PPT—高效液相色谱法

null高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography （HPLC） 一、前言一、前言 HPLC是70年代以后发展最快的一个分析化学分支，现已成为生化、医学、药物临床、化学化工、食品卫生、环保检测等领域最常用的分离分析手段。 我国： null课时安排： 第一章：高效液相色谱的基本原理 6学时 第二章：高效液相色谱的仪器装置 2学时 第三章：液固、液液、键合相色谱 4学时 第四章：离子交换色谱和离子对色谱 3学时 第五章：凝胶渗透色谱 1学时 第六章：实验技术和辅助实验技术 2学时 机动 2学时null实验安排： 实验一：样品保留值的重复性测定 实验二：流动相极性变化对溶质保留值的影响 实验三：试样中苯甲酸的定性分析参考书籍：参考书籍：1.色谱理论基础（卢佩章、戴朝政编） 2.高效液相色谱法（邹汉法、张玉奎、卢佩章编著） 3.高效液相色谱方法及应用 （色谱技术丛书、化学工业出版社、 于世林编著)第一章、高效液相色谱的基本原理第一章、高效液相色谱的基本原理§1-1 概述 一、发展历史 1903年提出、1969～1970年开始发展 流动相－－液体 基本原理：在经典液相色谱基础上，引入 气相色谱理论 技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器 实现：分析速度快、分离效率高、操作自动化 nullnullnull 工作原理： 通过高压泵，连续地将流动相按一定流速流过柱子；通过进样器，注入样品混合物。由于混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。通过检测器检测，得到组分的电信号并进行放大； 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 仪将放大的电信号以图形形式记录下来。 高效液相色谱法特点：高效液相色谱法特点：1.高压：一般：150～300kg/cm2 甚至：500kg/cm2 2.高速：两相间交换：千分之几秒 分析时间较经典法少很多(几分~几十分钟) 3 高效：气相：2000塔板/米 液相：5000塔板/米 4.高灵敏度：紫外检测器：10－9g数量级 荧光检测器：10－11g(百万分之几） 试样量小（几微升） 5.高选择性：可分析在性质上极为相似化合物 （手性化合物、同位素、同分异构、空间异构） null 与气相色谱比较： 相同点：都是重要的分离、分析手段 气相的基本理论（塔板理论、定性定量方法） 基本术语（色谱参数、色谱图、色谱柱效） 不同点： ⅰ应用范围：气相：易挥发、热稳定 液相：不易挥发、热不稳定但具有一定 溶解性化合物，不适合气体。 ⅱ流动相作用：气相：运载样品，不影响色谱分离 液相：运载样品，参与、影响色谱分离， 且起主要作用。 ⅲ分析样品：气相：破坏样品，不能回收。 液相：不破坏样品，能回收。 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 ： null HPLC的分类： ⅰ液固吸附色谱（LSC) （ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离） ⅱ液液分配色谱（LLC） （利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度不同而分离） （键合相色谱 60％） ⅲ离子交换色谱（IEC） （利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固定相的亲合力不同而分离） ⅳ体积排阻色谱（SEC) （利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不同而分离）null§1-2 色谱分离和保留值 一、色谱过程 定义——由于样品中各组分在不互溶的两相间平衡 分配的不同，在色谱柱中进行分离的过程 固定相：柱中固定不动 移动相：流过柱子的液体 综合来看：不同组分分离状况取决于： ⅰ热力学平衡问题：各组分分配系数、吸附力、亲 合力之间差异——影响出峰时间 ⅱ动力学平衡问题：溶质扩散系数、填料颗粒、填 充情况、流速——影响峰形null  色谱过程特点： ⅰ组分经无数次平衡分配后，在柱的流 出液中浓度对分离时间呈高斯曲线型 ⅱ色谱条件一定时，各组分都有特定时 间在图谱中出现，称为保留时间tR。 