分子生物学实验指导书

实验一 溶液的配制和器械的准备 分子生物学实验指导书 何华纲 编 江苏大学 食品与生物工程学院 2007年9月 目录 实验一 溶液的配制和器械的准备································································································3 实验二 质粒DNA的提取与检测·································································································11 实验三 PCR技术扩增目的基因··································································································21 实验四 PCR产物与质粒DNA的酶切分析··········································································30 实验五 目的基因与质粒载体的连接和转化·······································································36 实验六 重组质粒的鉴定（综合性实验）···············································································44 附录1 实验安全 ······································································································································52 附录2 实验设备·······································································································································58 实验一 溶液的配制和器械的准备 一、实验目的 ①认识各种常用器械； ②掌握分子生物实验中常用溶液的配制 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ； ③掌握高压蒸汽灭菌的方法，了解各种灭菌方法，树立无菌观念； ④掌握微量移液器的使用方法。 二、实验原理 1、溶液的配制与灭菌 （1）溶液浓度的表示 溶液的浓度，常用质量浓度、摩尔浓度和体积百分浓度表示。 质量浓度，是指单位体积的溶液中所含溶质的质量数，常用g/L、mg/L、mg/mL、g/L等单位表示。如抗生素母液常以mg/mL作为浓度单位，DNA或RNA常以g/L作为浓度单位。质量百分浓度则是指用百分数（%）表示每100毫升溶液中所含溶质的质量数（g/100mL），如20% SDS，它表示每100mL溶液中含有20g的SDS（十二烷基硫酸钠）。 摩尔浓度，是指每升溶液中所含溶质的摩尔数，即mol/L。如0.5mol/L EDTA，它表示每升溶液中含有0.5摩尔EDTA（乙二胺四乙酸）。另外，0.5mol/L EDTA常常可以写作0.5M EDTA，这里的“M”就相当于“mol/L”。而摩尔数与质量的关系为： 摩尔数=质量（g）/分子量 无论是质量浓度，还是摩尔浓度，在定义时都是以一定体积为基数的，因此在溶液的配制过程中，不能将称量的溶质直接加入足体积的溶剂中，因为溶质溶解后也会占一定体积。比如，在配制100mL 的20% SDS溶液时，起先只加80mL纯净水，待SDS完全溶解后，再用水定容至100mL。 配制一种溶液，采用摩尔浓度还是质量浓度，主要依据使用时的便利。另外，两者之间也不是完全孤立的，可以进行有效的换算： 摩尔浓度=[质量浓度·体积数（mL）]/[分子量·体积数（L）] =1000质量浓度/分子量 另外，溶质本身为液体时，常用体积百分浓度表示其浓度。体积百分浓度是用溶质体积占全部溶液体积的百分数表示的浓度。如消毒用的70%乙醇，每100mL溶液中含有70mL无水乙醇。 （2）实验用水 总的来说，使用什么作为溶剂，以及随后如何调节pH值、如何灭菌处理等，必须在溶液的配制时查阅相关实验手册，最权威最全面最常用的是美国冷泉港所编著的《分子克隆实验指南》，目前已有第三版的中译本。 溶液配制中常用的溶剂是水，过去常用蒸馏水，现在多用结合反渗透膜、离子交换、活性炭吸附等技术的纯水装置制备的纯净水。按照过去的表述，蒸馏水有两种，一种是一蒸水（也就是一般所说的蒸馏水），它的纯度与离子交换蒸馏水差不多，多用于器皿的冲洗、电泳缓冲液的配制和细菌培养基的制备等；另一种是双蒸水，由一蒸水再次蒸馏得到，与纯净水的纯度差不多，可用于组织培养实验。必须注意的是，对于某些有机成分，只能用相关的有机溶剂或酸、碱溶液来配制。 （3）pH值的调节与定容 在分子生物学与基因工程的实验中，所用试剂（如电泳缓冲液、培养基等）往往应当具有一定的pH值，可以使用pH试纸测定，但需要更高精确度时可以使用pH计测定。在调节pH值时，采用添加酸或碱的方法，但必须考虑溶液的成分，添加相应的酸或碱，尽量保证不引入杂离子，比如调节Tris-HCl缓冲液的pH值时必须添加HCl，调节EDTA溶液的pH值时必须添加NaOH（因为EDTA本身就是钠盐）。 调节pH值后，就可以对溶液进行定容。这里不是分析化学实验，没有必要用容量瓶来定容，只要用量筒就可以满足精度要求了。值得注意的是，定容是在最后完成，因此在前面的配制过程中，不能将溶剂直接添加到目的体积。 溶液定容之后，装于适当容量的试剂瓶中，贴上耐高温的标签纸，图1中以溶液0.5mol/L EDTA（pH8.0）为例，说明了标签的一般写法。在一张标签上需要工整地书写以下内容：溶液名称、浓度、pH值（必要时）和配制日期。 （4）溶液的灭菌与保存 分子生物学与基因工程实验，一般都需要在无菌条件下进行，以避免杂菌的污染，或者对DNA或RNA的降解作用，因此必须对配制的溶液进行灭菌处理。