酸枣仁皂苷大孔树脂纯化工艺及HPLC_ELSD测定方法研究

[ 2] 袁昕蓉, 李强,毕开顺 � 气相色谱法测定伤湿祛痛膏中 4种挥发性成分的含量 [ J] �中药材, 2009, 32( 1): 144� 145� [ 3] 国家药典委员会 �中华人民共和国药典 [ S] �一部 �北 京:化学工业出版社, 2005: 附录 57� [ 4] 张荣, 郝晓芳 � 关节止痛膏中颠茄的薄层色谱鉴别 [ J] �中国药事, 2000, 14( 6) : 390� 收稿日期: 2010�04�12作者简介:王锋 ( 1986�) ,男,硕士研究生,研究方向:药物分析; T e:l 15088687623, E�m ai:l gudw@f 126� com。 * 通讯作者:王龙虎, Te:l 0571�88208621, E�m ai:l wang2000@ zjb� edu� cn。 酸枣仁皂苷大孔树脂纯化工艺及 HPLC�ELSD测定 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 研究 王 � 锋,刘雪松,陈 � 勇, 王龙虎* (浙江大学药学院,浙江 杭州 310058) � � 摘要 � 目的:采用酸枣仁皂苷 A、B双指标考察 D�101大孔树脂纯化酸枣仁皂苷工艺。方法: 用 HPLC�ELSD测 定酸枣仁皂苷 A、B含量, 并以此为指标,优化 D�101大孔树脂纯化酸枣仁皂苷的工艺参数。结果: 最佳纯化工艺确 定为:吸附流速 8 BV /h, 洗脱流速 4 BV /h,蒸馏水冲洗 3 BV, 70%乙醇洗脱 3 BV。两种酸枣仁皂苷洗脱率均达到 90%以上,精制率均达到 65%以上; 产品中酸枣仁皂苷 A、B含量之和为 7� 3%。结论: D�101大孔树脂纯化酸枣仁 皂苷工艺操作简便,效果显著, 工业化应用前景广阔。 关键词 � 大孔树脂; HPLC�ELSD;酸枣仁; 皂苷 中图分类号: R284� 2� � 文献标识码: A� � 文章编号: 1001�4454( 2010) 08�1343�04 � � 酸枣仁为鼠李科植物酸枣 [ Z iziphus jujuba M ill�var�sp inosa( Bunge) Huex H�F�Chou]的干燥成 熟种子, 有补肝、宁心、敛汗、生津之功效, 主治虚烦 不眠、惊悸多梦、体虚多汗和津伤口渴,为养心安神 首选 �1 。皂苷类化合物是酸枣仁中确定的药效成 分, 其中以酸枣仁皂苷 A、B为主。目前, 纯化酸枣 仁皂苷多采用乙醚脱脂、正丁醇萃取的传统方 法�2 , 较少采用安全性更高的大孔树脂。崔瑛及李 果等 �2, 3 研究了大孔树脂纯化酸枣仁提取物, 但都 采用准确率低的比色法测定皂苷含量,且纯化效果 仅提高 2~ 3倍,未完全体现大孔树脂选择性高、富 集效果好、使用周期长等优点 �4 。因此本研究建立 了 HPLC�ELSD精确测定酸枣仁皂苷 A、B含量的方 法, 进一步研究大孔树脂纯化酸枣仁皂苷的工艺条 件, 以确立最佳提取工艺。 1 � 仪器与试药 1�1 � 仪器 � 10AT高效液相色谱仪 (日本岛津公 司,配有蒸发光检测器 ), D�101大孔树脂 (杭州汇华 树脂公司 ) , 分析天平 (上海越平科学仪器有限公 司 ), N�1100型旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公 司 )。 