2010-NSFC-钙敏感受体在大鼠缺氧性肺动脉收缩和血管重构中的作用和分子机制

申请代码 受理部门 收件日期 受理编号 检查保护 国家自然科学基金 申 请 书 ( 2 0 1 0 版 ) 资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 人： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮箱： 申报日期： 2010年3月6日 国家自然科学基金委员会 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是 Word2000,word XP, word 2003 或以上版本用户，请把 Word 宏的安全性设为:"中" 方法: Word 菜单->工具->宏->安全性->安全级,设置为"中" (如果您是 Word97 用户，继续执行以下步骤) (如果您是 Office2007 用户，点击 word 左上角"安全警告"处"选项" 中的"启用此内容") 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 2 页 版本 1.003.565 基本信息 ykKr4oHP 申 请 人 信 息 姓 名 徐长庆 性别 男 出生 年月 1945 年 4 月 民 族 汉族 学 位 学士 职称 教授 每年工作时间（月） 4 电 话 0451-86674548 电子邮箱 xucq45@126.com 传 真 0451-86674548 国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 哈尔滨市南岗区保健路 157 号 工 作 单 位 哈尔滨医科大学 /基础医学院病理生理教研室 主 要 研 究 领 域 心肌缺血-再灌注损伤的发生机制和保护 依 托 单 位 信 息 名 称 哈尔滨医科大学 联 系 人 郭松 电子邮箱 guosong@ems.hrbmu.edu.cn 电 话 0451－86669470 网站地址 http://61.158.20.195/ 合 作 研 究 单 位 信 息 单 位 名 称 [在此录入修改] [在此录入修改] 项 目 基 本 信 息 项目名称 钙敏感受体在大鼠缺氧性肺动脉收缩和血管重构中的作用和分子机制 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 H0203:心肌细胞/血管细胞损伤、 修复、重构和再生 H0109:肺循环及肺血管疾病 基地类别 科技部和黑龙江省生物医药工程重点实验室\部门开放 研究年限 2011 年 1 月 — 2013 年 12 月 研究属性 基础研究 摘 要 (限 400 字)：肺动脉高压(PAH)可导致右心肥大、衰竭甚至死亡。PAH 确切机制尚未阐明， 多认为与肺动脉收缩和重构所致的外周阻力增大有关。钙敏感受体（CaSR）是 G 蛋白偶联受 体。本课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 组首次发现心肌组织有 CaSR 存在，并证实它参与心肌缺血-再灌注损伤、细胞凋 亡和心肌肥大的发生。但是，CaSR与 PAH 发生发展的关系，迄今国内外尚无报道。在前期研 究中，我们发现大鼠肺动脉有 CaSR 的功能表达，并在预实验中观察到缺氧时 CaSR 表达增加。 我们推测缺氧时肺动脉 CaSR 表达可诱导肺血管收缩和重构，这可能是缺氧性肺动脉高压的 一个新机制。为证实这一假说，我们将复制大鼠急性和慢性缺氧模型，采用分子生物学、流 式细胞仪等技术，从整体-血管环-细胞三个层次，观察 CaSR 表达增加或活化对肺动脉张力、 血管重构的影响及其信号传导通路。本课题将从新的视觉阐明 PAH 发生的分子机制，并为 PAH 的防治提供新靶点。 关 键 词(用分号分开，最多 5个) 缺氧性肺动脉高压；钙敏感受体；肺动脉平滑肌；血管重构；大 鼠 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 3 页 版本 1.003.565 项目组主要参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人，国家杰出青年科学基金项目不填写此栏。） 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 席玉慧 1976-12-19 女 讲师 硕士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 xyhui77@126.com 分子生物学 4 2 李鸿珠 1977-03-08 女 讲师 博士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 lihongzhu19780308@126 .com 细胞内钙测 定 4 3 李光伟 1970-03-05 男 博士生 硕士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 liguangwei6@sohu.com 肺血管重构 