▲利用均匀设计和MATLAB软件优化L—异亮氨酸发酵条件

第 18卷第 1期 2003年 3月 天津轻工业学院学报 JOURNAL OF TIANJIN UNIVERSITY OF LIGHT INDUSTRY Vo1．18 NO．1 Mar． 2003 利用均 匀设计 和 MATLAB软件优化 L． 异亮氨酸发酵条件· 魏 春，宋文军，陈 宁，蒲凌龙，张克旭 (天津科技大学 食品科学与生物工程学院 天津 300222) 摘 要 ：采用均 匀设计 法考查 了 L-异亮氨 酸生产 茵黄 色短杆 菌Brevibacteriumfla~um的种子 培养基和发酵培养基 中几种主要成分对 L-异 亮氨酸发酵的影响，通过 MATLAB软件 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 获 得 最佳种子培养基和发酵培养基 配比，在此条件下该菌株可产 L-异亮氨酸 15．1 s／L。 关键词：L-异亮氨酸；均匀设计 ；发酵 ；MATLAB 中图分类号 ：TQ922 文献标识码 ：A 文章编号 ：1001-456X(2003)01-0017-04 oPrI’D IZATIoN CoNDITIoNS oF L-ISoLEUCINE FEItM NTA． TIoN BY UNIFoRM DESIGN AND M ATLAB SoFTW ARE WEI Chtm，SHONG Wen-jun，CHEN Ning，PU Ling-long，ZHANG Ke-xu (College of Food Science and Bioengineering，Tianjin University of Science and Tech— nology，Tianjin 300222，China) Abstract：Uniform design was employed in our paper to test the influence of several major compo- nents in seed medium and ferm entation medium on the ferm entation of L··isoleucine producer Brevi·- bacterium fla~um．Using MATLAB soflware package．the optimal seed medium and fermentation me． dium proportions were attained．Under these conditions，the strain could produce L-isoleucine 15．1 g／L． Keywords：L—isoleucine；uniform design ；ferm entation；MATLAB． L．异亮氨酸属于人体 8种必需氨基酸之一 ，主要 用于医药和食品行业 J¨。由于 L-异亮氨酸生物合成途 径的特殊性 ，发酵条件尤其是培养基配 比对其有较大 的影响。均匀设计是我国数学家方开泰等独创的将数 论与多元统计相结合而建立起来 的一种试验方法 J。 这一成果已在我 国许多行业 中取得 了重大成果 J。 均匀设计适合于多因素、多水平试验，可使试验处理数 目减少到最小程度 ，仅等于因素水平个数。尽管均匀设 计节省了大量的试验处理 ，但仍能反映事物变化 的主 要规律。本试验运用均匀设计方法考察 了种子培养基 和发酵培养基组成对 L一异亮氨酸产量的影响 ，通过在 国内 日益普及的 MATLAB数学分析软件进行了回归 分析 儿 ，获得了良好结果。 · 收稿 日期 ：2002-07-19 }} 作者简介：魏 春 (1977一)，男 ，浙江绍兴人，硕士研究生。 1 材料与方法 1．1 供试菌株 黄 色 短 杆 菌 Brevibacterium flavum(Met一 + Eth 仅一AB AEC )，天津科技大学代谢控制发酵实验室 保藏菌种。 1．2培养基 斜面培养基组成 ／(g·L )：葡萄糖 5，酵母膏 5， 蛋白胨 10，氯化纳 2．5，琼脂 20，pH7．0-7．2；种子培养 基组成 ／(g·L )：蔗糖 30，KH2PO41．5，MgSO40．4， FeSO 0．01，MnSO 0．01，醋酸铵 3，尿素 2，豆饼水解液 2，VH 2 mg／L，VB1 3 mg／L，pH7．2； 发 酵 培 养 基组 成 ／(g·L )：葡 萄 糖 120， 维普资讯 http://www.cqvip.com · 18 · (NH4)2SO4 40，FeSO415 mg，MgSO4500 mg／L，MnSO4 15 mg／L，KH2PO4 1．