溶液的灭菌主要有两种：高压蒸汽灭菌和滤膜过滤。一般的溶液都可以采用高压蒸汽灭菌，条件为121℃（蒸汽压为0.1-0.15MPa）保温15分钟。但遇到以下情况时，必须采用滤膜过滤：①含有遇热易分解的成分；②含有易挥发的成分；③含有有机溶剂；④含有腐蚀性、刺激性强的成分。如植物组织培养过程中的某些植物激素和细菌培养过程中各种抗生素，遇热很容易分解，配制后必须采用过滤灭菌，而且必须在经灭菌的培养基冷却到50℃以下，才能按比例添加到培养基中。 经过必要的灭菌处理后，常常将溶液放置在4℃冰箱，这样就可以较长时间地保存溶液，而不受杂菌的污染。 2、​ 工作液与储存液 实验中使用的溶液可以分为工作液和储存液。工作液浓度较低，可以直接使用，但不利于溶液的长期保存，而储存液的浓度往往比较高，可以长期保存。工作液浓度往往可以默认为“1”，如果储存液是该工作浓度的10倍，那么储存液的浓度就可以表述为“10”。 这样的储存液不但可以常温中长期保存，而且也极大地节约实验室空间，另外在实际使用中也显得相当方便，只要根据计算直接移取一定的体积进行稀释（按照这里的例子就是稀释10倍），就可以转变为工作浓度。这样也就没有必要在每次使用前都配制溶液，要知道，有些溶液的配制比较烦琐，往往难以溶解，或者不易调节到恰当的pH值。实验室常用的Tris-HCl（pH8.0）溶液和EDTA（pH8.0）溶液就多以高浓度的储存液形式配制，比如都可以配制成1mol/L这样的高浓度，使用时作适当稀释即可。 3、​ 常用器械与灭菌 常用的灭菌方法有高压蒸汽灭菌、高温干热灭菌、过滤灭菌、火焰灼烧、紫外线照射、70%酒精消毒等。在实验中，常用器械或耗材的灭菌方法的确定，主要是要根据材料的特性。 （1）玻璃器皿 常用的玻璃器皿有：①烧杯与量筒，可用于溶液的配制及定容；②试剂瓶，包括无色试剂瓶和棕色试剂瓶，后者常用于特殊试剂的避光保存；③三角瓶，可用于液体或固体培养基的配制，但由于刻度很不精确，不可用于溶液最后的定容；④培养皿，用于分装固体培养基和细菌的固体培养，以获得遗传背景一致或插入单一片段的单克隆（细菌）；⑤涂布玻棒，可将细菌均匀涂布于培养皿中的固体培养基上，以培养和获得单克隆（细菌）。 （2）金属制品 常用的金属制品有接种环、镊子、剪刀等，其中接种环用于细菌的接种。 （3）塑料制品 常用的塑料制品主要是离心管和移液枪头。离心管有50mL、10mL、1.5mL、0.2mL等多种型号，其中50mL、10mL和1.5mL离心管既可以用于相应体积溶液的配制，也可以用于细菌的液体培养，1.5mL离心管还可以用于质粒DNA的提取、DNA片段的回收等，而0.2mL离心管主要用于需要在热循环仪上运行的反应，如PCR反应、连接反应、酶切反应等。至于移液枪头，将在“移液器的使用”作进一步的介绍。 （4）器械的灭菌 器械的灭菌方法主要有：高压蒸汽灭菌、高温干燥灭菌、火焰灼烧和70%酒精消毒等。 对于塑料制品（离心管、枪头等）、玻璃器皿（如培养皿），常采用高压蒸汽灭菌。 对于金属制品和玻璃器皿（如培养皿、量筒等），常采用高温干燥灭菌，120℃烘烤2小时以上，甚至更高温度更长时间进行烘烤（如对RNA进行操作中，所使用的器械需经过180℃烘烤6小时以上）。 此外，对于金属制品和涂布玻棒等玻璃制品，还可以蘸取工业酒精后，通过火焰灼烧的方法进行灭菌；对于移液器等不宜采用以上方法灭菌的器械，以及操作人员的手部，可以利用70%酒精进行表面擦洗，作简单的消毒处理。 4、移液器的使用 （1）移液器与枪头 在分子生物学实验中，实际操作往往涉及一定体积液体的移取，这时需要借助移液管（及洗耳球）与移液器。移液管的精确度不高，但量程较大，有5mL、10mL、20mL等级别，常用于溶液配制过程中较大液体的移取。 在分子生物学实验所涉及的各种反应体系（如PCR反应体系、限制性内切酶酶切反应体系）的配制过程中，最常用的是移液枪（移液器是通俗的叫法，实际上应该叫做微量移液器，micropipette）。本实验室使用的移液器，其规格可以按照量程划分，主要有100-1000l（蓝色）、20-200L（紫红色）、5-50L（黄色）、0.5-10L（红色）和0.1-2.5L（白色）这几种（见图2）。 在具体操作时，每种规格的移液器还需配以相应大小型号的枪头：100-1000L（蓝色）移液器装配1mL（蓝色）枪头，20-200L（紫红色）和5-50L（黄色）移液器装配200L（黄色）枪头，0.1-2.5L（白色）移液器装配20L（无色）枪头，而0.5-10L（红色）移液器既可以装配200L（黄色）枪头，也可以装配20L（无色）枪头。 （2）移液器的使用方法 移液器使用时的标准方法为：①吸取液体：按控制按钮到第一档，垂直进入液面，然后缓慢松开按钮，否则液体会冲入移液器内部，或导致吸入体积减少；②打出液体：以一定角度贴壁后，先按到第一档，稍停顿后再按到第二档，即可将枪头内的剩余液体全部挤出。 移液器适用于移取微量体积的水、酸碱溶液、盐溶液和各类缓冲液。在移取高粘稠度液体和易挥发性液体时，容易导致体积有较大的误差，对此可以采用以下措施提高移液的精确性：①在吸取液体前，将枪头探入液面以下，先轻轻地反复吸打几次液体，以便湿润枪头内部；②吸取液体或打出液体时多停留一段时间，以便充分吸取或打出液体。 在使用移液器时常见的错误操作有：①超量程使用移液器，导致移取体积不准确，且容易损坏移液器；②装配枪头时用力过猛，会导致随后枪头难以脱卸；③在移液器倾斜时吸取液体，会导致移取体积不准确；④平放或倒置带有残余液体的移液器，溶液导致移液器内部污染，甚至腐蚀和损坏移液器；⑤在某个量程范围内按小体积移取液体完毕后，不将刻度归位于最大值，致使移液器的内部弹簧长期处于压缩状态，以致移液器的刻度不精确，甚至损坏移液器。 三、实验材料 1、主要试剂 （1）用于细菌培养：yeast extract（酵母提取物），tryptone（胰蛋白胨），NaCl，琼脂粉，蒸馏水； （2）用于质粒DNA提取：Glucose（葡萄糖），0.5 M Tris（pH8.0），0.5 M EDTA（pH8.0），0.4 M NaOH，2% SDS，5 M KAc，HAc（冰醋酸，乙酸）； （3）用于凝胶电泳与染色：Tris（粉末），0.5 M EDTA（pH8.0），HAc，蔗糖，溴酚蓝EB（溴化乙锭）。 