的信号传导 6 4 郝静辉 1984-11-18 女 硕士生 学士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 haojinghui11@126.com 肌张力 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 6 5 王欣燕 1975-12-22 女 主治医师 硕士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 wxylyf11@163.com 免疫组化 3 6 孙健 1975-8-1 女 博士生 硕士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 mdjsunjian@126.com 细胞周期 6 7 孔凡娟 1985-7-28 女 硕士生 学士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 kfj_850728@sina.com 生化测定 4 8 贾洪丽 1984-2-8 女 硕士生 学士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 jiahongli@126.com 模型制备 6 9 吴博 1978-10-15 女 助教 硕士 哈尔滨医科大学 0451-866745 48 wubow@163.com 分子生物学 4 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 10 1 3 1 2 3 说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 4 页 版本 1.003.565 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 29.6400 1.科研业务费 7.2000 （1）测试/计算/分析费 2.2000 mRNA测序、引物合成、图像分析、流式细胞仪、电 镜检查费等 （2）能源/动力费 （3）会议费/差旅费 1.9000 学术会议 0.4×4人次,科研调研差旅费 0.3 （4）出版物/文献/信息传播费 2.3000 国内外期刊论文发表费 1.5,文献资料费 0.3,答辩 评审费 0.3,信息传播费 0.3 （5）其他 0.8000 不可预见费 2.实验材料费 20.7000 （1）原材料/试剂/药品购置费 18.5000 RNA试剂盒、RT-PCR试剂、各种抗体、化学试剂、 PCR引物的设计、各种耗材 （2）其他 2.2000 标准实验动物购买及饲养 3.仪器设备费 0.9400 （1）购置 0.9400 氮气发生器 （2）试制 4.实验室改装费 0.8000 5.协作费 二.国际合作与交流费 3.8000 1.项目组成员出国合作交流 2.4000 参加国际会议 1人次 2.境外专家来华合作交流 1.4000 境外专家短期来华合作交流国际旅费和生活费 三.劳务费 3.8000 参加课题的研究生和博士后的劳务和生活补助费 四.管理费 1.9600 按基金委规定：经费 5％为管理费 合 计 39.2000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 5 页 查看 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 正文撰写提纲 报告正文 （一）立项依据与研究内容 1. 项目的立项依据 肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是不同病因导致的以肺动脉压力和肺血 管阻力升高为特点的一组疾病或临床综合征，发病率和死亡率很高，其发病机制主要为血管收缩、 血管重构和血栓形成【1，2】。如果PAH不加治疗，最终导致右心衰竭、容量负荷增加直至死亡【3】。通 常肺动脉高压的判定标准为：平均肺动脉压力在静息状态下>25 mm Hg，运动状态下>30 mm Hg。 PAH有多种分类方法。1998年前，仅分为原发性肺动脉高压(PPH)和继发性肺动脉高压(SPH)两大 类。2003年第3届威尼斯PAH会议，将PAH进一步分为：① 特发性PAH(IPAH)；② 家族性PAH(FPAH)； ③ 获得性PAH(APAH)；④ 与重要静脉或毛细血管相关的PAH；⑤新生儿持续性PAH(PPHN)。根据美国 疾控中心的资料，各类型PAH患病率已超过3O～5O人／100万人【4，5】。 许多慢性呼吸系统疾病或缺氧可引起低氧性PAH：1）阻塞性肺疾病：慢性阻塞性肺疾病(COPD)、 囊泡性纤维化/支气管扩张等；2）间质性肺病：特发性间质性肺炎等；3）肺泡换气不足：肥胖通气 不良综合症神经肌肉病等；（4）睡眠障碍性呼吸：睡眠呼吸暂停等；（5）久居高山或高原；（6） 发育异常/新生儿肺疾患【6】。 PAH的发生机制复杂。特发性和家族性PAH主要与BMPR2等基因突变有关【7】。众所周知，肺血管 收缩是PAH的早期组分，由细胞内钙增加触发，信号传导通路主要包括PKC、Rho激酶和环磷酸腺苷 （cAMP和cGMP），钙库操纵性钙通道和电压门控性钾通道（见图1）【8】。 