补 RNA 为探针进行原位杂交是 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 组织或细胞内 RNA 分布的行之有效的方法 ,通过对 mRNA 分布的研究可以了解特定基因的表达情况。原位杂交技术过程较长 ,操作繁琐 ,从而在一些实验 中不能得到很好的使用 ,为此本文根据我们过去的实际操作经验对该技术中的一些使用技巧作简要的 介绍。 关键词 　原位杂交 ,基因表达 The Practical Technique of in situ Hybridization with RNA Probe XU Yun- Yuan 　CHONG Kang 　XU Zhi- Hong 　TAN Ke- Hui ( Institute of Botany , The Chinese Academy of Science , Beijing 100093) Abstract 　In situ hybridization with complement RNA probe is an effective method to detect the distribution of RNA in tissue or cell , by which the expression pattern of gene can consequently be revealed. As the complete process is longer and more complex than other molecular hybridization , the application of this method , however is limited in common laboratories. In order to make this technique be used widely in routine experiments , the practical skills were introduced based on past experience. Key words 　In situ hybridization , Expression of gene 随着越来越多的基因被克隆 ,探索这些基因的表达模式是研究其功能的重要环节之 一。利用 Northern 杂交可以说明特定基因在不同器官不同时期的表达情况 ,如果要在显 微或亚显微水平对一些基因的时空表达进行研究 ,Northern 杂交就显得无能为力。根据 核酸分子杂交的基本原理和免疫组织化学的成熟方法而发展的原位杂交技术 ( ISH , in situ hybridization) ( Gall and Pardue ,1969 ; John et al , 1969)为我们提供了行之有效的途径。 利用 RNA 作为探针 ,与组织内的 RNA 靶序列杂交 ,这样可以了解组织或细胞内 RNA 的分布和数量 ,而且与 DNA 探针相比 ,使用 RNA 探针有其独特的优点 : RNA : RNA 热稳 定 ,所以杂交反应结束后可以用高严谨条件洗涤降低背景 ;cRNA :RNA 酶稳定 ,杂交反应 结束后可以用 RNase 进行酶解除去游离的 RNA 探针 ,以降低背景 ;杂交效率高 ,根据 Cox 等 (1984)的计算 ,探针浓度在 2ng/μl～6ng/μl 时 ,RNA 探针的杂交百分比是 DNA 探针的 8 ① ② 通讯联系人。Author for correspondence. 作者简介 :徐云远 ,男 ,38 岁 ,副研究员。先后在兰州大学获学士、硕士、博士学位 ,现为中科院植物所博士后 ,目 前主要从事植物发育的分子生物学研究。 收稿日期 :2001205221 　　接受日期 :2001208210 　　 责任 安全质量包保责任状安全管理目标责任状8安全事故责任追究制幼儿园安全责任状占有损害赔偿请求权 编辑 :刘　晖中科院创新工程项目、国家“973”项目 ( G19990116) 、国家自然科学基金项目 (30170094) 和中国博士后科学基金项目资助。 植物学通报 　2002 , 19 (2) :234～238 Chinese Bulletin of Botany 倍。由于这些优点 ,RNA 探针越来越多地被用于基因表达模式研究。 图 1 　原位杂交流程示意图 Fig. 1 　Flow chart of in situ hybridization 2 期 徐云远等 : RNA 原位杂交实用技术 235　　 原位杂交技术基本上包括探针标记、组织固定、包埋、切片、粘片、脱蜡、蛋白酶消化、 乙酰化、预杂交、杂交、洗片、免疫检测、封片、照相这些步骤。我们曾使用该技术分析小麦 春化相关基因的表达模式 ,这里仅就应用过程中的一些细节和经验作一介绍 ,供同行参 考。 1 　探针的选择 为提高探针的专一性 ,用作转录 RNA 探针的 DNA 片段应与靶序列以外的核酸序列 无同源性 ,所以在转录之前就应考虑所选序列的特点。 