2、主要仪器 微量移液器，电子天平，pH计，全自动高压灭菌锅，烘箱，超净工作台，冰箱等。 四、实验内容 1、常用溶液的配制 （1）在配制溶液前，请先计算所配试剂中各成分的用量。 溶液 试剂 储存液 终浓度 所需重量或体积 LB培养基 200mL yeast extract powered 0.5% tryptone powered 1% NaCl powered 1% dH2O 溶液I 50mL Glucose powered 50 mM Tris, pH8.0 0.5 M 25 mM EDTA, pH8.0 0.5 M 10 mM dH2O 溶液II 4mL NaOH 0.4 M 0.2 M SDS 2% 1% 溶液III 50mL KAc 5 M 3 M HAc 100% 11.5% (v/v) dH2O TE （pH8.0） 50mL Tris, pH8.0 0.5 M 10 mM EDTA, pH8.0 0.5 M 1 mM dH2O 10×TAE 电泳缓冲液 1000mL Tris powered 48.4g EDTA 0.5M (pH8) 20mL HAc 100% 11.42mL dH2O 6×Loading buffer （上样缓冲液） 100mL 蔗糖 powered 40% 溴酚蓝 powered 0.25% dH2O EB（溴化乙锭） 10mg/mL （2）LB（Luria-Bertani）液体培养基的配制：清洗250mL三角瓶，称取适量的yeast extract（酵母提取物）、tryptone（胰蛋白胨）、NaCl，加入200mL蒸馏水，铝箔纸包扎封口后，待高压蒸汽灭菌。 注意：①LB液体培养基常用于大肠杆菌增殖培养；②在LB培养基中，酵母提取物提供维生素和矿物质，蛋白胨提供碳源、氮源及能量，NaCl提供适当的渗透压；③不必定容，可直接加入200mL蒸馏水；④氨苄青霉素等抗生素受热易分解，必须在培养基经高压蒸汽灭菌、且温度降至50℃以下时加入。 （3）LB固体培养基的配制：清洗250mL三角瓶，称取适量的酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl，并称取3g琼脂粉，加入200mL蒸馏水，铝箔纸包扎封口后，待高压蒸汽灭菌。 注意：①LB固体培养基常用于大肠杆菌的纯化培养；②琼脂粉起固化的作用；不必定容，可直接加入200mL蒸馏水；③氨苄青霉素等抗生素受热易分解，必须在培养基经高压蒸汽灭菌、且温度降至50℃以下时加入。 （3）溶液I、II、III的配制：清洗适当容积的试剂瓶，称取适量粉末状的葡萄糖，选择适当量程的微量移液器，移取所需体积的母液。溶液I、III需要在最后用100mL量筒定容，待高压蒸汽灭菌。溶液II现用现配，室温下放置。 注意：①溶液I、II、III用于质粒的制备；②正确使用微量移液器。 （4）配制TE（pH8.0）溶液，待高压蒸汽灭菌。 注意：①TE溶液用于溶解各类DNA；②由于Tris-HCl和EDTA溶液为常用试剂，故常常先配制高浓度的储存液，4℃冰箱中保存备用；③由于0.5M Tris-HCl（pH8.0）和0.5M EDTA（pH8.0）均已调好pH值，配制pH8.0的TE溶液时不必再调节pH值；④正确使用微量移液器。 （5）配制10×TAE电泳缓冲液，待高压蒸汽灭菌。 注意：10×TAE电泳缓冲液为高浓度的储存液，使用时稀释10倍作为1×TAE工作液，电泳槽中添加电泳缓冲液和配制琼脂糖凝胶所用的电泳缓冲液浓度应一致，都使用1×TAE工作液。 （6）配制6×上样缓冲液，待高压蒸汽灭菌。 注意：电泳上样前，取适量6×上样缓冲液与DNA样品（如质粒溶液、PCR产物、酶切产物等）混合，使上样缓冲液在混合物中的终浓度约为1×。 （7）配制EB储存液（10mg/mL），室温下保存。 注意：①在自来水中加入数滴EB储存液即可用于琼脂糖凝胶的染色；②由于EB有致癌嫌疑，操作时必须戴一次性塑料手套，禁止戴着塑料手套接触非EB区，操作完毕手套扔在指定的纸篓。 2、器械的准备 （1）戴一次性塑料手套，将各种型号的移液枪头装入相应的枪头盒：1mL（蓝色）、200l（黄色）、20l（白色），待高压蒸汽灭菌。 注意：必须戴一次性塑料手套装枪头，以免手上的残质污染。 （2）戴一次性塑料手套，将各种型号的离心管装入铝制饭盒：50mL、10mL、1.5mL、0.2mL。待高压蒸汽灭菌。 注意：必须戴一次性塑料手套装枪头，以免手上的残质污染；必须打开离心管盖子，使离心管内部充分灭菌。 （3）清洗玻璃培养皿，装入铝制饭盒，待高压蒸汽灭菌。 注意：用于LB固体培养基的配制；也可通过高温干燥灭菌（120℃，2h）。 3、试剂与器械的灭菌 （1）采用全自动高压蒸汽灭菌锅对试剂（LB液体/固体培养基、溶液I、溶液III、TE、10×TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液）和器械（枪头、离心管、玻璃培养皿）进行灭菌，121℃保温20min。 （2）塑料制品（枪头、离心管）放50℃烘箱烘干，备用。 （3）LB液体培养基、溶液I、溶液III、TE、10×TAE电泳缓冲液、6×上样缓冲液，在室温下冷却，保存于4℃冰箱，备用。 （4）含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基（LB平板）的配制：在超净台内喷洒70%酒精，并打开紫外灯消毒20min。待灭菌后的LB固体培养基冷却至50℃以下后，按每200mL培养基中加入200L氨苄青霉素母液（100mg/mL），轻轻混匀，使氨苄青霉素在培养基中的终浓度为100g/mL。待培养皿中的培养基凝固后，移入4℃冰箱保存备用。 注意：①配制LB平板时必须严格按照无菌操作的要求，以免影响实验结果；②提前对超净台进行消毒，倒培养基前关闭紫外灯，以免对皮肤和眼睛造成伤害；③氨苄青霉素等抗生素在高温下容易失活，必须在培养基的温度较低时加入，一般为裸手可承受时（50℃以下）；④倒入的培养基厚度应适宜，约占平皿厚度的三分之一。 五、思考题 1、​ 分子生物学实验中，配制溶液应注意哪些问题？ 