图1 肺动脉平滑肌细胞的钙稳态调节机制 在高肺血流、低氧、毒物等病理条件下，血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及血小板和 单核巨噬细胞分泌血管活性介质的平衡失调，可促进血管收缩、血管重构以及血栓形成（图2）【1】。 PAH发生的分子机制与血管舒张和收缩因子失衡、骨形态发生蛋白II型受体（BMPRII）信号通路 激活、弹性蛋白酶活化、钾通道功能障碍、线粒体异常、瞬时受体电位钙通道（TRPC）激活、AMPK 激活血管壁促炎反应等有关（图3）【9】。 气体信号分子NO、CO、H2S及其调节等已成为PAH的研究热点 【7】，杜军保等已开展了系列研究。Notch3 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 6 页 信号传导途径在促进PAH发展中作用开始受到人们重视（ Li XD et al, nature medicine 2009; 15: 1289- 1299）. 近年来，哈医大朱大岭等对15-HETE在低氧性PAH的作用和机制进行了系统研究【10，11】。 图2 各种细胞在肺动脉高压时血管重构中作用 图3 肺动脉高压（PAH）分子发生机制 根据PAH发生的分子机制，人们采用弹性蛋白酶抑制剂、Kv开放剂、TRP通道抑制剂、负性生存 素、他汀类药物、PPARγ 激动剂、各种生长因子受体的抑制剂、肾上腺髓质素、Rho 激酶抑制剂、 内皮祖细胞、环孢霉素A等治疗【9】。 国内在 PAH 的研究是方兴未艾。 笔者以“肺动脉高压”为检索主题词检索国家自然科学基金委 网站，结果显示：最近 5 年内得到国家自然科学基金委资助的有关“肺动脉高压”研究项目合计 37 项，呈逐年增加趋势（05 年 3 项，06 年 4 项，07 年 7 项，08 年 9 项，09 年 14 项），研究内容主要 涉及上述提到的有关因素【7-11】。 但是，肺动脉高压的研究虽有100多年的历史，其发病机制至今尚未阐明【1，7，12】。尽管现代化的 治疗明显改善了PAH患者的生理功能和延长了寿命，但其死亡率仍高达50%【13】。这就要求人们从 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 7 页 新的视觉，进一步阐明肺动脉高压的发生机制，以便为其有效防治提供新靶点。 钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)是G 蛋白耦联受体的C家族成员。1993 年﹐Brown et al 首次由牛甲状旁腺克隆出CaSR。CaSR由氨基胞外域（ECD）、7个跨膜螺旋的跨膜域（TCD）和 胞内羧基尾部所组成（见图4）。CaSR主要分布在参与钙稳态调节的甲状旁腺、肾肠道、骨组织和肾 组织以及其他细胞（例如，中枢和外周神经、肝脏，血细胞、胰腺β 细胞等）。其功能主要是维持 Ca 2+和其他金属离子稳态，尚可调节细胞增殖、分化、离子通道开启、激素分泌等。细胞外Ca2＋是CaSR 的主要配体，Mg2＋、Gd3＋、新霉素、精胺（spermine）等多价阳离子亦是CaSR的激动剂[14]。 图 4 钙敏感受体机构示意图 心血管领域 CaSR 的研究开展较晚。项目申请人与加拿大 Wang Rui 教授合作，首次在国际上证 明了大鼠心肌有 CaSR 表达（Wang R, Xu CQ, Zhao WM, et al. Calcium and polyamine regulated calcium-sensing receptors in cardiac tissues. Eur. J. Biochem. 2003，270： 2680–2688 ) [15]。迄今，该文被 SCI 引用 31 次。 2006 年，Tfelt-Hansen 等人报告，CaSR 在新生大鼠心室肌细胞也有功能性表达 [16]。近年来， 其他实验小组也提供了一些证据，表明 CaSR 在主动脉等血管的内皮细胞和平滑肌有功能性表达 [17－ 18]。最近，Masih-ul Alam 等证实性肾衰时的血管钙化伴有血管平滑肌细胞功能性钙敏感受体的丢 失【19】。 2004 年以来，项目申请人获得了 3 项国家自然科学基金资助：1）《大鼠心肌细胞钙敏感受体 的生物学活性及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用》（30370577，2004-2006）；2）大鼠心肌多胺 代谢规律和"双刃剑"作用机制的研究》（30470688，2005-2007）；（3）《钙敏感受体对动脉粥样 硬化大鼠急性心肌梗死易感性的影响和保护研究》（30871012，2009-2011）。 在上述项目的资助下，本课题组首次发现：(1)CaSR在大鼠心肌组织中存在及不同鼠龄的表达规 律；（2）CaSR激活通过G蛋白-PLC-IP3通路引起[Ca2+]i增加，导致钙超载；（3）CaSR在心肌缺血-再 灌注时的表达规律，可通过线粒体通路、Fas死亡受体通路和内质网应激通路诱导心肌细胞凋亡；（4） PKCε 介导CaSR活性改变，参与了缺血后适应；（5）CaSR通过神经钙调磷酸酶参与AngII诱导的大鼠 心肌肥大；（6）CaSR表达增加可使动脉粥样硬化大鼠对心肌梗死的敏感性增加【15，20-28】。