1�2 � 试药 � 酸枣仁皂苷 A和 B对照品 (成都曼斯 特生物有限公司, 批号 A0274), 酸枣仁药材 (延安 常泰药业有限公司 ) , 经浙江大学药学院现代中药 所吴永江教授鉴定为鼠李科植物酸枣仁的干燥成熟 种子;甲醇 (天津四友精密化学制品有限公司, 色谱 纯 ) ,其余试剂均为分析纯。 2 � 方法与结果 2�1 � 含量测定方法 � 2�1�1� 色谱条件: 色谱柱: ZORBAX SB�C18 ( 4�6 mm ! 250 mm, 5 �m ); 流动相: 甲醇 �水 �冰醋酸 ( 70 ∀30∀0�1) ;流速: 0�7 mL /m in; 进样量: 20�L; 雾化器 压力: 3�3 bar;雾化器温度: 45# 。 2�1�2� 供试液的制备:称取酸枣仁约 4 g,精密称 定,置于 100mL圆底烧瓶中, 加 40mL 70%乙醇回 流提取 1 h, 抽滤, 蒸干提取液, 加 10 mL蒸馏水溶 解,转移至 60mL分液漏斗中, 依次用石油醚和水饱 和正丁醇萃取 3次, 每次 10 mL, 弃去石油醚萃取 液,合并正丁醇萃取液,蒸干,固体用甲醇�水 ( 70∀30) 溶解,并定容于 2 mL容量瓶中,过膜,备用。 2�1�3� 对照品溶液的制备: 精确称取酸枣仁皂苷 A、B对照品 10 mg和 6mg, 置于 2mL容量瓶中,加 入甲醇 �水 ( 70∀30)溶解并定容至刻度,过膜,备用。 2�1�4� 标准曲线的绘制: 分别精密量取对照品溶 ∃1343∃Journa l of Ch ineseM edic inalM ater ia ls� � 第 33卷第 8期 2010年 8月 液 30、100、200、300和 400�L置于 2 mL容量瓶中, 用甲醇�水 ( 70∀30)稀释并定容至刻度, 摇匀, 即得不 同浓度的混合对照液。按上述条件测定,以峰面积 的对数 ( lgA )为纵坐标,以进样量的对数 ( lgm )为横 坐标,绘制标准曲线。酸枣仁皂苷 A的标准曲线: lgA = 1�313 lgm + 2�6946, r2 = 0�9997, 线性范围 1�503~ 20�04 �g; 酸枣仁皂苷 B标准曲线: lgA = 1�416 lgm + 2�5224, r2 = 0�9997, 线性范围 0�828~ 11�04 �g。 2�1�5� 精密度试验: 取同一混合对照品溶液,连续 进样 6次测定。结果表明,酸枣仁皂苷 A、B的 RSD 分别为 0�6%和 0�4% ,色谱检测精密度良好。 2�1�6� 稳定性试验: 取同一份供试液, 于 0、2、4、 7、10和 12 h分别测定。结果表明,酸枣仁皂苷 A、B 的 RSD分别为 0�6%和 1�7%, 说明供试液在 12 h 内能够保持稳定。 2�1�7� 重复性试验:按 % 2�1�2&项平行制备 6份供 试液,分别进样测定。结果表明, 酸枣仁皂苷 A、B 的 RSD分别为 2�9%和 4�6% , 供试品制备方法重 复性良好。 2�1�8� 加样回收率试验: 称取已知含量的酸枣仁 6份,每份 2 g, 精密称定, 分别精密加入对照品溶液 适量,按 % 2�1�2&项制备, 测定。结果表明, 酸枣仁 皂苷 A、B的平均回收率分别是 101�6%和 99�6%, RSD分别为 2�8%和 2�6%。 2�2 � 上样液的制备 � 称取酸枣仁粗粉 3 kg, 置于 多功能提取罐中,加入 10倍体积的 70%乙醇, 煮沸 提取 2次,每次 2 h,合并提取液,回收乙醇, 加适量 水稀释至 3 L,离心,抽滤,滤液即为药材含量约为 1 g /mL的上样液。