为使杂交时探针能顺利到达靶序列附近 ,RNA 探针长度一般为 50～300 个核苷酸。 考虑到组织切片深层细胞要求探针有一定的通透性 , 表层组织可能存在靶序列的不足 , 所以我们选用长度为 100 和 500 个核苷酸的等摩尔混合物 ,这样既有一定的通透性又不 致于使 DIG的密度太低。如果所得 DIG标记 RNA 过长 ,可以温和碱水解的办法达到所需 要求 (Schwarzacher and Heslop- Harrison , 2000) 。考虑到对试剂盒中 DIG2dUTP 的充分利用 , 建议所选 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 长度尽可能接近探针的长度。 所以在合成探针时还要考虑的是模板长度。根据实验的需要 ,把将要用作 RNA 探针 的模板的 DNA 片段构建在适当的启动子中间 (例如 T7 和 T3 之间) ,在探针合成之前选用 不会产生 3’突出末端的限制性内切酶在 T7 (或 T3) 的下游一定长度处进行完全酶解以对 质粒进行线性化 ,纯化后用作 T7RNA 聚合酶 (或 T3RNA 聚合酶)的模板。 2 　探针的标记 对探针的标记主要是利用放射性同位素、酶分子、荧光素、半抗原或生物素 ,这些标记 物的检测已经十分完善 ,国内外的一些公司都有相应的试剂盒可用 ,也有很多专著和文献 介绍 (苏慧慈 ,1994 ; Speel et al , 1999) 。放射性同位素分辨率的限制和实验周期较长、需 要防护措施、标记物不稳定等缺陷 ,所以多用于检测固定于膜上的靶序列。用酶分子标记 的探针由于分子太大、穿透力差及对温度的要求 ,所以在组织原位杂交上也不实用。荧光 素标记检测方便 ,但存在荧光淬灭问题 ,杂交后的片子无法长久放置。 考虑以上因素 ,生物素和半抗原成为原位杂交中探针的首选标记物。用于探针标记 的半抗原多种多样 ,象修饰的嘌呤碱基、嘧啶碱基和地高辛 (Digoxingenin ,DIG) ,目前最常 用的是地高辛。生物素本身也是一种半抗原 ,但由于它可与抗生物素蛋白 (avidin) 或链亲 和素 (streptavidin)有更高的亲和力 ,所以在实际应用中多采用酶标亲和素。就地高辛和生 物素两种标记物而言 ,前者有更高的灵敏度 0. 4pg(～1. 0aM) (Rihn et al , 1995) ,所以我们 在实验中选用地高辛为标记物。 3 　探针浓度 在杂交时 ,杂交液中探针的浓度要作适当的调整 ,因为过高不但造成浪费 ,而且会使 背景很深 ,所以要对合成的探针进行浓度估算。估算方法是将浓度已知的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品系列和 系列稀释的探针溶液一起点在尼龙膜上 ,按照常规的检测膜表面半抗原的方法进行免疫 显色 ,通过颜色深浅比较浓度高低 (图 2) 。我们在实验中选用 0. 2 ng/μL 的浓度杂交过 夜 ,证实效果较好。 236　　 植物学通报 19 卷 4 　粘片 由于组织切片要在水溶液中进行数十小时的反复处理 ,因此一定要粘片牢固 ,同时要 严防 RNase 污染问题。我们曾用过两家公司的载玻片 (Sigma 和 Fisher Scientific) ,效果都 不错。这些载片均经过硅化处理 ,表面疏水性较强 ,这样在展片时不象亲水表面那样方 便。可以先将 0. 4 mL 左右的经 DEPC 处理的双蒸水加在载片上 ,把蜡带飘浮于水上 ,待 45 ℃展片后 ,拿起载片稍为冷却即可倾去多余的水。此时由于蜡带和载片的疏水性很有 可能在部分蜡带下保留一小水珠 ,如不除去 ,直接影响粘片效果 ,甚至在杂交前的预处理 过程中材料就脱落了。因此可以用细针尖在水珠处扎一小孔 ,用无菌的滤纸尖在此孔处 吸干水。另外为了粘片牢固 ,建议在 47 ℃左右的烤箱内或烫板上烤片 36～48 小时。粘 片后通过粗略镜检 ,选择组织结构完好、定位合适的片子进行后面的实验。 粘片时最好将不同处理或不同时期的切片放在同一载片上 ,这样会使杂交结果更有 可比性 ,而且也节省载片。 图 2 　探针半定量结果 . 标准样品为 DIG-actin RNA Fig. 2 　The semi- quantitative results of probe. DIG-actin RNA was used as standard 5 　杂交 在常规膜杂交中这一步十分简单 ,就是加 上杂交液 ,然而在原位杂交中应考虑以下几个 因素 : (1) 温度 ,一般原位杂交中推荐的杂交温 度在 37～55 ℃。在我们的实验中采用在 50 % 甲酰氨中 42 ℃杂交过夜 ,温度过高会影响组织 的结构。(2)杂交液用量 ,杂交液的用量根据组 织占据面积而定 ,如果载片上组织多可滴加 200 μL 杂交液 ,以能覆盖所有组织为标准 ,一般每张 载片用量为约 150μL。(3) 气泡 ,由于杂交液中 硫酸葡聚糖的存在使杂交液十分粘稠 ,这样在 滴加时很容易产生微小气泡 ,而这些气泡在较 高温度下膨胀 ,直接影响杂交 ,因此避免气泡显 得尤为重要。