酶反应动力学

nullnull 第三章 酶催化反应动力学 第一节   酶催化反应的基本特征 第一节   酶催化反应的基本特征 酶是生物提高其生化反应效率而产生的生物催化剂，其化学本质是蛋白质。 在生物体内，所有的反应均在酶的催化作用下完成，几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密联系。 生物酶分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。 一、酶的催化共性 一、酶的催化共性 酶参与生物化学反应，它能降低反应的活化能（分子参与化学反应时所需要的最低能量），加快生化反应的速率，但它不改变反应的方向和平衡关系，即它不能改变反应的平衡常数，而只能加快反应达到平衡的速率；酶在反应过程中，其主体结构和离子价态可以发生某种变化，但在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复到原来状态。 二、酶的催化特性 二、酶的催化特性 （1）较高的催化效率 （2）很强的专一性 （3）具有温和的反应条件 （4）易变性与失活 null 酶活力表示方法 酶的分子活力：在最适宜条件下，每1mol酶在单位时间内所能催化底物的最大量（mol） 酶的催化中心活力：在单位时间内，每一个酶的催化中心所催化底物的量（mol） 酶活力：在特定条件下，每1min能催化 1mol底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶单位，或称为国际单位，用U表示。酶活力还可用比活力表示。比活力系指每1mg酶所具有的酶单位数，用U/mg表示。 很强的专一性 很强的专一性 酶催化反应有很高的选择性，一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质进行某一种反应，这种特性称为酶的专一性或选择性。 null绝对专一性 ：一种酶只能催化一种化 合物进行一种反应 。 相对专一性：一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应 。 底物专一性 ：一种酶只能催化一种底物。 立体专一性：一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种 。 第二节 简单的酶催化反应动力学第二节 简单的酶催化反应动力学简单的酶催化反应动力学是指由一种反应物(底物)参与的不可逆反应。属于此类反应的有酶催化的水解反应和异构化反应。这种简单的单底物酶反应动力学，是酶反应动力学的基础。 null一、Michaelis-Menten 方程 方程推导三点假设(平衡假设 )： ①与底物浓度[S]相比，酶的浓度[E]是很小的，因而可忽略由于生成中间复合物[ES]而消耗的底物。 ②不考虑这个逆反应的存在。若要忽略该反应的存在，则必须是产物P为零，换言之，该方程适用于反应的初始状态。 ③认为基元反应的反应速率最慢，为该反应速率的控制步骤。而这一反应速率最快，并很快达到平衡状态。 null对酶催化反应过程的机理，得到大量实验结果支持的是活性中间复合物学说，该学说认为酶催化反应至少包括两步，首先是底物S和酶E相结合形成中间复合物[ES]，然后该复合物分解成产物P，并释放出酶E。 例如：酶反应 其反应机理可表示为 null根据化学动力学，反应速率通常以单位时间、单位反应体系中某一组分的变量来表示。对均相酶的催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。 反应的速率可表示为 rs：底物S的消耗速率（mol/L﹒s） rp：产物P生成速率（mol/L﹒s） v：反应体系的体积（L） ns、np：底物S和产物P的物质量（mol） t：时间（s） null 根据质量作用定律，P的生成速率可表示为： 速率控制步骤在反应动力学中是一个重要的概念。在一个多步骤的反应体系中，其中反应速率最慢的一步称为速率的控制步骤，并且控制步骤的速率决定了该反应的速率。 null根据上述假定(3)，可列出 K S 为解离常数（mol/l） 反应体系中酶的总浓度 为 （）null 代入 得米氏方程或称M—M方程 rp,max：P的最大生成速率 [E0]：酶的总浓度，亦为酶的初始浓度 nullG．E．Briggs和J．B．Haldane对上述第三点假设进行修正，提出了“拟稳态”假设。 认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化。 消去 得 km：米氏常数(mol/l) nullkm与ks的关系为 由两种推导方法所得速率方程式形式基本相同，不同的是ks值代表反应的平衡常数，而km值称为米氏常数，它代表动态的平衡常数，表示实际的恒态时的浓率关系。 当 << 时，km值才接近于ks nullnullkm是酶的特征性常数，测定km值具有重要的意义。km值代表反应速率为最大反应速率一半时的基质浓度，其单位为浓度单位。 