ⅲ柱效一定时，保留值越小，峰窄；保 留值越大，峰宽。 ⅳ相邻峰间tR相差越大，组分间越易分 离null二、容量因子和保留值 色谱的保留作用——化合物进入柱内，即在两相间不断进行平衡分配，由于不同化合物理化性质不同，在两相中存在量也不同。固定相中量多，柱内保留时间长；流动相中量多，柱内保留时间短。容量因子k′——某一组分平衡时，两相中存在量的比值。 要得到理想分离， k′应保持在1～10之间 k′太小——没有充分利用填料 的分离能力。 k′太大——分析时间太长。容量因子k′——某一组分平衡时，两相中存在量的比值。 要得到理想分离， k′应保持在1～10之间 k′太小——没有充分利用填料 的分离能力。 k′太大——分析时间太长。 null§1－3色谱柱的分离效率 分离过程基本理论： ⅰ各组分在两相间分配情况：tR ——由色谱过程的热力学因素所控制 ⅱ各组分在色谱柱中的运动情况：Y1/2 ——由色谱过程的动力学因素所控制null一、理论塔板数N 二、理论塔板高度H 三、峰扩展和速率方程式 峰扩展——某一组分流过时，经过多次平衡分配，使开始处于“浓缩”状态的组分被移动相稀释，最后得到有一定宽度的色谱峰，称之。 柱外因素：ⅰ检测器流动池体积 ⅱ柱出口到检测器的连接管 ⅲ进样器死体积柱内峰扩展影响因素：柱内峰扩展影响因素：①涡流扩散 减小措施：ⅰ颗粒大小保持一致 ⅱ填装均匀 ⅲ尽量采用球型填料 涡流扩散随柱长增加而增加，与流动相流速无关。 ②分子扩散 减小措施：加大流动相流速③传质③传质——溶质分子在两相间浓度的不同，从浓度高的相，不断迁移至浓度低的相，直到浓度达到平衡，这种质量迁移过程称之。 ⅰ固定相传质：⑴固相固定相 ⑵液相固定相 ⅱ移动相传质：⑴迁移移动相 ⑵滞留移动相获得高柱效的几种方法：获得高柱效的几种方法：①选用细的颗粒填料 ②流动相流速低 ③流动相粘度小 ④升高温度 溶质扩散系数与其结构有关 ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大nullnull§1－4 分离度 Rs（Resolution) 一、分离度影响因素 ①峰的宽度（峰宽越小， Rs越大） 峰的宽窄主要反映了色谱分离的动力学特性 ②两峰的保留时间之差（△tR越大， Rs越大） 反映了色谱分离的热力学特性 二、控制分离度方法 ①改变k’ ②更换色谱柱（改变N） ③改变选择性系数 三、分离度控制的一般原则null第二章 仪器装置 液相色谱仪可分为四大系统： 泵系统 进样系统 分离系统 检测系统 null§2－1 泵系统 作用：向色谱柱输送一个连续、恒定的移 动相。 一、对泵系统的要求 1.使用方便（易调节流量、过压保护等） 2.更换洗脱液容易、死体积小 3.有最大工作压力 4.一定流量范围（0.1~10ml/min) 5.流量稳定性好 6.流量精度高泵系统泵系统泵系统发展趋势泵系统发展趋势①高效：填料颗粒↓→分离效率↑→ 柱压降↑→泵的工作压力↑ ②分析时间短：更快流速→柱压降↑ ③减少洗脱液用量 ④液相色谱的多元洗脱系统§2－2 分离系统（色谱柱）§2－2 分离系统（色谱柱）组成：精密管径的不锈钢管、填料、柱接头 要求：①柱管内壁非常光滑 ②柱接头设计要保证系统中引入最小 死体积 ③能密封高压液体 ④两端加过滤片 柱效的影响因素柱效的影响因素①填料的颗粒度及其均匀性 ②柱长、填装的方法与技巧 常用：内径2－5mm（4.6mm) 柱效一定时，柱长与颗粒度成正比 例如：颗粒度5～10um、柱长15～30cm 颗粒度3～5um、 柱长7.5～15cm 进样系统进样系统null§2-3 检测系统 功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间 变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。 