迄今，已发 表相关论文30余篇，其中SCI收录12篇（详见下面研究基础）。国家自然基金项目《大鼠心肌细胞钙 敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用》已获2008年黑龙江省政府自然科学二 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 8 页 等奖（申请人排名第一）。 CaSR目前已成为国际的研究热点，在我国也开始得到关注。迄今为止，国家自然基金委资助有 关CaSR的研究项目共9项（见下表）： 尽管国内外学者在心血管系统的钙敏感受体（CaSR）方面开展了一些研究，但是肺动脉平滑肌 细胞有无 CaSR 的功能表达及其病理生理意义，迄今未见有 PubMed 收录论文发表。 2010.3.6，笔者在网上检索了 PubMed。在“题目/摘要”范畴内，以“肺动脉高压”、“肺动脉 平滑肌”、“肺动脉平滑肌细胞”、“钙敏感受体”为检索词，分别检出 8106、1314、472、1274 篇论 文，但是将“钙敏感受体”与其他检索词联合检索，则检索结果均为“0”（见下表）。 Mo-Jun Lin等观察到，慢性缺氧时瞬时受体电位(TRPC) 基因负责编码的钙库操纵性阳离子通道 和受体操纵性阳离子通道在肺动脉平滑肌表达上调，并认为这可能是缺氧性PAH的一个新机制【29】。 鉴于CaSR普遍在机体各系统、器官、组织和细胞中有表达，而且CaSR引起细胞内钙升高的机制 也是通过钙库操纵性钙通道（SOCC）和受体操纵性钙通道（ROCC），因此，我们推测CaSR在肺动脉 平滑肌细胞有功能表达，并可能参与缺氧性肺动脉高压的发生。这种假说已在预实验中得到了初步 证实（详见工作基础）： 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 9 页 我们研究小组和同济医学院胡清华研究小组在国内同时开展了肺动脉 CaSR 的研究，并分别证明 肺动脉有 CaSR 的表达：胡清华教授的博士研究生罗友根发表了他的学位论文“新的细胞外钙感受机 制在缺氧引起肺动脉平滑肌细胞胞桨钙离子浓度变化中的作用”（2009.5.23）；本人的博士研究生李 光伟在《第七届海峡两岸心血管科学研讨会》（2009.8.14-17,昆明）也作了“钙敏感受体在大鼠肺 动脉平滑肌细胞的功能性表达”的学术报告（文稿 KM222），目前英文稿件已投出【30】。 慢性呼吸系统疾病或缺氧情况在临床上很常见。例如，慢性阻塞性肺疾病(COPD)在我国的北方 地区（尤其农村）十分常见。慢性支气管炎→阻塞性肺气肿→缺氧性肺动脉高压→右心肥大→右心 衰竭，几乎成了疾病发生发展的规律。缺氧性PAH的发展，对疾病的进展起着推波助澜的作用。慢阻 肺(COPD)不仅给患者带来了巨大的痛苦，也给家庭和社会带来了沉重的经济负担。我们的研究将进 一步揭示缺氧性肺动脉高压的发生机制，为其有效防治提供新理论和药物新靶点。 参考文献 1. Chan SY， Loscalzo J． Pathogenic mechanisms of pulmonary arterial hypertension ． J Mol Cell Cardiol， 2008，44(1)：14-30 2. Stenmark KR, McMurtry IF. Vascular remodeling vesus vasoconstriction in chronic hypoxic pulmonary hypertension: a time for reappraisal? Circ Res 2005; 97: 95-98 3. Farber H, Loscalzo J. Pulmonary arterial hypertension. N Engl J Med 2004;351:1655–65 4. 张颖，刘双，杨京华。肺动脉高压诊断及分类。心肺血管病杂志 2008，27（3）：191-193 5. 王伟，王玉林. 肺动脉高压发病机制研究进展. 实用儿科临床杂志 2008，23（13）：1036-1038 6. Reda E. Girgis, Stephen C. Mathai. Pulmonary Hypertension Associated with Chronic Respiratory Disease. Clin Chest Med 28 (2007) 219–232 7. Mainali Prabha, JIN Hong-fang, TIAN Yue, TANG Chao-shu and DU Jun-bao. Mechanisms responsible for pulmonary hypertension. Chin Med J 2008;121(24):2604-2609 8. Angel Cogolludo, Laura Moreno, Eduardo Villamor. Mechanisms Controlling Vascular Tone in Pulmonary Arterial Hypertension: Implications for Vasodilator Therapy. Pharmacology 2007;79:65–75 9. Marlene Rabinovitch. 