null km值是酶的一个很基本的特性常数，它和酶的浓度无关，但和温度、pH等因素有关。 根据km值可以推断酶和底物的亲和力。如果酶的专一性不高，可催化几种底物发生反应时，km值最小的就表示酶与这一底物的亲和力最大，反之，则最小。 null 据km值，可以估计胞内基质浓度，如 时， 。 那么只要稍微改变基质浓度， 的变化就很大，即反应速率对基质浓度改的敏感性很大。如果 或者 ，基质浓度相差1000倍，但反应速率只增加一倍，即在生理上保持 >> 是没有意义的。 null null从 ~[S]图的关系曲线可以看出，该曲线表示了三个不同的动力学特点的区域。 当 << ，即底物浓度比km值小很多时，该曲线近似为一条直线，这表示反应速率与底物浓度近似正比关系，此时酶催化反应可近似看作一级反应。 式中 为总反应的一级反应常数。 这是因为当km值很大时，大部分酶为 游离态的酶，而[ES]的量很少。若要 提高反应速率，只有通过提高[S]值， 进而提高[ES]，才能使反应速率加快。 因而此时的反应速率主要取决于底 物浓度的变化。 null 当 >> 时，该曲线近似为一水平线，表示当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。此时，酶催化反应可视为零级反应，反应速率将不随底物浓度的变化而变化。这是因为当km值很小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内游离的酶很少。所以即使提高底物浓度，也不能提高其反应速率。 ∴ 即 或 null 当[S]与km的数量关系处于上述两者之间的范围时，则符合M—M方程所表示的关系式。 二、酶动力学图解法 二、酶动力学图解法 要建立一个完整的动力学方程，必须通过动力学实验确定其动力学参数。对Michaelis-Menten方程，就是要确定rmax（或k+2）和km值。但直接应用Michaelis-Menten方程求取动力学参数所遇到的主要困难在于该方程为非线性方程。为此常将该方程加以线性化，通过作图法直接求取动力学参数。 1. 双倒数图解法（Lineweaver Burk图解） 1. 双倒数图解法（Lineweaver Burk图解） 将M—M方程取其倒数得到下式: 以 值对应于 作图： null双倒数法应用广泛，但有两个缺点： 1、选用基质浓度不宜等量增加，否则在作图时，点都会集中在纵轴附近，难于正确作图。基质浓度以选用1.0、1.11、1.25、1.43、1.67、2.0、2.5、3.33，5和10等为宜，这样倒数值几乎是等量递增的。 2、反应速率测定稍有误差，其倒数值误差必将扩大，特别是在低浓度基质测定时，引起的误差更大，这样将影响直线斜率，影响 rmax及Km值 的测定。 2. 图解法（Hanes Woolf图解） 2. 图解法（Hanes Woolf图解） 将M—M方程变换成下式: 以 为纵坐标， 为横坐标，此方程为一直线方程，直线斜率为 ，与纵轴交点为 ，与横轴交点为 。 3. 图解法（Woolf- Augustinesson Hofstee图解） 3. 图解法（Woolf- Augustinesson Hofstee图解） 将M—M方程变换成下式: 上式为直线方程式，r为纵坐标， 为横坐标，直线的斜率为 ，与纵坐标交于 ，于横坐标交于 ，根据直线与两坐标的交点可求出 及 值，但在选用基质浓度时，也须注意，要在 值的附近。 4. 图解法（Eadle Scatchard图解） 4. 图解法（Eadle Scatchard图解） 将M—M方程变换成下式: 此直线方程式，斜率为 ，与 坐标于 ，与r坐标交于 。 5. Henri Michaelis Menten积分方程式 5. Henri Michaelis Menten积分方程式 有时在酶反应过程中，基质或产物的浓度可以测得，但反应初速度则难以测定。这时，就可选用积分方程式来测定酶的 及 值。 null 式中：[S]为时间t时的基质浓度([S]0-[P]), ([S]0-[P])为时间t内所用去的基质浓度，也为时间t内所生成的产物浓度[P]。 上式可改写为 : 上式也是直线方程式，斜率为 ，直线交点于纵坐标 ，与横坐标交于 。 null第三节　有抑制的酶催化反应动力学   在酶催化反应中，由于某些外源化合物的存在而使反应速率下降，这种物质称为抑制剂。 抑制作用分为可逆抑制与不可逆抑制两大类。 如果某种抑制可用诸如透析等物理方法把抑制剂去掉而恢复酶的活性，则此类抑制称为可逆抑制，此时酶与抑制剂的结合存在着解离平衡的关系。 如果抑制剂与酶的基团成共价结合，则此时不能用物理方法去掉抑制剂。此类抑制可使酶永久性地失活。例如重金属离子Hg2+”、Pb2+”等对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶的抑制都是不可逆抑制。 null 根据产生抑制的机理不同，可逆抑制分为: 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 底物抑制。 