2、​ Tris-HCl、EDTA在相关溶液中各所起什么样的作用？ 实验二 质粒DNA的提取与检测 一、实验目的 ①了解大肠杆菌的保存和培养方法； ②掌握“碱裂解法”提取质粒DNA的方法； ③掌握紫外分光光度计检测质粒DNA浓度和纯度的方法。 二、实验原理 1、大肠杆菌的培养与保存 （1）大肠杆菌 大肠杆菌（Escherichia coli）是单细胞生物，属于原核生物，是最重要的模式生物之一，许多早期的分子生物学理论研究，都是以它为对象取得重大成果的。目前，对于大肠杆菌的遗传背景，已经研究得相当透彻。 大肠杆菌具有天然的质粒，可以作为目的基因（或者说是外源基因）的载体，目前基因操作的条件也非常成熟和完善。因此，科学工作者既能借助大肠杆菌的繁殖而大量复制目的DNA，也能借助它表达出大量目的蛋白；既能在实验室里进行基因操作，也能进行工业化的发酵生产。 分子生物学实验中所使用的大肠杆菌，主要来自K12。常用菌株名称及其主要基因可以参见表1，至于选择什么样的菌株，必须根据实验目的和载体种类进行选择。 表1. 常用大肠杆菌菌株及其主要基因型 菌株 recA F’ sup mcrA/BC EcoK 特征 HB101 - - supE +/- r-m- 用于一般的转化实验 JM109 - + supE -/+ r-m+ 能进行蓝白斑筛选 DH5 - - supE -/+ r-m+ 能进行蓝白斑筛选 转化率高 BL21 (DE3) + - + +/+ r-m- 用于外源基因的表达蛋白酶活性低 说明：recA：ATP依赖型DNA重组酶基因缺失，能稳定插入50bp以上重复DNA序列，对DNA转化有利；F’：具有重组的F因子，可作为M13噬菌体的宿主菌；supE（琥珀突变抑制因子）：表达的阻遏蛋白与终止密码子UAG结合，使蛋白合成终止，其缺失体不能表达阻遏蛋白，即使遇到UAG，蛋白质仍能继续合成，并将UAG编码成谷氨酰胺；mcrA、mcrBC：特异性地切割外源DNA甲基化序列的限制性内切酶基因，进行高等动植物基因组DNA操作时使用其缺失体菌株；EcoK：参与限制与修饰系统，若想避免限制反应，使用其突变体菌株。 （2）大肠杆菌的培养 大肠杆菌繁殖速度快，每二十分钟就能产生新的一代，其最适生长温度为37℃。在实验室培养大肠杆菌的培养基，主要是LB（Luria-Bertani）培养基，可以是液体状态，也可以是固体状态（采用适量的琼脂粉即可实现液体培养基的固化）。 液体培养是在三角瓶或各种型号的离心管中，放置于适当转速的摇床上进行，转速通常为220rpm（rpm是“每分钟转数”的意思）。固体培养是在含有LB固体培养基的培养皿（简称LB平板）中进行，不需要转动培养，而只要静置于37℃的恒温箱或摇床中即可。 需要注意的是，适合于大肠杆菌的生长环境，也适合于杂菌（即非相关微生物）的生长，因此，培养大肠杆菌所用的器皿和试剂必须经过严格的灭菌，接种过程也必须在经过紫外线灭菌的超净台上进行，最好还要打开酒精灯，以鼓吹热风排除杂菌。当然，还可以根据大肠杆菌中所含质粒的特性（即含有编码破坏某种抗生素的蛋白质或酶的抗性基因），选择相应的抗生素加入培养基，抑制杂菌的生长（通常的杂菌是不含有抗性基因的）。 （3）大肠杆菌的保存 大肠杆菌的保存，可以分为短期保存和长期保存两种。 在实验中，大肠杆菌暂时不用时，可以选择短期保存。液体培养基中的菌体，可以在4℃冰箱中保存几个星期，但菌体往往沉淀在离心管管底，取出时需要混匀。固体平板上的菌落，能在4℃冰箱中保存更长的时间，为避免杂菌的污染，可以用封口膜把平板密封起来；另外平板还必须倒置，以免形成的水滴在各单菌落之间游走，使之在一定程度上相互混合。 如果某种大肠杆菌一时不用，可以选择长期保存，一般保存在-70℃冰箱中。但是在这样极低的温度下，液体培养基中的水分能够形成冰晶体，破坏细胞膜，导致大肠杆菌死亡。为了避免这种冰晶体的形成，可以在液体培养基中加入适量经灭菌的70%甘油，使之终浓度为15%左右。 经过这种方法处理的菌，可以叫做“甘油菌”。在使用时，可以从里面吸取一定的体积，转入新鲜的培养基中进行培养，这个过程叫做“复活”。但是在实践中发现，冻存的甘油菌接种到新鲜的液体培养基后，往往不容易存活。对此，比较可靠的方法是，用接种环将甘油菌接种到LB平板（含有相应的抗生素或者没有抗生素）上进行固体静置培养，然后重新挑取单菌落转为液体培养。 2、质粒及其提取方法 （1）质粒 细菌质粒（plasmid）是存在于细菌基因组之外的遗传物质（见图3），大多数为环形双链DNA分子，大小约为1kbp-200kbp。质粒既可以游离于细菌基因组之外，又可以在一定条件下可逆地整合到细菌基因组中。 质粒能够在细菌中自主复制，并且随着细菌的繁殖而分配到子代细菌中。这种自主复制既跟自身的序列相关，同时又受到宿主菌基因组的控制。根据宿主菌中所含质粒拷贝数的多少，可以将质粒分为两种不同的类型，一种是严紧型质粒（stringent plasmid），在每个宿主菌中仅含有1-3个拷贝，另一种是松弛型质粒（relaxed plasmid），在每个宿主菌中可含有高达10-60个拷贝。一般来说，接合型质粒（能够自我迁移）属于严紧型质粒，而非接合型（不能自我迁移，如要迁移必须依赖于其他能够自我迁移的质粒）属于松弛型质粒。 质粒常常含有某种抗生素抗性基因。抗生素主要是通过与核糖体的某个亚基结合而阻断蛋白质的合成（如卡那霉素、氯霉素、链霉素、四环素），或干扰细胞壁成分的合成（如氨苄青霉素），从而抑制细菌的生长。而抗生素抗性基因的编码产物，可以对抗生素进行适当的修饰（如卡那霉素、氯霉素、链霉素的抗性基因产物），甚至直接破坏抗生素的结构（如氨苄青霉素抗性基因产物），从而使之失活，解除抗生素对细菌生长的抑制。有些抗生素抗性基因的编码产物（如四环素抗性基因产物）可以影响细胞膜结构，阻止抗生素的转运，从而避免抗生素对细菌的毒害。几种常用抗生素的作用方式及其抗性基因的作用机理详见表2。细菌基因组本身不含有抗生素抗性基因，但是由于具有某种质粒，而可以获得对相应抗生素的抗性。这对于重组质粒DNA分子的筛选是极为有利的。 大肠杆菌也有天然的质粒（如pSC101、ColE1），这样的天然质粒可以作为载体（vector）使用，为基因操作提供了极大的便利。