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Transplantation of autologous endothelial progenitor cells may be beneficial in patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension: a pilot randomized controlled trial. J Am Coll Cardiol 2007; 49: 1566-1571. 14．Brown, Edward M., and R. John MacLeod. Extracellular Calcium Sensing and Extracellular Calcium Signaling. Physiol Rev 81: 239–297, 2001 15. Wang R, Xu CQ, Zhao WM, et al. Calcium and polyamine regulated calcium-sensing receptors in cardiac tissues. Eur. J. Biochem. 270, 2680–2688 (2003) 16. Tfelt-Hansen J, Hansen JL, Smajilovic S, et al. Calcium receptor is functionally expressed in rat neonatal ventricular cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006;290(3): H1165-71 17. Roy C. Ziegelstein, Yali Xiong, Chaoxia He, et al. Expression of a functional extracellular calcium-sensing receptor in human aortic endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 342 (2006) 153–163 18. Sanela Smajilovic, Jakob Lerche Hansen, Tue E.H. 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Wang LN, Wang C, Lin Y, Xi YH, Zhang WH, Zhao YJ, Li HZ, Tian Y, Lv YJ, Yang BF, Xu CQ（ ）.Involvement of calcium-sensing receptor in cardiac hypertrophy-induced by angiotensinII through calcineurin 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 11 页 pathway in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 2008,369(2):584-589 28. Guo J, Li HZ, Zhang WH, Wang LC, Wang LN, Zhang L, Li GW, Li HX, Yang, BF，Wu LY, Wang R, Xu CQ（ ）. Increased expression of calcium-sensing receptors induced by ox-LDL amplifies apoptosis of cardiomyocytes during simulated ischaemia–reperfusion. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology (2010) 37, e128–e135 29. Mo-Jun Lin, George P.H. Leung, Wei-Min Zhang, et al. Chronic Hypoxia–Induced Upregulation of Store-Operated and Receptor-Operated Ca2+ Channels in Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells – A Novel Mechanism of Hypoxic Pulmonary Hypertension. Circ Res. 2004;95:496-505 30. Li GW, Wang QS, Hao JH, Xing WJ, Guo J, Li HZ, Bai SZ, Li HX, Yang BF, Wu LY, Wang R and Xu CQ（ ）. Functional expression of the extracellular calcium-sensing receptor in rat pulmonary artery smooth muscle cells. AM J PHYSIOL-LUNG C (in submit) 2. 