5，K2HPO4 3，VH 100 g／L，VB1 5 mg／L，Met20mg／L，豆饼 水解液20，CaC O330，pH 7．2。 豆饼解液 ：由河南莲花味精集团提供。 1．3培养方法 种子培养 ：接一环生长良好的斜面种子至装有 25 mL种子 培养基 的摇 瓶 中，置 于旋 转式 摇床上 (200 r／rain)，31℃ 振荡培养 45 h。 发酵培养：取上述种子培养液以 1Oc)／0接种量接至 含 25 mL发酵培养基的 500 mL三角瓶中，31℃ 振荡 培养 96 h。 1．4 分析方法 (1)发酵液 中残糖的测定 ：采用 SBA-40系列生物 传感分析仪测定 。 (2)OD值的测定 ：稀释一定倍数后 ，在波长 620 nm处用 722分光光度计测光密度 ，光程 1 em。 (3)L．异亮氨酸含量测定 ：采用纸上层析法、比色 定量法测定 。 1．5 均匀设计 采用均匀设计的方法优化种子和发酵培养基 ，以 发酵终点产酸作为衡量标准 ，使用 MATLABL软件 中 的逐步回归和多元二次多项式回归方法 ，根据实验数 据进行参数估计 ，建立 回归方程 ，由回归方程对发酵产 酸进行预测。 2 结果与讨论 ． 2．1 种子培养基配比优化 2．1．1 种子配 比均 匀设计 通过预备实验，确定 3种主要因素为考察对象： KH PO (X )、醋酸铵( )、豆饼水解液( ，)。因此 ，固 定其它成分的配比，采用3因素 5水平5组实验的方式 ( (5 )均匀 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ) 考察了3个主要因素对种子生长 的影响 ，进行了发酵实验比较 ，3种成分 的水平数见表 1，种子培养基均匀设计试验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及实验结果如表 2所 示 天津轻工业学院学报 第18卷 第1期 表 1 KH2PO 、醋酸铵、豆饼水解液水平表 因 素 1 2 3 4 0．1 O．2 0．2 O．2 O．3 O．6 O．3 0．4 1．0 O．4 0．5 1．4 O．5 0．6 1．8 表 2 种子均匀设计试验方案及实验结果 因 素 1 2 3 4 5 X1／(g／100 mL) 0．5 0．4 0．3 0．2 0．1 X2／(g／100 mL) 0．3 0．5 0．2 0．4 0．6 x3／(g／100mL) 1．8 1．4 1．0 0．6 0．2 实测值 OD620 0．758 0．703 0．583 0．571 0．126 预测值 OD620 0．757 0．702 0．583 0．570 0．125 2．1．2 试验数据的回归分析及方程的建立 应用 MATLAB软件中的逐步回归分析可知，以醋 酸铵和豆饼水解液两因素作回归方程可信度最高，这 两个因素的回归方程中又以纯二次模型的拟合程度最 佳 。由表 2结果回归获得如下方程 ： Y = 一0．380 +3．354X2+0．691X3— 4．545霹 一0．217霉 此方程预测值与实际值几乎完全吻合 ，R(相关系 数)=0．99，rinse(剩余标准差)=0，因此方程显著性 强 ，所得回归结果如表 3所示 。由表 3中的各变量影响 显著性检验值 F的大小可排出各因素对种子生长影响 的大小顺序 ： >X2>Xl。 表 3 因归结果 根据 MATLAB中rstoo]命令的交互式画面可直接 找出极值 ，结合实际取 X2=0．37，X3=1．6，X，=0．3 代人方程可得预测 OD酡。为 0．789。 2．1．3 优 化 结 果 将此优化后的种子配方定为 I撑，原种 子配方为 2#，均匀设计中的最高 OD试验号为3#，进行发酵实验 比较 ，结果如表4所示。 表 4 发酵结果 ^ ^ ^ L L L m m m ∞ ∞ ∞ { ／ ／ ／ 维普资讯 http://www.cqvip.com 2003年 3月 魏 春 ，等：利用均匀设计和 MATLAB软件优化 L．异亮氨酸发酵条件 2．1．4 优化 结果分析 表4的结果表明 ，优化后的种子配方有利于产酸， 与原配方 2#相比，1#和 3#在豆饼水解液用量上明显 加大，种子菌体浓度也 比原配方有大的提高。从 回归分 析中也可以看出，豆饼水解液是对种子生长的最大影 响因素。豆饼水解液含有丰富的游离氨基酸和多种生 长因子 ，是较理想的营养物质 ，微生物在这种富含有机 氮源的培养基中，可以直接利用游离氨基酸或其它有 机化合物的碳架 ，合成用于构成细胞的蛋 白质和其他 细胞物质，因而对菌体生长非常有利。相比而言 ，无机 · l9· 氮源醋酸铵的影响要比豆饼水解液小得多(从 F值可 看出)。达到一定菌浓同时又生长 良好 的种子在发酵 过程中既能保持旺盛的代谢活力 ，又能缩短发酵周期， 从而有利于提高产量。 