按检测方式不同，分为： ①总体性质检测器（通用型） 示差折射检测器、电导检测器 ②溶质性质检测器（选择型） 紫外检测器、荧光检测器 null一、检测器的性能指标 一个理想检测器，必须具备下列条件： ①灵敏度高 ②不受温度及流动相流速变化的影响 ③响应随组分量的变化而线性地变化 ④稳定性好，操作方便 null性能指标： ①灵敏度 S=△R/△Q ②最小检测限（检测下限） ③线性范围－检测信号呈线性变化时，最 大和最小进样量之比 ④噪音－在没有样品情况下，检测器输出 的最大振幅 ⑤漂移－检测器在一段时间内，基线随时 间的增加而产生的偏离 检测系统检测系统null紫外检测器优点： ①灵敏度高（10－10g/ml) ②对梯度洗脱是一种理想检测器 局限性： ①不能检测对紫外光没有吸收的样品 ②不能使用对紫外光有吸收的溶剂PAD检测器PAD检测器第三章、液固色谱、液液色谱、键合相色谱第三章、液固色谱、液液色谱、键合相色谱§3－1 液固吸附色谱 一、原理: 固定相是极性吸附剂，由于不同官能 团样品具有不同极性，因而对固定相的吸 附能力不同。极性越大，吸附能力强；极 性越低，吸附能力越弱而导致分离。分离对象：分离对象：①官能团有差别的不同类型化合物 ②几何异构体（由于固定相表面是刚性结构，即吸附中心处于吸附剂表面一定位置上。溶质分子官能团与吸附中心的相互作用随分子的几何形状而改变，当官能团与吸附中心对准，作用就强。）二、填料的类型及其选择二、填料的类型及其选择①按形状分：a. 球形 b. 无定形 ②按多孔程度分：a. 多孔型 b. 薄壳型 ③按极性分：a. 极性 b.非极性 三、硅胶的活性控制及标准化 市售未处理硅胶→加热4－6小时，活化去水 。再加进定量水分，使吸附剂含水量保持恒定。四、吸附强度分类四、吸附强度分类根据化合物结构类型，可将它们 在硅胶上 的吸附强度排序：P186 归纳： ①官能团不同→极性不同→吸附强度不同 ②几何异构体→空间位置不同→吸附强度不同五、流动相选择的实用要求五、流动相选择的实用要求①溶剂的纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性 ②避免使用与固定相发生不可逆反应溶剂 ③流动相应与检测器相匹配 ④使用的溶剂应当易于除去，不干扰对分离组分的回收LSC流动相分类LSC流动相分类⑴根据所起作用分为： ①底剂 ②洗脱剂 ⑵根据氢键、酸碱性基团分类： ①无氢键型 ②斥电子氢键型 ③吸电子氢键型 ④具斥、吸电子双重性的氢键型 ⑤酸类 ⑥碱类LSC流动相的选择LSC流动相的选择流动相作用：把吸附剂吸附的溶质洗脱下来 溶剂强度ε。↑→洗脱能力↑→k’ ↓ 溶剂强度参数ε。序列：P174 混合溶剂优点： ①获得最佳分离选择性 ②移动相粘度低§3－2 液液分配色谱和键合相色谱§3－2 液液分配色谱和键合相色谱一、液液分配色谱（LLC) 定义－以一种液体作固定相，它均匀 地涂敷在大小一致的小颗粒惰性 担体上。另一种液体作移动相。涂 敷在担体上的固定相应与移动相 极性有很大差别，即两者不相溶。1. 原理：1. 原理：溶质分子X在固、液两相中存在分配平 衡K＝[X]S/[X]m，不同的溶质在两相中 有不同的分配系数K，因而在两相中有 不同的溶解度。在固定相中溶解度大， tR↑；在移动相中溶解度大， tR↓。2. 固定相2. 固定相要求：溶质在固定相中溶解度大于移动相 防止固定相流失很重要，采取措施： ①移动相使用前，先预饱和。 ②避免使用对固定相有中等溶解度的移动相 ③整个色谱体系的稳度必须恒定 ④注意配制样品溶液的溶剂特性注意点：注意点：①对有不同长度侧链的多环芳烃，宜用反相色谱分离。 ②在相同条件下，流动相组分变化对有取代基的多环芳烃的保留影响较大。 3.