null一、竞争性抑制动力学 若在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制，该物质称为竞争性抑制剂。其主要特点是，抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。在琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。 null式中：I为抑制剂；(EI)为非活性复合物。 底物的反应速率方程为 : 又： null经整理后可得 KI—抑制剂的解离常数 （mol/l） KmI—有竞争性抑制时的米氏常数（mol/l） 可以看出，竞争性抑制动力学的主要特点是米氏常数值的改变，rmax不受竞争性抑制剂的影响。由于有抑制剂的存在，须有较高的基质浓度，才能维持一定的rmax值。 null 竞争性抑制动力学的主要特点： 竞争性抑制剂的抑制程度取决于[S]，[I]，Km和KmI，当[I]增加，或KI减小，都会使KmI值增大，使酶与底物的结合能力下降，活性复合物减少，因而使底物反应速率下降。若[I]不变，增加[S]，抑制程度降低；若[S]不变，增加[I]，抑制程度增加。在一定的[S]和[I]条件下，KI值越低，抑制程度越大。 null竞争性抑制的r-s关系图：null 竞争性抑制的双倒数方程式 或 null 以 对 作图，得一直线，其斜率为 ，与纵坐标的交点为 ，与横坐标的交点为 。 null 又 以KmI对[I]作图，据此图可求出Km和KI值 竞争性抑制的KI与I关系图 null抑制剂的解离常数 由此可看出，KI愈小，表明抑制剂与酶的结合力愈强，对酶催化反应能力的抑制作用就越强。 当酶的活性部位与一个抑制剂分子相结合时，KmI与[I]的关系为一直线，可称为线型竞争抑制；如果酶的活性部位与两个以上的抑制剂分子相结合，则关系为一抛物线，可称为抛物线型竞争抑制。 null二、非竞争性抑制动力学 若抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制。此时抑制剂既可与游离的酶相结合，也可以与复合物ES相结合，生成了底物—酶—抑制剂的复合物SEI。绝大多数的情况是复合物SEI为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。还有一种是三元复合物SEI也能分解为产物，但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶的抑制属于非竞争性抑制。 null 非竞争性抑制的普遍机理式可表示为   null 式中： 为非竞争性抑制时的最大反应速率。 null 对非竞争性抑制，由于抑制剂的作用使最大反应速率降低了 倍，并且增加[I]、KI减小都使其抑制程度增加。此时rSI对[S]的关系如图。 null根据L—B作图法，上式可整理成 或 以 作图，可得一直线，并求出Km和 rI,max值。 null 又根据式 可通过实验测得不同[I]下rI,max的，进而确定KI值。 null 如果SEI也能分解为产物， 同样可整理出形式与 类似的速率方程式，所不同的只是rI,max所包含的参数上。如何判断复合物SEI是否分解为产物，可通过改变抑制剂用量并测定底物的反应速率来判断。当[I]增加到某一程度，rSI减小直至趋于0，则为SEI不能分解为产物；如果随着[I]的增加，rSI趋于一定值，则SEI能分解为产物。 null 非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点是：对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂的影响可减弱；而对非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。从这个意义上说，竞争性抑制作用是可逆的，非竞争性抑制作用是不可逆的。 null三、反竞争性抑制动力学   反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成SEI复合物。 null 据拟稳态假设和物料平衡，经整理后可得其速率方程为 式中： , , null以 rSI 对[S]作图 null据L—B作图法，方程为 四．底物的抑制动力学 四．底物的抑制动力学 有些酶催化反应，在底物浓度增加时，反应速率反而会下降，这种由底物浓度增大而引起反应速率下降的作用称为底物抑制作用。反应机理式为 null SES为不具有催化反应活性，是不能分解为产物的三元复合物。应用稳态法处理，可得到底物抑制的酶催化反应动力学方程为 其中：rSS为底物抑制的反应速率mol/l∙s Ks为底物抑制的解离常数mol/l null当底物抑制时，rss与S的关系表示在图中。 速率曲线有一最大值，即为最大底物消耗速率。相对应的底物浓度值可通过下式求出 在点（ ）处可微分且有极值，则 为最佳底物浓度