2．2 发酵培养基优化 2．2．1 发酵培养基均匀设计 采用6因素 l0水平 l0组试验的方式(U， (10 )均 匀表 ) ，考 察 了 葡 萄 糖 (X。)、(NH ) SO (X2)、 KH PO (X3)、VH(X4)、VB1(X5)、Met(X6)对产 酸的 影响。各因素的水平数、试验安排及结果见表 5、表 6。 表5 发酵培养基配比试验因素水平表 表 6 发酵培养基均匀设计试验方案及实验结果 2．2．2 试验数据的回归分析及方程的建立 同种子均 匀设计 回归分析类似 ，剔除 KH PO 、 Met两个非显著性影响因素 ，以剩余4因素回归获得如 下方程： Y ： 一41．697 +6．607Xl+1．644X2+ 1．103X4— 7．532X5—0．217X2,一0 ． 672X~一 0．039 +0．514X~ 此 方程 回归结 果如 表7所示 ，其 相关 系数 R： 0．99，总体显著性检验值 F =7047>F 8-I(0．05)： 239，rmse(剩余标准差)=0．053，因此方程可信度高。 表 7 回归结果 由表 7中各变量影响显著性检验值 F可排出各因 素对产酸的影响大小顺序为： 2>X5>X > ，根据 MATLAB中 rstool命令的交互式 画面可直接找 出极 值 ，结 合实 际取X。=1 6，X2=1．25，X4=1 4，X = 0．1，X3=0．15，X6=2，预测产酸为 16．52 g／L。 2．2．3 优 化 结 果 以上述优化种子分别接人原发酵培养基 (2#)和 优化发酵培养基 (1#)进行发酵实验 ，结果如表 8所 示。 维普资讯 http://www.cqvip.com · 2O · 表8 发酵 比较结果 天津轻工业学院学报 第l8卷 第1期 2．2．4 优化 结果分析 从表 8结果可以看出，采用优化培养基可明显地 3 结论 提高 L一异亮氨酸的产酸率。 和原发酵培养基 相 比，优化 培养基 的葡萄糖 、 (NH ) SO 、VH、VB1这 4种成分浓度有了较大的改 变。 (1)葡萄糖在 160 g／L的高浓度下 ，异亮氨酸的产 量仍能提高，这说明此菌种具有高糖发酵的能力。 (2)生物素VH的用量有所增加，说明较高生物素 有利于异亮氨酸的积累。生物素是磷酸烯醇式丙酮酸 羧化酶的辅基 ，通过促进 CO 的固定能把碳架流导向 合成异亮氨酸的途径，另外，较高生物素能抑制比异亮 氨酸优先合成的谷氨酸的分泌。但是从试验结果也可 以看出，过高的生物素对产酸并无好处。 (3)VB1在菌体内转化成为硫铵素焦磷酸 ，后者 是丙酮酸脱氢酶复合体系的辅助因子 ，有利于丙酮酸 脱氢成乙酰辅酶 A进入 TCA循环。优化结果表明 VB1 用量太大对发酵不利，可能是过多的丙酮酸被氧化，反 而使进入异亮氨酸合成的碳架减少了， (4)从 ，值可以看出，(NH ) sO 是最大的影响 因素。优化结果表明，(NH ) SO 用量以低浓度为佳 ， 高浓度的(NH ) SO 明显抑制产酸，这与文献报道【8 一 致 。 综上所述，通过 MATLAB软件获得优化种子培养 基配 比为：KH2PO 3g／L，醋酸铵 3．7 g／L，豆饼水解液 16 g／L；优 化 发 酵 培 养 基 为 ：葡 萄 糖 160 g／L， (NH4)2SO4 12．5 g／L，VH 140／．tg／L，VB1 l mg／L，Met 20 mg／L，KH2PO 1．5 g／L，在此条件下，该菌株可产 L- 异亮氨酸 15．1 g／L。 本研究采用均匀设计方法，由回归分析及实际经 验，得出 L一异亮氨酸的优化种子培养基和发酵培养基 的配比，同时本文对上述优化配方的作用机理进行了 理论分析。该配比有利于 L一异亮氨酸的积累。试验表 明均匀设计能以较少的试验获得 良好的试验结果，同 时从优化过程中可以看出，作为一个功能强大的数学 分析软件 ，MATLAB在处理均匀设计实验数据时也 比 较快捷有 效 。 参 考 文 献 ： [1] 张克旭 ．氨基酸发酵工艺学[M]．北京：中国轻工业出 版社 ，1992，651-652． [2] 方开泰 ．均匀设计与均匀设计 表[M]．北京 ：科学出版 社 ，1994，69-97． [3] 张晓菁 ，薛凤兰 ．均匀设计在庆大霉素发酵工艺 中的应 用 [J]．沈阳药学院学报 ，1993，10(2)：116-118． [4] 黄 剑，姚庆祥 ．应用均匀设计进行 盐酸克林霉素工艺 的研究[J]．中国药物化学杂志，1992，2(3)：6l一64． [5] 王沫然 ．MATLAB 5．X与科学计算 [M]．北京 ：清华大学 出版社 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