测得其中酸枣仁皂苷 A、B的平均 质量浓度分别为 0�22 mg /mL和 0�088mg /mL。 2�3 � 大孔树脂纯化工艺考察 � 2�3�1� 大孔树脂种类的选择: 针对大孔树脂纯化 皂苷类成分工艺, 一些研究者对于常规型号的大孔 树脂如 D�101、D�301、AB�8、NKA�9、HPD600、X�5、 D4020等的吸附洗脱性能进行了实验研究, 结果表 明�5�8 , D�101大孔树脂在纯化皂苷类成分上优势明 显。本文在文献调研的基础上, 确定选择 D�101大 孔树脂。 2�3�2� 大孔树脂预处理: 大孔树脂在使用前需经 预处理,以除去其中的未聚合单体、分散剂、防腐剂 等有机残留物。先将树脂用无水乙醇浸泡至充分溶 胀, 然后置于玻璃柱中用乙醇淋洗。检测流出液,直 至流出液与蒸馏水混合无白色浑浊,水洗至无醇味。 依次用 5% HC l和 2% N aOH溶液淋洗, 水洗至中性, 待用�9 。 2�3�3� 吸附及洗脱流速的考察: 量取上样液 150 mL,分别以 2、4、8、12 BV /h的流速通过沉降体积 BV为 15mL的 D�101大孔树脂, 收集各自流出液, 并分别用 70%乙醇洗脱, 洗脱流速等同于相应的吸 附流速,按树脂沉降体积 BV收集,各接收 4 BV。然 后测定酸枣仁皂苷 A、B的含量,并计算吸附容量、 吸附率和洗脱率。结果见表 1。 � 表 1 � 流速对吸附洗脱结果的影响 化合物 流速 /( BV / h) 吸附容量 /( mg /mL ) 吸附率 /% 洗脱率 /% 酸枣仁皂苷 A 2 2� 14 95� 8 90� 0 4 2� 13 94� 9 93� 4 8 2� 12 94� 6 46� 6 12 2� 04 91� 0 42� 9 酸枣仁皂苷 B 2 0� 80 90� 2 75� 2 4 0� 79 89� 4 83� 2 8 0� 79 89� 0 48� 6 12 0� 73 82� 8 50� 7 � � 吸附容量 = (M上 - M流 ) /BV 吸附率 (% ) = (M上 -M流 ) /M上 ! 100% M上 为上样液中指标成分的含量; M流 为流出液中指标 成分的含量; BV为树脂沉降体积。 洗脱率 (% ) = M洗 /M吸 ! 100% M洗 为洗脱液中指标成分的含量; M吸 为大孔树脂吸附 的指标成分含量。 � � 表 1结果表明,随着吸附流速增大,酸枣仁皂苷 A、B的吸附容量及吸附率均逐渐降低。当吸附流 速增大至 8 BV /h时, 吸附容量及吸附率均明显降 低,故吸附流速确定为 8 BV /h, 此时上样液与树脂 的体积比约为 9�3∀1。 当洗脱流速为 4 BV /h时, 酸枣仁皂苷 A、B的 洗脱率均达到最高值,故洗脱流速确定为 4 BV /h。 2�3�4� 洗脱溶媒的考察:量取上样液 150 mL, 分 别以 8 BV /h的流速通过沉降体积 BV为 15 mL的 D�101大孔树脂, 收集各自流出液, 并分别用蒸馏 水、30% 乙醇、50%乙醇、70%乙醇及 95%乙醇洗 脱,洗脱速度为 4 BV /h, 按树脂沉降体积 BV收集, 各接收 4 BV。试验结果见表 2、3。 � � 表 2、3结果表明, 70%乙醇洗脱时,总洗脱率最 高,说明其洗脱能力最强, 当其用量为 3 BV时,酸枣 仁皂苷已基本洗尽, 故选择 3 BV的 70%乙醇进行 洗脱。