但是这些天然质粒具有很大的局限性，限制性酶切位点十分有限，而且分子量较大，拷贝数较低，不具有两种抗生素抗性基因，不利于基因操作。 因此，我们必须对天然质粒进行适当的改造，采用高拷贝数质粒的复制相关序列，消除不必要的序列以减小分子量，消除限制性酶切位点，而且引入更多的限制性酶切位点，形成一段所谓的“多克隆位点”的序列，同时引入两种抗生素抗性基因，或者引入基于-半乳糖苷酶的蓝白斑筛选系统等。作为基因工程载体的质粒，应具有这些主要元件（见图4）。经过这些改造，天然质粒就转变为具有良好应用价值的人工质粒（载体），常用的人工载体有：pBR322（见图5）、pUC18/19（见图6）等。 表2. 常用抗生素及抗性基因作用机制 抗生素 抗生素作用方式 抗性基因作用机制 氨苄青霉素（Amp） 干扰细胞壁合成， 抑制细胞生长 编码-内酰胺酶，切割-内酰胺环使Amp失活 卡那霉素（Kan） 同核糖体70S亚基结合， 导致错读mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶，修饰Kan使之不能结合 氯霉素 （Cml） 同核糖体50S亚基结合， 干扰蛋白质合成 编码乙酰转移酶，使Cml乙酰化而失活 链霉素 （Sm） 同核糖体30S亚基结合， 导致错译mRNA 编码蛋白，修饰Sm使之不能与30S亚基结合 四环素 （Tet） 同核糖体30S亚基结合， 抑制蛋白质合成， 抑制细胞生长 编码蛋白，修饰细菌的膜结构，阻止Tet转运到细胞内 （2）质粒DNA的提取方法 质粒DNA仅占宿主菌总DNA的1-2%，而且化学结构与宿主菌的基因组DNA并没有什么差别，因此质粒DNA的分离纯化技术建立于两者在高级结构上的差别。研究表明，在宿主菌裂解及DNA的分离纯化过程中，大分子量的宿主菌基因组DNA容易发生断裂，形成大小各异的线性DNA片段，而质粒DNA则由于分子量较小、结构紧密，仍能够保持完整状态，这种差别为质粒DNA的分离纯化提供了依据。 质粒的提取，可以是大量提取，也可以是微量提取，这主要根据操作时所需用量。提取质粒DNA的方法主要有氯化铯-溴化乙锭（CsCl-EB）密度梯度离心法和SDS碱裂解法（也称碱变性法）。下面对它们的原理作简单介绍。 CsCl-EB密度梯度离心法：溴化乙锭（EB）具有与碱基类似的平面结构，能够镶嵌到DNA分子内部的碱基之间。细菌基因组的线性DNA片段和开环的质粒DNA分子（open circular DNA，ocDNA），都具有游离末端，当EB嵌入时，双螺旋结构容易发生解旋，这样就可以镶嵌进大量的EB分子。而质量完好的质粒则是共价闭合环状DNA分子（covalently closed circular DNA，cccDNA），以超螺旋的形式存在，仅能镶嵌进少量的EB分子。这样，结合有EB分子的细菌基因组的线性DNA片段和开环的质粒DNA分子，其密度就比与结合有EB分子的共价闭合环状的质粒DNA分子更高。氯化铯密度梯度离心后，用紫外线照射观察，EB分子可以发出橙黄色的激发光，那么不同的DNA分子将在离心管中的不同部位呈现出橙黄色的光带，用注射器插入离心管中相应条带，就可以获得实现高质量高纯度的质粒DNA。但是由于CsCl-EB密度梯度离心法操作步骤比较烦琐，而且EB的价格昂贵，还具有致癌嫌疑，因此，在一般的分子生物学实验中，通常不使用这种方法，而采用便宜、便捷的碱裂解法。 SDS碱裂解法：溶菌酶能破坏细菌的细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）和Triton X-10（曲拉通）等能破坏细菌的细胞膜，使细菌基因组的DNA片段（基因组DNA的分子量很大，容易受到核酸酶的攻击和机械力的破坏而断裂成大小各异的线性DNA片段）和分子量较小的质粒DNA释放到溶液中。紧接着的问题就是要使质粒DNA从细菌基因组的DNA片段中分离出来。在碱性条件下（pH12.0-12.5），细菌基因组的DNA片段发生变性，配对的氢键断裂，当溶液中加入酸后，其复性速度比较慢，而且由于复性的不精确，容易聚集成网络状结构，其分子量很大，在离心过程中会与细胞随片、变性的蛋白质和RNA等一起沉淀下来。而质粒DNA在碱性条件下也发生变性，配对的氢键断裂，但由于存在拓扑学的问题，DNA分子的两条互补链仍然相互缠绕在一起而没有分裂，因而在加入酸中和之后能够迅速、精确地复性，从而稳定地溶解在溶液中。到这里，我们就可以利用异丙醇或冰冻的无水乙醇将质粒DNA从溶液中沉淀出来了。SDS碱裂解法成本低，操作简便，是实验室提取质粒DNA最常用的方法。 还有一种常用的方法就是柱式抽提法，需采用商业公司的试剂盒（kit）。从大同小异的试剂的配方中我们可以看出，柱式抽提法的基本原理与碱裂解法相同，只是在最后的操作中，不是用异丙醇或冰冻的无水乙醇将质粒DNA从溶液中沉淀出来，而是利用能够结合DNA的硅胶膜柱子结合质粒DNA分子，可用70%酒精比较方便地离心清洗，再用灭菌水或TE溶液将质粒DNA溶解，最后进行离心收集，就得到了纯度较高的质粒DNA。 3、​ 质粒DNA浓度与纯度的检测 （1）质粒DNA浓度的检测 紫外分光光度计的构造及工作原理见图7。 在紫外线照射下，核酸（包括DNA和RNA，涉及G、A、T、C、U五种碱基）在260nm处有强吸收峰，并且吸光值（OD值）与溶液中溶质的浓度成正比，因此可以根据溶液的吸光值来计算溶液中溶质的浓度。由吸光值计算各种核酸分子浓度的粗略公式如下（浓度单位为g/mL）： [dsDNA]（双链DNA）= 50（OD260-OD310）稀释倍数 [ssDNA]（单链DNA）= 33（OD260-OD310）稀释倍数 [ssRNA]（单链RNA）= 40（OD260-OD310）稀释倍数 糖类也具有紫外吸收，以上公式排除了糖类物质的干扰。当核酸纯度较高时，即OD260/OD280 =1.8~2.2（参见“质粒DNA纯度的检测”）时，吸光值OD260=1，相当于： [dsDNA]（双链DNA）= 50 g/mL [ssDNA]（单链DNA）= 40 g/mL [ssRNA]（单链RNA）= 40 g/mL [ssoligo]（单链寡核苷酸）= 33 g/mL 由于RNA在260nm处也有强吸收峰，因而最好在提取质粒DNA的溶液I中加入适量的RNase，以消化溶液中存在的RNA。