流动相选择 ①对固定相无损害 ②不宜采用梯度洗脱 常见：乙醚、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷二、键合相色谱二、键合相色谱定义－固定相通过某种化学反应将有机分 子以共价键结合在色谱担体的表面， 这种色谱类型称之。 制备硅胶基质化学键合固定相，注意： ①键合反应前，将硅胶表面硅氧烷全部水 解为硅烷醇。 ②除去硅胶表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。 null形成化学键合固定相，必须具备条件： ①所用基质材料应有某种化学反应活性 ②有能与基质表面发生化学反应的官能 团 键合相反应类型：P303 目前最广泛采用的化学键合固定相： 硅烷化合物（存在Si-C键） 使反相色谱的应用范围远远超过正相色谱 null反相色谱的保留机理 ①疏溶剂理论 ②双保留机理 分离对象： ①同系物：烷烃数↑→tR↑ 直链tR＞支链tR ②化合物极性↑→ tR↓ 固定相对组分保留的影响： ①碳链长度：碳链↑→ tR↑ ②烷基覆盖量：覆盖量↑→ tR↑反相色谱中流动相选择反相色谱中流动相选择水＋有机改善剂 常用：甲醇、乙腈、四氢呋喃、二氧六环 极性：有机改善剂＜水 洗脱能力：有机改善剂＞水 极性顺序：甲醇＞乙腈＞二氧六环＞四氢呋喃 洗脱顺序：水＜甲醇＜乙腈＜二氧六环＜四氢 呋喃反相键合相色谱的优点反相键合相色谱的优点①流动相可选用水溶性 ⅰ.样品的溶解度范围提高 ⅱ.流动相可变性大 ⅲ.柱重现性好 ②固定相表面化学能低 ⅰ.平衡容易 ⅱ.梯度洗脱 ③固定相选择多 ④固定相耐溶剂冲洗 ⑤热稳定性好 缺点：缺点：①流动相PH范围要控制（PH＝2－8） PH太低：Si-C键易断裂 PH太高：硅胶基质易溶解 ②游离的硅羟残基影响分离 色谱选择性解析色谱选择性解析熟练应用HPLC技术→仔细研究和解析大量色谱图 →找出固定相－溶质－移动相三者间相关规律。 通过解析，可以得到：①未知化合物极性大小 ②溶解度参数 ③空间位置阻碍等方面知识 1.色谱分离选择性的物理概念 色谱系统的物理化学参数 ①固定相的表面化学性质 ②流动相性质和浓度 ③温度null 分子间作用力有三种： ①定向作用力（取向力） ②极化作用力（诱导力） ③分散作用力（色散力） 影响氢键大小因素： ①随与H相结合的原子电负性的降低而降低 ②只有电负性较强的原子才可与X-H形成氢键 ③氢键形成难易与空间位阻有关第四章 离子交换色谱、离子对色谱第四章 离子交换色谱、离子对色谱§4－1 离子交换色谱 一、原理： 以离子交换剂为固定相，与流动相中离子 型物质发生可逆的离子交换，根据溶质离 子、离子交换固定相、流动相离子之间相 互作用力的差异而导致色谱分离。二、离子交换剂二、离子交换剂常见：硅胶为基体的键合相离子交换剂 PH对交换容量的影响： ①强酸、强碱性离子交换剂，交换性能不受PH影响，交换容量恒定。 ②弱酸性阳离子交换剂，在较高PH条件下 弱碱性阴离子交换剂，在较低PH条件下 发生离子交换 三、离子交换色谱的影响因素三、离子交换色谱的影响因素①流动相PH的影响 ②流动相中反离子的形式和浓度 三者相互作用力关系： ⅰ.溶质对B+的亲合力↑→交换能力↑→tR↑ ⅱ.流动相离子对B+亲合力↑→洗脱能力↑→ tR↓ ③有机溶剂影响§4－2 离子对色谱§4－2 离子对色谱离子抑制法－通过控制PH，可以控制离子浓度，从而实现在反相柱上对弱酸、弱碱的保留，达到分离目的。 一、原理 色谱过程中，溶质离子X＋和带相反电荷 的配对离子Y-（固、液相中）相结合→形 成离子对化合物X+Y-，然后在两相中分 配。null二、正相离子对色谱 常见：固定相：吸附在硅胶担体上的水 （含配对离子） 流动相：有机溶剂 三、反相离子对色谱 常见：固定相：化学键合相 流动相：缓冲溶液（含配对离子） ＋有机改善剂 离子对试剂选择： 酸性物质－阳离子配对离子（四丁基胺等） 碱性物质－阴离子配对离子（烷基磺酸盐） 三、反相离子对色谱的应用三、反相离子对色谱的应用1.分析无机离子 a.无机阴离子 b.金属离子络合物 2.在生物医学分析中应用 a.