此外,蒸馏水洗脱液中含微量酸枣仁皂苷,却 存在一定量的固形物, 且 M olish反应呈阳性, 进一 步 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 蒸馏水可洗除糖类成分,以纯化酸枣仁皂苷, 当其用量至 3 BV时,所收集的流份中固形物极少, ∃1344∃ Journa l of Ch ineseM edic inalM ater ia ls� � 第 33卷第 8期 2010年 8月 说明糖类等杂质已基本除尽,洗脱率却有所增加,故 蒸馏水用量选为 3 BV。 � 表 2 � 洗脱溶媒对洗脱率的影响 化合物 洗脱溶媒 洗脱率 /% 1BV 2BV 3BV 4BV 汇总 酸枣仁皂苷 A 蒸馏水 0�3 0 0 0�3 0�6 30%乙醇 0�4 1�1 1�8 1�1 4�4 50%乙醇 15�2 15�6 7�9 6�2 44�9 70%乙醇 43�0 38�1 9�9 2�4 93�4 95%乙醇 46�9 20�6 1�4 0�7 69�6 酸枣仁皂苷 B 蒸馏水 0�7 0 0 0�6 1�3 30%乙醇 0�7 5�2 3�2 1�4 10�5 50%乙醇 12�2 9�7 15�6 6�2 43�7 70%乙醇 37�5 34�4 9�0 2�3 83�2 95%乙醇 42�7 21�4 1�7 0�9 66�7 � 表 3 � 洗脱溶媒对固形物的影响 洗脱溶媒 固形物 /mg 1 BV 2 BV 3 BV 4 BV 蒸馏水 324�3 50�2 20�7 3�3 30%乙醇 50�6 146�5 73�3 35�8 50%乙醇 128�4 293�8 71�3 20�3 70%乙醇 340�2 181�9 24�3 1�5 95%乙醇 359�7 136�8 8�4 6�8 2�3�5� D�101大孔树脂重复使用次数考察: 采用 所选条件,在同一根树脂柱重复吸附洗脱 5次, 以考 察重复使用对 D�101大孔树脂性能的影响, 结果见 表 4。 � 表 4 � 树脂重复使用结果考察 次数 吸附率 /% 酸枣仁皂苷 A 酸枣仁皂苷 B 洗脱率 /% 酸枣仁皂苷 A 酸枣仁皂苷 B 1 98�5 92�1 97� 9 89� 5 2 98�4 91�9 97� 6 85� 8 3 98�3 91�4 97� 6 84� 6 4 98�3 90�9 97� 1 84� 1 5 96�7 89�5 96� 6 81� 8 � � 表 4结果表明,随着树脂的重复使用, 酸枣仁皂 苷 A、B的吸附率及洗脱率均有所下降,但 5次内, 两者的吸附率及洗脱率均未发生显著变化, 由此判 断所用树脂至少可重复使用 5次。 2�3�6� 验证性试验: 按上述优化工艺进行 3次验 证实验,测定酸枣仁皂苷 A、B的含量及固形物量, 计算洗脱率、精制率及产品中皂苷的含量。结果见 表 5。 � � 表 5 � 验证性试验结果 化合物 次数 洗脱率 /% 精制率 /% 含量 /% 平均洗脱率 /% 平均精制率 /% 平均含量 /% 酸枣仁皂苷 A 1 91� 0 676�1 5� 2 2 99� 8 760�9 5� 8 92�1 692� 2 5�3 3 88� 6 664�1 5� 1 酸枣仁皂苷 B 1 91� 2 640�5 1� 9 2 92� 8 683�2 2� 1 90�9 653� 3 2�0 3 88� 9 636�3 1� 9 � � 其中,精制率定义为洗脱液固形物与对应上样 液固形物中指标成分含量之比。 