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题 研究内容 （1）大鼠肺动脉平滑肌钙敏感受体的分布、表达和功能（已基本完成） 采用组织化学和免疫荧光技术，确定 CaSR在大鼠肺动脉平滑肌和细胞的分布特点；采用 PR-PCR 和 Western Blot 技术，观察 CaSR 在大鼠肺动脉平滑肌组织和细胞的表达情况；采用激光共聚焦技 术，确定 CaSR 激活引起肺动脉平滑肌细胞[Ca2+]i增加的机制和途径；采用血管环检测技术，观察 CaSR 对肺动脉平滑肌张力的影响。慎密分组，应用各环节激动剂或抑制剂，以确保结论可靠（下详）。 （2）缺氧时大鼠肺动脉平滑肌钙敏感受体表达的变化及其对血管收缩和重构的影响 采用大鼠整体缺氧模型和细胞缺氧模型作为研究对象，采用上述各种实验技术，观察急慢性缺 氧（缺氧不同时间）对大鼠肺动脉平滑肌的 CaSR 表达、肌张力、组织重构（细胞增殖和细胞凋亡） 的影响，揭示 CaSR 表达增加和激活对肺血管收缩、血管重构的影响和信号传导途径，以便阐明 CaSR 在缺氧性肺动脉高压中的作用和分子机制。CaSR 表达、肌张力和[Ca2+]i测定的方法同上；用细胞增 殖和细胞凋亡作为反映血管重构的指标，观察形态学、增殖（凋亡）率、相应信号传导通路关键分 子表达的变化。具体的研究内容、方法和路线，详见下面的研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。 研究目标 （1）证实大鼠肺动脉平滑肌有功能性钙敏感受体（CaSR）的表达。 （2）揭示缺氧时肺动脉平滑肌 CaSR 表达增加，通过促进血管收缩、血管重构参与缺氧性肺动 脉高压（PAH）的形成，从新的视觉揭示其分子机制，为缺氧性 PAH 的防治提供新思路和新靶点。 拟解决的关键科学问题 （1）肺动脉平滑肌有功能性钙敏感受体（CaSR）的表达，这是探讨 CaSR 在肺动脉高压发生中 的作用以及后续研究的前提和基础。根据 K. Wonneberger 等人的文献，欲判断某组织是否存在 CaSR 需用分子生物学方法和功能性检验证实：(1)[Ca2+]o 增加可引起[Ca 2+ ]i增加；(2) [Ca 2+ ]i增加来源于 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 12 页 钙库动员；(3) 外钙内流需经非电压依赖性钙通道；(4) Gd3+ 和 Ca 2+ 是激动剂；(5) CaSR 转录和表 达的存在(用 PT-PCR，免疫组化，northern blot, western blot 等证实)（K. Wonneberger, M.A. Scofield, P. Wangemann. Evidence for a calcium-sensing receptor in the vascular smooth muscle cells of the spiral modiolar artery.J Membr Biol. 2000 1;175 (3):203-12）。我们通过研究内容（1）所示各种相关实验，将 充分证实肺动脉平滑肌细胞有 CaSR的功能性表达。 （2）一般认为，肺血管收缩、重构和原位血栓形成是肺动脉高压（PAH）发生发展的重要病理 生理基础。本实验拟通过实验证实缺氧（尤其慢性缺氧）能使肺动脉平滑肌 CaSR表达增多，后者又 通过细胞内钙增加促进肺血管收缩，通过调节细胞凋亡和细胞增殖引起血管重构，进而导致缺氧性 PAH 的发生发展。如果上述假设得到证实，这将为肺动脉高压的“CaSR 激动假说”提供通过了坚实 的实验依据。研究成果将具有重要理论意义和潜在的应用前景。 3. 拟采取的研究方案及可行性分析 本项目的科研设计将依据随机，对照和重复的三大原则。根据不同情况，分别采用组间对照和 自身前后对照，并进行相应的统计分析。 （1）实验设计和技术路线 1）正常大鼠肺动脉平滑肌 CaSR 的功能性表达 ①实验动物：Wister 大鼠，体重 200-250g,雌雄不拘，清洁级，哈医大动物中心提供。每组 n=7-13(视具体情况而定)。 ②重要试剂的使用浓度： CaSR激动剂： GdCl3 0.3 mM – 1 mM CaSR 抑制剂 NPS2390 10μM 肌浆网（SR）钙泵抑制剂： Thapsigargin 10μM 磷脂酶 C（PLC）抑制剂： U73122 10μM U73122的类似物 U73343 10μM 钠钙交换体抑制剂： NiCl2 10 mM L-型钙通道抑制剂： CdCl2 0.2 mM SR 钙库耗竭剂： Coffeine 10 mM ③具体实验方法：（后详） ④技术路线： 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 13 页 图 1 正常大鼠肺动脉和肺动脉平滑肌细胞 CaSR的表达、定位、功能检测和机制探讨 2）慢性缺氧大鼠肺动脉平滑肌 CaSR 表达变化及其与肺动脉高压的关系 ①实验动物：同上 ②重要试剂的使用浓度：同上 ③具体实验方法：（后详） ④技术路线： A. CaSR 激活对缺氧性肺动脉收缩的影响 图 2 CaSR 激动剂和抑制剂对急性缺氧条件下肺动脉环肌张力的影响 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 14 页 B. 