当然，也可以留在随后对质粒DNA的操作时消除，但为了更加准确地估计质粒DNA的浓度，宜将RNA先行消除。 实际上，糖类、蛋白质，以及纯化DNA时所用试剂中的苯酚、EDTA也具有紫外吸收，会引起定量的不准确。尤其是苯酚，有很强的紫外吸收，定量时需要特别注意。 （2）质粒DNA纯度的检测 核酸在260nm和280nm波长下都具有一定的吸光值，对于高纯度的核酸，OD260/OD260是固定的，因此，我们可以用OD260/OD280来估计质粒DNA的纯度。 OD260/OD280 =1.8~2.2：纯度较高 OD260/OD280 >2.2：可能有RNA污染 OD260/OD280 <1.8：可能有蛋白质污染 RNA、蛋白质污染，容易影响限制性内切酶的酶切效率，必要时需对质粒DNA进一步纯化，甚至重新提取高纯度的质粒DNA。 检测质粒DNA纯度，一个比较直观的方法，就是进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，在紫外灯下观察。如果在凝胶中观察到自上而下的拖带（称为“smear”），则说明质粒DNA溶液中存在RNA污染，如果在加样孔中观察带亮带，则说明存在蛋白质污染。另外，利用琼脂糖凝胶电泳，还可以根据超螺旋质粒DNA对应条带的亮度，鉴定质粒DNA的完整性。 三、实验材料 1、生物材料 大肠杆菌DH5菌株，含有pUC18载体。 2、主要试剂 （1）用于细菌培养：LB固体培养基，LB液体培养基，氨苄青霉素（100mg/mL）； （2）用于质粒DNA提取：RNAseA（10mg/mL），溶液I，溶液II，溶液III，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，70%乙醇，TE溶液，无菌水等。 3、主要仪器 微量移液器，超净工作台，制冰机，高速离心机，加热块，紫外分光光度计，石英比色皿，冰箱等。 四、实验内容 1、SDS碱裂解法提取质粒DNA （1）培养细菌：将含有pUC18的大肠杆菌涂布于加有氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB平板，37℃下静置培养12-16h；挑取单菌落于3mL含氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养15-18h。 注意：用于提取质粒DNA的菌液已由实验指导员准备好。 （2）取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，8000rpm离心30sec，用微量移液器弃尽上清。 注意：本实验中所使用的离心管和移液枪头必须经过灭菌处理。 （3）如果菌量过少，可再取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，8000rpm离心30sec，用微量移液器弃尽上清。 （4）加入100 μL溶液I（冰上预冷），用微量移液器反复吸打使细胞重悬，冰上放置3min。 注意：①实验前将溶液I需放在冰上预冷；②添加适量RNAse A到溶液I，以降解RNA。 （5）加入200 μL溶液II（现配），上下颠倒离心管使之混匀，冰上放置3min。 注意：溶液II必须在使用前配制，即现配现用，且不能放在冰上或冰箱中。 （6）加入150 μL溶液III（冰上预冷），上下颠倒离心管使之混匀，冰上放置3min。 注意：实验前将溶液III放在冰上预冷。 （7）13000rpm离心20min，小心吸取400μL上清液至新的1.5mL离心管。 注意：尽量不用吸到白色杂质，否则会影响质粒的纯度。 （8）加入200μL酚和200μL氯仿:异戊醇（24:1），盖紧离心管，用力摇动30sec，室温放置5min后，13000rpm离心10min，将上清液小心转移至新的1.5mL离心管。 注意：①相当于加入1倍体积的酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），其中使用的酚为碱性酚，pH值约为7.8； ②此步骤被称为抽提，用于去除混杂在核酸中的蛋白质；吸取上清时必须小心，切勿惊动下面的蛋白层；③此步骤也可以省略不做。 （9）加入1倍体积的异丙醇，上下颠倒离心管使之混匀，室温放置10min。 （10）13000rpm离心10min，用微量移液器弃尽上清。 注意：小心弃上清，切勿吸走沉淀物。 （11）加入500μL 70%乙醇，上下颠倒洗涤，13000rpm离心5min，用微量移液器弃尽上清。 注意：小心弃上清，切勿吸走沉淀物。 （12）60℃加热块上加热干燥5-10min，加入适量（30μL）经灭菌的TE溶液，轻弹管底，放置在60℃加热块上5-10min，促进质粒DNA充分溶解。 注意：可在TE溶液中加入适量RNAse A，以进一步去除RNA污染。 2、柱式抽提法提取质粒DNA 该方法使用上海申能博彩公司的试剂盒提取质粒DNA，试剂盒名称为“3S柱离心式质粒小量快速抽提试剂盒（3S Spin Plasmid Miniprep Kit）”，具体操作如下： （1）将过夜培养的2mL细菌高速离心1min，彻底去除上清。 注意：低拷贝数质粒可使用5mL细菌，而无需提高Solution I、II、III的用量。 （2）加入100uL Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。 注意：Solution I中含有RNase A，每次实验结果后放于4℃冰箱中保存。 （3）加入200uL Solution II，立即上下颠倒或用手轻弹管底，使细菌裂解，室温放置2min左右至溶液变成澄清。 注意：①每次使用该试剂盒时，必须提前查看Solution II，因为在温度较低的情况下，Solution II 中会出现白色沉淀，需37℃以下保温溶解，摇匀后再使用；②步骤（2）、（3）在冰上操作效果更好。 （4）加入400uL Solution III，立即上下颠倒5-10次，使之充分中和，室温放置2min。 （5）13000rpm离心15min。 