3 � 结论与讨论 比色法、RP�HPLC和 HPLC�ELSD均可用于皂 苷类成分的含量测定。其中比色法灵敏度及准确率 均相对较差, 进而限制了其应用范围; RP�HPLC由 于受到皂苷紫外吸收弱、吸收波长处干扰大等问题, 需要繁琐的样品处理步骤;而 HPLC�ELSD可以避免 前两种方法的缺陷,操作简便,准确率好,灵敏度高, 适合皂苷类物质的含量测定。 根据上述试验, D�101大孔树脂纯化酸枣仁皂 苷的最佳工艺为:吸附流速为 8 BV /h; 在此流速下, 上样液与树脂的体积比约为 9�3∀1; 洗脱流速为 4 BV /h;蒸馏水和 70% 乙醇各 3 BV /h洗脱, 收集 70%乙醇洗脱部位。在此条件下, 酸枣仁皂苷 A、B 的总洗脱率均达到 90%以上,精制率均达到 650% 以上,比文献的数据 �2, 3 高出 2~ 3倍。最终产品中 酸枣仁皂苷 A、B的总含量平均达到 7�3% , 其中皂 苷 A的含量达到 5�3%, 比文献数据�2 高出 2倍。 因此,本研究纯化酸枣仁皂苷效果显著提高,且操作 简便,为进一步研究酸枣仁皂苷这一有效部位奠定 了基础。 参 考 文 献 [ 1] 国家药典委员会 �中华人民共和国药典 [ S] �一部 �北 京:化学工业出版社, 2005: 254� [ 2] 崔瑛,刘菊, 张卫娜 �大孔吸附树脂纯化酸枣仁醇提取 物工艺研究 [ J] �中成药, 2009, 31( 7): 1035�1037� [ 3] 李果,王静, 李祖伦 �大孔吸附树脂纯化酸枣仁总皂苷 工艺研究 [ J] �中国药房, 2006, 17( 15): 1191�1193� [ 4] 黄少伟,池汝安, 张越非,等 �大孔吸附树脂分离纯化土 ∃1345∃Journa l of Ch ineseM edic inalM ater ia ls� � 第 33卷第 8期 2010年 8月 茯苓总黄酮 [ J] � 中国中药杂志, 2008, 33( 10) : 1133� 1138� [ 5] 高侠, 黎云祥,蔡凌云, 等 �大孔吸附树脂对白簕叶总皂 苷的纯化工艺研究 [ J] �中药材, 2009, 32( 5): 780�784� [ 6] 谢丽玲, 任理,赖县生, 等 �红参中人参总皂苷的提取纯 化工艺研究 [ J] �中药材, 2009, 32( 10) : 1602�1605� [ 7] 魏莉,周浩 �大孔吸附树脂分离纯化三七花蕾总皂苷的 研究 [ J]�中药材, 2008, 31( 9) : 1418�1421� [ 8] 黄怀鹏,刘彩霞, 高国领,等 �大孔树脂纯化积雪草总苷 的工艺研究 [ J]�中药材, 2008, 31( 7): 1072�1074� [ 9] 邓亮,叶利明, 侯世祥,等 � 苯乙烯型大孔吸附树脂预处 理的质量评价方法研究 [ J] � 中国中药杂志, 2004, 29 ( 11): 1037�1040� 两种方法提取桉树叶挥发油成分的比较研究 吴青业,关业枝,张清民,刘 � 婵,朱家峰 (广州中医药大学科技产业园,广东 广州 510445) � � 摘要 � 目的:为桉叶油提取工艺的改进提供一定的理论依据。方法: 采用水蒸气蒸馏和超临界 CO2萃取两种 方法对桉叶的挥发油进行提取分离, 并运用 GC�M S分析技术对提取物进行分离鉴定。结果:分离鉴定出 114个化 学成分,其中有 31个成分是 SD和 SFE�CO2共有的,其他为不同成分及 9个不确定成分, 目前研究最多的桉油精的 含量分别为 35� 76%和 6� 29%。