建议在滴加前将杂交液温育至 50 ℃左右 ,然后滴加到已经在烫板上加热至 45 ℃左右的组织载片上 ,并用枪头将杂交液轻轻摊开。(4)盖玻片 ,由于利用互补 RNA 与 RNA 靶序列杂交 ,杂交液用量又较少 ,盖玻片的选择也不可忽视。如果选用国产盖片 ,需 彻底清洗、180 ℃烘烤、硅化等处理。利用进口塑料盖片 (Sigma) 虽然可省去这些操作 ,但 依然容易产生气泡。为此我们改用 Parafilm膜 ,发现效果也不比其它盖片差 ,而且经济方 便 ,大小形状随心所欲。(5) 湿室 ,为了避免水分蒸发 ,杂交反应一定要在潮湿环境中进 行。可以截取两根长度适宜的玻棒 ,用少许玻璃胶将其平行固定在直径 20cm 的培养皿 中 ,作为载片的支架 ,杂交时向培养皿内倒入一定量的 50 %甲酰氨-0. 3 mol/ L NaCl ,保持 湿度。 6 　洗片 从这一步开始 ,就和常规的组织化学没有太大区别 ,也不需避免 RNase 的污染 ,相反 , 2 期 徐云远等 : RNA 原位杂交实用技术 237　　 要先用 RNase 水解游离的探针。因此 ,建议以后的操作环境应与前面的分开。杂交后洗 片必不可少 ,而且要反复多次 ,为了减少劳动量 ,提高效率 ,可以在 1000mL 烧杯中进行。 切取一大小合适的包装用泡沫塑料 ,用刀片在上面划几道缝 ,将载片的贴标签端插入缝 中 ,这样可容易地把载片悬于烧杯内的 SSC 溶液中 ,然后用磁力搅拌器缓慢搅动溶液即 可。 图 3 　反义 (A)和正义 (B) RNA 探针杂交结果 Fig. 3 　The hybridization results of antisense(A) and sense (B) probe 7 　检测 为了节省酶标抗体用量 ,滴加抗体溶液之前先用滤纸小心擦干组织周围的溶液 ,再加 抗体溶液覆盖组织 ,这样可以避免溶液向周围扩散。 用 NBT/ BCIP 进行显色时 ,首先要避免光照。显色时间和温度、探针量、靶序列的丰 度、底物浓度等因素都会影响颜色深浅。一般在镜检时阳性信号为浅红或红棕色即可停 止反应 ,进行照相记录结果。 为了长期保存并期望在高倍镜下得到细胞内的定位 ,可以按常规脱水、透明、树脂封 片 ,此时阳性信号变为蓝色或蓝紫色 (图 3) 。所以如果要进行组织结构对染 ,不要选用蓝 色染料。在我们实验中由于杂交信号在细胞质中 ,所以也尝试用苏木精作短暂衬染 ,酸性 乙醇分色 ,以显示细胞核 ,可以明显分开核与质的着色区别。 总之 ,理想的结果不但组织结构完好还要背景干净、信号明显 ,所以从固定材料到洗 照片 ,每一步都要认真对待 ,尤其是粘片要牢、避免 RNase 污染。 参 考 文 献 苏慧慈 ,1994. 原位杂交. 北京 : 中国科学技术出版社 , 31～52 Cox K H , De Leon D V , Angerer L M , Angerer R C , 1984. Detection of mRNA in sea urchin embryos by in situ hybridization using asymmetric RNA probes. Dev Bio , 101 :484～502 Gall J G, Pardue H L , 1969. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparation. Proc Natl Acad Sci USA , 63 :378～381 John H A , Birstiel M L , Jones K W , 1969. RNA-DNA hybrids at the cytological level . Nature , 223 :582～587 Rihn B , Bottin M C , Coulais C , Martinet N , 1995. Evalution of non-radioactive labeling and detection of deoxyribonucleic acids. Part two : colorigenic methods and comparision with chemiluminescent methods. J Biochem Biophys Methods , 30 :103～112 Schwarzacher T , Heslop- Harrison P , 2000 , Practical in situ Hybridization. Oxford : BIOS Scientific Publishers Ltd , 45 Speel E J M , Hopman A H N , Komminoth P , 1999. Amplification methods to increase the sensitivity of in situ hybridization : play CARD(S) . J Histochem Cytochem , 47 :281～288 238　　 植物学通报 19 卷