注意：①无需低温离心；②提高转速可使沉淀更紧密，有利于随后上清吸取。 （6）取出2mL样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，用移液枪将步骤（5）中的上清全部转移到3S柱中，室温放置2 min，12000rpm离心1min。 （7）取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入700uL Wash Solution，高12000rpm离心1min。 注意：首次使用Wash Solution时，必须加入50mL无水乙醇，以后不用再加。 （8）重复步骤（7）一次，进一步去除杂质。 （9）取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，12000rpm离心2min，去除少量残存的液体。 注意：此步骤非常重要，一定要做，否则残液中的乙醇会影响质粒DNA的溶解。 （10）将3S柱转入灭菌的1.5mL离心管中，在3S柱膜中央加入已预热到60℃的50uL TE溶液或无菌水，静置2min，12000rpm离心1min，收集质粒DNA溶液。 注意：①预热的TE溶液或无菌水必须加到膜中央，否则无法溶解质粒DNA；②加入TE溶液或无菌水时不能用枪头戳膜，以免破坏膜而影响质粒DNA的回收；③加入TE溶液或无菌水后，最好静置于60℃的加热块或水浴锅中，以提高质粒DNA的洗脱效率；④用无菌水吸脱时效率稍低，但质粒DNA用于测序时，必须用无菌水吸脱。 3、质粒DNA浓度与纯度的检测 （1）提前30min打开紫外分光光度计。 （2）在1.5mL离心管中加入1mL蒸馏水，再加入1μL质粒DNA溶液，上下颠倒离心管混匀，作为待测液，其余质粒DNA溶液放于-20℃冰箱中保存备用。 （3）取200μL待测液于石英比色皿，在另一个石英比色皿中加入200μL蒸馏水作为对照。 注意：在紫外区检测时，必须使用石英比色皿。 （4）将对照比色皿放入紫外分光光度计，在260nm处校零，取出后放入样品比色皿，直接读取样品溶液在260nm处的吸光值，即A260值。 （5）将对照比色皿放入紫外分光光度计，在280nm处校零，取出后放入样品比色皿，直接读取样品溶液在280nm处的吸光值，即A280值。 （6）用蒸馏水清洗样品比色皿，关闭紫外分光光度计。 （7）根据A260值计算样品溶液中质粒DNA的浓度，并根据A260/A280的比值估计质粒DNA的纯度。 五、思考题 1、​ 试解释碱裂解法提取质粒DNA的原理。 2、​ 作为载体，质粒DNA上有哪些元件？ 3、​ 质粒DNA在分子生物学操作中有何应用价值？ 实验三 PCR技术扩增目的基因 一、实验目的 ①掌握PCR技术的原理和方法； ②掌握琼脂糖凝胶电泳的方法。 二、实验原理 1、PCR技术的原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction），简称PCR，由Mullis于1985年创立，1987年获得专利，1989年被美国著名《science》杂志列为十项重大科技发明之首，1993年获诺贝尔化学奖。如今，PCR技术已成为分子克隆工作中必备的基本技术之一，并广泛渗透到医学分子基因诊断、法医、考古学等诸多领域。可以说PCR技术的发明给整个生命科学都带来了一场革命，同时也为目的基因的快速克隆提供了一种非常有效的手段。 PCR的基本原理如图8所示。 利用PCR技术可以在短时间内于试管中获得数百万、甚至数十亿个特异DNA序列的拷贝。它实际上是根据待扩增的目的DNA的两侧序列 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 一对特异性引物（正向引物和反向引物），在 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA以及四种脱氧核糖核酸（dNTPs）底物存在的条件下，由Taq DNA聚合酶所引导催化的扩增DNA的酶促反应。 PCR由三个基本反应组成（见图9）：①高温变性（denaturation）：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成两条单链DNA。②低温退火（annealling）：使温度适当下降，引物与模板DNA中所要扩增的目的序列的两侧互补序列进行特异性配对结合，重新形成氢键。③适温延伸（extension）：在Taq DNA聚合酶、4种dNTPs及Mg2+存在下，引物3’端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。以上变性、退火和延伸便构成一个热循环，每一次循环的产物均可作为下一次循环的模板，经过约25-30次循环之后，也即经过数小时之后，介于两引物间的目的DNA片段便可扩增105-107拷贝。 由此可知，我们可以利用目的基因两侧的核苷酸序列，设计一对和模板互补的特异性引物，十分便捷地以基因组DNA、mRNA或已克隆在某一载体中的基因为模板扩增出所需的目的基因片段。如以真核生物总RNA为模板则可获得无内含子及不带调控序列的结构基因。此外，通过在引物的5’末端添加额外的与模板不互补的所需的DNA序列，如限制性酶切位点、起始密码子、核糖体结合位点、启动子、终止密码及终止子等，便可以将其引入目的基因中，从而方便进行目的基因的克隆、表达与调控研究。 2、影响PCR的因素 影响PCR的因素很多，概括起来主要包括引物、模板、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶、温度循环 参数 转速和进给参数表a氧化沟运行参数高温蒸汽处理医疗废物pid参数自整定算法口腔医院集中消毒供应 等几个方面： （1）引物。引物在整个PCR扩增体系中占有十分重要的地位，为了提高扩增效率和特异性，在设计引物时，一般应遵循下列原则：①引物长度以15-30个核苷酸为宜，引物过短会使PCR的将异性降低，过长则成本增加，而且也会降低特异性；②碱基应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象，引物G+C含量应在45-55%左右；③引物内部无发夹结构，这种结构在引物3’端尤其应当避免，同时两引物间应尽量避免出现二聚体，因为一旦出现二聚体，引物就不能很好地与DNA模板结合，尤其在引物3’端不应有2个以上碱基互补；④在引物5’端可加上限制性酶切位点，以便对扩增产物进行酶切和克隆操作（见图10）。 （2）模板。单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）以及由RNA反转录成的cDNA均可作为PCR模板。模板DNA可是线性分子，也可是环状分子，然而前者略优于后者。PCR对模板DNA纯度要求不严，样品可以是粗提物，但不可混有任何Taq DNA聚合酶的抑制剂、核酸酶、蛋白酶和能结合DNA的蛋白质。另外，尿素、SDS、甲酰胺等也会严重影响PCR反应效率，应尽量避免或消除这些不利因子的出现。由于PCR的灵敏性，在实验操作中应尽量避免交叉污染。 （3）Mg2+浓度。Taq DNA聚合酶是一种Mg2+依赖酶，因此，反应体系中必须有Mg2+存在，然而保持适当的Mg2+浓度十分重要，因为Mg2+浓度过高或过低均合影响引物与模板的结合、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的形成以及酶的活性与精确性。 （4）Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶来自于水生嗜热菌，能在PCR过程中耐高温，正是有了这种耐高温的DNA聚合酶，PCR的自动化才得以实现。在PCR反应体系中，Taq DNA聚合酶的添加量必须适当，如果酶两过高，会增加非特异性扩增产物的产量，而酶量过低则又会降低PCR产物的产量。普通的Taq DNA聚合酶不具备3’端→5’端的核酸外切酶活性，在DNA的合成过程中也就不具备纠错功能，会以一定频率将错误碱基渗透到DNA新生链中，这种现象对基因的功能研究极为不利。因此，为了保证PCR产物的正确性，可以采用具有纠错功能的高保真的DNA聚合酶，如Pfu DNA聚合酶等（见图11）。 （5）温度循环参数。PCR反应涉及变性、退火、延伸三个不同温度及时间。双链DNA的变性条件一般为94℃，3分钟，温度过高、时间过长都会降低Taq DNA聚合酶的活性，破坏dNTP。退火温度和时间取决于引物的碱基组成、长度、引物与模板的匹配程度以及引物的浓度，典型的退火条件为50℃，1-1.5分钟。延伸温度一般为72℃，接近Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃，延伸时间与待扩增的DNA片段长度有关，一般1kb以内的片段，延伸时间为1分钟，如扩增片段更长，则可适当延长时间。最后一次热循环之后，外加一段延伸时间，一般延伸5-10分钟，以使所有PCR扩增产物能够合成完全。这些参数确定后，PCR的循环次数主要取决于模板DNA浓度，一般以循环25-35次为宜，循环次数过多会使PCR产物的内部序列出现严重的错误，且非特异性产物的产量也会大大增加。 3、琼脂糖凝胶电泳 （1）琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增是否成功、效果如何，需要用一定的方法进行检测，这主要依赖于凝胶电泳技术。凝胶电泳，是借助一定孔径的介质分离不同分子量大小的DNA或蛋白质的重要技术。根据凝胶介质的成分，常见的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。这里仅介绍琼脂糖凝胶电泳。 琼脂糖是从海藻中提取的琼脂中进一步纯化出来的高聚物，主要是由D-半乳糖和3，6脱水L-半乳糖连接而成的线性多糖。琼脂糖加入电泳缓冲液中（浓度通常为0.8-3%），加热后融化，在室温下冷却凝固，这时琼脂糖以分子内和分子间的氢键形成较为惰性的交联结构，也就是多孔性的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的孔径取决于凝胶中琼脂糖的含量，当琼脂糖浓度低，凝胶孔径就大，琼脂糖浓度高，凝胶孔径就小。 DNA在琼脂糖凝胶中的电泳，涉及电荷效应和分子筛效应。在微碱性的电泳缓冲液中，DNA分子中的磷酸基因发生解离，带有电量的负电荷，能在电场中向正极迁移，这就是所谓的“电荷效应”。由于一定浓度的琼脂糖凝胶具有一定的孔径大小，不同分子量大小的DNA分子，在凝胶中迁移时受到的空间位阻是不同的，分子量小的DNA分子，受到的空间位阻小，在凝胶中的迁移速度快，而分子量大的DNA分子，所受到的空间位阻大，在凝胶中的迁移速度就慢，这样经过一定时间的电泳，不同分子量大小的DNA分子就得以分离，这就是所谓的“分子筛效应”。在一定范围内，随着琼脂糖浓度的提高，凝胶电泳的分辨率也会提高，我们可以根据具体的实验对象选择适当的琼脂糖凝胶浓度（见表3）。 表3. 琼脂糖凝胶的分辨率 凝胶浓度 分辨率（分离范围） 应用 0.5% 1,000-30,000 bp 未消化的基因组DNA 0.8% 800-12,000 bp 消化的基因组 DNA 1.0% 500-10,000 bp 质粒 DNA 1.2% 400-7,000 bp PCR产物和质粒 DNA 1.5% 200-3,000 bp PCR产物和质粒 DNA 2.0% 100-1,500 bp PCR产物 （2）琼脂糖凝胶的染色与观察 经过一段时间的电泳之后，不同分子量大小的DNA分子已经相互分离，但是DNA分子在凝胶中无色无味，要想肉眼观察到，就必须借助一定的染色技术，即采用EB（溴化乙锭）染色。前面已经介绍过，EB具有跟DNA中的碱基类似的平面结构，能够镶嵌到碱基对之间（见图12）。在紫外灯的照射下，DNA所吸收的260nm的紫外光传递给EB，以及EB本身在300nm、360nm吸收的射线，在可见光谱的红橙区都将以590nm波长发射出来。这样，就能够在紫外灯下观察到凝胶中DNA所在区域的条带（见图13）。 根据电泳后DNA条带的相对位置，可以估计出DNA的大小。我们可以在DNA样品电泳的同时，在相邻泳道加入DNA分子量标准物，即所谓的“DNA Marker”。DNA Marker在凝胶中电泳后呈现出多个DNA条带，每个DNA条带有着固定的长度，这样根据目的DNA条带