结论:水蒸气蒸馏法对桉叶的挥发性成分的提取效率较高, 但选择性差; 超临界 CO 2 萃取的选择性高, 但桉油精的提取率低。 关键词 � 桉叶油;水蒸气蒸馏法;超临界 CO2萃取;气相色谱�质谱联用 中图分类号: R284� 2� � 文献标识码: A� � 文章编号: 1001�4454( 2010) 08�1346�04 收稿日期: 2010�03�12作者简介:吴青业 ( 1968�) ,男,博士,副主任药师,研究方向:中药制备工艺与质量标准研究; Te:l 13501506656, E�m ai:l gzw uqy@ 163� com。 � � 桉树为桃金娘科高大乔木, 自然分布在澳大利 亚等国家,因具有速生丰产、适应性强及用途广泛等 特点,而具有广阔的发展前景。桉叶油是桉树叶油 腺细胞分泌的芳香精油, 为我国重要的出口香料之 一。在国际芳香油市场上桉叶油占有非常重要的地 位, 是目前世界上从树叶类提取的各类天然精油中 数量最多的一种。随着人们对天然香料的需求不断 提高,国际上对桉叶油的需求量也越来越大,因此需 加强对桉叶油的开发和基础研究。 桉叶油的提取一般采用传统的水蒸气蒸馏提取 法 ( SD) �1 ,但随着超临界萃取技术 ( SFE )的发展与 应用,越来越多的学者开始使用超临界 CO 2萃取法 萃取桉叶油,但相对较少。国外 Fadel�2 比较了水蒸 气蒸馏法和超临界 CO2萃取法得到的赤桉油成分, 并考察了二者在亚油酸体系中的抗氧化能力。然而 两种方法提取所得的桉叶油成分是否一致, 主要成 分含量是否存在差异等方面的研究国内甚少。本实 验通过对用这两种方法提取出来的桉叶油进行成分 分析比较,为该方面的研究提供依据。 1� 仪器和材料 桉树叶 [摘取新鲜桉叶, 置于仓库中晾干, 粉 碎, 过 2号筛 ( 20目 ) , 密封保存备用 ] ; CO2; H e; 乙 酸乙酯; IL�SFE超临界萃取装置: 广州美晨高新技 术有限公司; PK系列 PKD02型工业冷水机: 北极工 业冷冻设备公司; HP6890 /5973气相色谱质谱联用 仪:美国 HP公司。 2� 提取和分析方法 2�1� 萃取方法 � 水蒸气蒸馏: 称取 100 g桉叶粗 粉,按药典方法连续蒸馏 4 h,收集挥发油测定器上 层油相。超临界 CO2萃取:称取桉叶粗粉 150 g,在萃 取压力为 15M pa,萃取温度为 40 # ,解析温度为 40 # ,解析压力为 8Mpa条件下萃取 4 h,收集萃取物。 2�2� 分析方法 � 样品用乙酸乙酯溶解,自动进样, 进样量 1�0�L; 进样口为分流模式, 分流比 10∀1;进 样口温度 250# ;载气 H e, 载气为恒流模式, 柱流速 1�0mL /m in,平均线速 37 cm /s; 分析柱为 J&W公司 DB�5MS毛细石英管柱 ( 30 m ! 250 �m ! 0�25 �m);升温程序为初始温度 80# ,经 5 # /m in升至 250# ,保持 20 m in, 共计 55 m in。质谱电离能量 70 eV,电子倍增管电压 1847V, 离子源温度 230# , 四 极杆温度 150# ,质量扫描范围 30~ 550amu。使用 数据库为W iley275、N IST05数据库。 3� 结果 3�1� 两种方法提取的桉叶挥发油的 TIC图 � 见图 1。 ∃1346∃ Journa l of Ch ineseM edic inalM ater ia ls� � 第 33卷第 8期 2010年 8月