慢性缺氧大鼠肺动脉 CaSR 表达与肺动脉高压的相关性 图 3 慢性缺氧时大鼠肺动脉 CaSR 的表达与肺动脉高压相关参数的变化 C. 缺氧时肺动脉 CaSR 表达增加对血管重构的影响及其机制 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 15 页 图 4 缺氧对培养肺动脉平滑肌细胞 CaSR 表达和细胞增殖及凋亡的影响及其信号传导通路 （2）研究方法 1）肺动脉血管张力的测定： 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 16 页 Wister大鼠 2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（2mg/kg）。开胸取心脏和肺脏，立即置于 4℃盛有 Hepes 液的培养皿中，体视显微解剖镜下，游离直径 0.3-0.7 mm 肺内肺动脉，除去血管周围脂肪和结缔组 织，剪成长度约为 3mm血管环，悬挂在两根钨丝三角环上,一端挂在塑料支架下面的铁钩上，置于盛 有4ml Krebs液恒温浴槽内,另一端挂在张力换能器的电极上，持续通以 95%O2-5%CO2混合气。在30 min 内逐渐给肺动脉环负荷 0.3g 的基础张力，平衡 1 h 后，分别测定不同条件下的血管张力。 【参见： Zhu D, Effros RM, Harder DR, Roman RJ, Jacobs ER (1998) Tissue sources of cytochrome P450 4A and 20-HETE xyntheses in rabbit lungs, Am J Respir Cell Mol Biol, 19,121-128 】 2）肺动脉平滑肌细胞的原代及传代培养： 采用Ⅱ型胶原酶消化法培养肺动脉平滑肌细胞的方法[2]，即取 200g 左右的大鼠，用 2ml 水合氯 醛麻醉。 将麻醉后的大鼠固定于手术台，用酒精棉对大鼠表面皮肤进行消毒。沿着大鼠剑突部位剪 开胸腔，暴露心脏和肺部，用镊子轻提心脏，沿气管处取下肺部，至于 PBS 缓冲液中。将肺叶固定 于硅胶板上，用显微手术剪在体式显微镜下取出远端肺动脉，去内皮后用剪刀将血管剪成碎块，置 于Ⅱ型胶原酶中消化成絮状。 用 20% DMEM 高糖培养液终止消化后，用 2000 转离心 5分钟，取下层 沉淀，用培养液重悬，放于培养瓶中培养。隔天进行换液，一周后进行鉴定。 原代培养细胞长满瓶底80%-90% 即可传代培养，取第2-4代生长良好的用于实验。传代培养的肺 动脉平滑肌细胞长至60%左右融合时，换无血清培养24h，进行实验。 【参见： LÜ Chang-Lian, YE Hong, TANG Xiao-Bo, ZHU Da-Ling, (2005) ERK1/2 signaling pathway is involved in 15-hydroxyeicosatetraenoic acid-induced hypoxia pulmonary vosoconstriction, Acta Physiologica Sinica, 57(5):606-611.】 3）肺动脉平滑肌细胞鉴定(抗 α -actin免疫组化染色)： 取正常培养，未加任何处理的肺动脉平滑肌细胞培养在多聚赖氨酸处理的盖玻片上，纯丙酮固 定15min后，PBS清洗，0.5% H2O2稀释的甲醇室温作用20min，灭活内源性酶，PBS清洗两次。滴加 正常山羊血清，室温作用20min。滴加抗鼠α -肌动蛋白抗体（1：100），4℃过夜。PBS清洗3次，滴 加生物素标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS洗3次。滴加SABC，37℃孵育20min，DAB显 色10min。自来水冲洗，苏木素复染，二甲苯透明，封片，光镜下观察摄片。 4）大鼠缺氧细胞模型的复制： 培养的肺动脉平滑肌细胞置于自制的可封闭的有机玻璃盒中培养24小时，盒内持续通以95% N2、 2% O2、3%CO2的混合气体，玻璃盒浸于37恒温浴箱中。 5）大鼠缺氧在体模型的复制： 健康雄性大鼠，体重为 150-350g，正常组吸入大气,氧气分数为(FiO2 )21.0%。缺氧组大鼠置 于缺氧培养箱中（下图），其吸入氧浓度为 10%，连续饲养 3d、7d、14d、21d。。 缺氧箱上有通气孔可使缺氧箱内外空气相通，氧气监控器检测缺氧箱内氧浓度，并自动控制氮 国家自然科学基金申请书 2010 版 第 17 页 气流入量以保持箱内氧气分数(FiO2 )为 10.0%，低氧箱内有风扇调匀气体。空气经通气管进入 SPB-3 全自动空气源，经 SP