分析测定核苷酸、核苷、碱基 b.分析测定维生素 c.分析测定生物碱 四、影响离子对色谱分离选择性因素四、影响离子对色谱分离选择性因素1.溶剂极性的影响 正相：极性↑→洗脱强度↑ k’ 反相：极性↓→有机溶剂比例↑→洗脱强度↑→ k’ ↓ 2.离子强度的影响 反相:水溶液中离子强度↑→ 洗脱能力↑→ k’↓ 3.PH值的影响 弱酸：PH值接近7→组分完全电离→最易形成离子 对→k’最大 PH↓→X-→HX →固定相中离子对减少 →k’↓ 一般：PH=2~7.4 PH＞8 硅胶溶解 null4.离子对试剂性质和浓度的影响 正相:离子对试剂烷基链↑→疏水性↑→缔 合物k’↓ 反相：离子对试剂烷基链↑→疏水性↑→ 缔合物k’↑ 无机盐离子对试剂→疏水性减少→缔合物k’↓ 离子对试剂浓度：10-4~10-2mol/L 5.温度的影响 机械涂敷型固定相：不采用梯度洗脱，恒温 反相离子对色谱：流动相粘度大, 温度↑→柱效↑ 第五章、体积排阻色谱第五章、体积排阻色谱§5－1 分离机理 固定相－一定孔径大小范围的多孔填料 小分子－完全进入填料小孔中 （完全渗透） 大分子－完全不能进入填料小孔中 （完全排除） 中间尺寸分子－部分进入填料小孔中 （选择性渗透） 排阻色谱特点：排阻色谱特点：a.样品峰全部在溶剂的保留时间前洗脱 b.柱内的峰扩展较小 c.峰较窄，有利于检测 d.采用示差检测器 不足：a.峰容量小 b.不能分离大小相似、分子量接近的 组分§5－2 柱填料、移动相§5－2 柱填料、移动相 柱填料要求： a.含大小一定孔径的多孔填料 b.多孔表面不应有吸附作用，只存在排除机理 分类：1.有机凝胶（交联的聚苯乙烯） －半刚性填料，孔径范围较宽，分离范 围较大。非极性有机溶剂，脂溶性样品 2.无机凝胶（多孔硅胶） －柱效高、分离度好。柱压低，更换溶剂 时，平衡较快。但易拖尾。凝胶的选择凝胶的选择渗透极限－可以分离的最高分子量 （与孔径有关，孔径大，渗透 极限大） 分离范围－校正曲线的线性部分 移动相选择移动相选择a.能溶解样品 b.不应造成填料太大的溶胀或收缩 c.控制PH和离子强度，可消除非排除机理的影响（离子强度0.05~0.1 常用磷酸盐或硫酸盐 PH接近中性为宜） d.尽量降低溶剂粘度（加电介质） e.选择与样品折射率差别大的溶剂，提高灵敏度 样品浓度：0.01~0.5% 常用：甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氢呋 喃、水溶液HPLC 分离类型的选择HPLC 分离类型的选择①根据试样的化学物理性质进行选择 ②应掌握各分离类型特点、机理、选择方法 ③每一种分离形式中都可能参与另一种分离形式，仅仅主次之分不同 ④主要根据试样的分子量大小、化学结构、溶 解度参数等化学物理性质来确定nulla.已知结构试样→查阅文献资料→以其他色谱分离技术作参考 b.分子量较大（M＞2000）蛋白质、高聚物→体积排阻色谱 c.分子量较小（ M＜2000）试样→多种溶剂中溶解度情况决定分离类型、填料、流动相 由于试样组分的复杂性，还需对试样的来源、性质等作详细了解，以作选择参考。第六章、实验技术和辅助实验技术第六章、实验技术和辅助实验技术§6－1 定性和定量分析 一、定性分析 ①利用保留值定性 a.与标准物对照 b.将标准物加入样品中 c.二极管阵列检测器 ②联机定性 ③收集洗脱液后定性分析 二、定量分析二、定量分析①标准曲线法（外标法） ②归一化法（所有组分都出峰） ③内标法（选取内标物） ④标准加入法（加入标准样品，利用加入 前后峰面积变化计算） 三、影响定量分析结果准确度因素三、影响定量分析结果准确度因素①样品制备 a. 样品溶剂与洗脱液互溶性好 b. 将干扰组分尽可能分离 c.含量低时必须富集 回收率试验：标准物加入已知含量被测样 品中→用制备样品同样方法处理→定量 测定，得回收率。 回收率＝（测定值－样品值）/加入量 null 储存条件：低温、干燥、避光 样品制备包括：a.溶解（超声波、离心） b.浓缩 c. 萃取 d.预分离 e.衍生化 ②进样技术 影响因素：a.进样装置的准确度和精度 b.分析人员对进样技术的熟练程度 进样－六通进样阀（定量进样管3－4倍） ③定量方法选择 a.Rs＞1.5，柱效变化时，采用峰面积定量。 b.流速变化时，外标法不适用（峰面积影响大）null定量分析不宜采用梯度洗脱（基线易漂移） ④检测器特性 稳定性和线性范围直接影响定量准确性 a.被测组分浓度和响应值呈线性关系 b.进样量不能超出线性范围§6－2 HPLC实验技术§6－2 HPLC实验技术一、色谱柱的保养 ①新柱要作净化处理 ②平时使用： a.正式进样前，先用流动相冲平衡 b.一种流动相换另一种时，需互溶 ③柱的储存： 储存于相对惰性溶剂中（反相柱用甲醇） ④对复杂样品或易污染样品，应装预柱 ⑤实验结束，当洗脱液用缓冲液时，水冲洗→甲醇保护 二、流动相的处理二、流动相的处理①流动相的脱气 原因：a.高柱压下流动相中空气，会在柱 的洗脱 液流中形成气泡，干扰检测器信号。 b.除去氧（氧易与固、流反应，不利于柱 稳定） 脱气方法：a.真空脱气法 b.惰性气体吹脱法 c.超声波脱气法 null②流动相的纯化 a.将溶剂通过干燥的多孔硅胶漏斗（0.45μ) b.在进样器之前设置预柱，将杂质吸附掉 ③流动相配制 a.先配制再脱气，或先脱气再配制 b.对含量少的溶剂必须用移液管精确量取 c.如用缓冲液，浓度应尽量低些 （0.001mol/L）三、样品的预处理三、样品的预处理目的：①除去微粒 ②减少干扰杂质 ③微量组分浓缩 ④改善分离效果 ⑤仪器和色谱柱得到保护 对样品预处理，达到以下要求： ①样品全部转化为溶液 ②溶液浓度低 ③溶剂洗脱强度低于流动相，与流动相相溶 预处理常用方法预处理常用方法 ①萃取法 水溶液试样→被分析物质用有机溶剂萃取 常用：CHCl3、CH2Cl2、正己烷、二乙醚、苯 乙酸乙酯 脂溶性非离子型化合物→杂质形成盐→萃取到 水相 ②吸附法:a.薄层吸附： 吸附剂－硅胶、氧化铝 b.预柱吸附：(被分析物吸附到柱上） ③膜过滤法：去除蛋白质 ④衍生化法：§6－3 HPLC辅助实验技术§6－3 HPLC辅助实验技术一、化学衍生化技术 ①柱前衍生化－被测组分通过衍生化反应，生成衍生化产物，然后通过色谱柱进行分离、测定。 优点：不受反应条件限制、允许较长反应时 间、试剂过量易除去 缺点：反应后易产生多种衍生化产物，给分 离带来困难 null②柱后衍生化－样品先通过色谱柱流出的组分分别与衍生化试剂反应，衍生化产物进入检测器 优点：可自动连续进行、操作简便，不会因衍生化反应给色谱分离带来困难 缺点：仪器结构复杂、要求反应时间短，重现性好、柱后死体积大 无论柱前、柱后，都要求： a.反应定量进行 b.副反应和过量试剂不影响检测 二、柱切换技术二、柱切换技术应用范围：分离分析极性范围很宽的多组分样品，可用梯度洗脱代替。 该技术在样品富集、纯化、制备、切割等方面起到分析结果可靠、重现性好作用 柱切换阀要求： a.能承受无数次切换循环 b.死体积小 c.阀材料无吸附性、耐腐蚀三、制备色谱三、制备色谱分析色谱－在样品分离基础上， 对其作定性、定量分析（进 样量小） 制备色谱－在分离基础上，获得 纯物质（进样量大） 液相制备色谱仪液相制备色谱仪null遇到的典型问题null获得最大制备量的途径null微量和痕量组分的分离制备null举例再循环技术－将含有重叠峰的组分洗脱液从检测器出口→泵→色谱柱，进行第二、三次分离，能得到良好分离效果 对仪器要求： ①制备数mg以下－分析色谱仪，3mg为最大进样量 ②制备数十mg－制备型色谱仪，内径：23.4mm、流量＞10ml/min 样品浓度：a.制备色谱：0.1~10% b.分析色谱：0.05～0.5％再循环技术－将含有重叠峰的组分洗脱液从检测器出口→泵→色谱柱，进行第二、三次分离，能得到良好分离效果 对仪器要求： ①制备数mg以下－分析色谱仪，3mg为最大进样量 ②制备数十mg－制备型色谱仪，内径：23.4mm、流量＞10ml/min 样品浓度：a.制备色谱：0.1~10% b.分析色谱：0.05～0.5％