从枝菌根真菌培养方法

菌 物 学 报 23(3)：444--456，2004 Mycosystema 丛枝菌根真菌培养方法研究进展 杨晓红 2 孙中海 邵菊芳 仝瑞建2 ( 华中农业大学柑桔研究所，武汉430070； 西南农业大学园艺园林学院，重庆 400716) 摘 要：文章结合最新研究成果着重从十个不同的层面对丛枝菌根真菌 (AM真菌)的培 养方法研究做了较为系统的介绍与评述。认为活体宿主植物盆栽培养法是最简单、最容 易、也是最可靠的AM真菌培养方法，玻璃珠分室培养可方便地将培养基质与AM真菌 分开，能获得纯净的AM真菌菌体，具有其它方法不可替代的作用，AM真菌单孢无菌 的分室Ri T—DNA转型胡萝 卜根双重离体培养是获得 AM真菌纯净菌体和研究AM真菌 遗传、生理、生化等特性的理想方法，以此方法为基础，在根室中补充碳源、在菌丝生 长室置换培养基、多次收获菌体的转型根改良双重培养法是提高某些AM真菌孢子产量 的力荐方法。 关键词：最新进展，评述 中图分类号：Q939．96 文献标识码：A 文章编号：1672．6472(2004)03 0444．0456 菌根真菌，尤其是丛枝菌根真菌 (ArbuscularMycorrhizal Fungi，AM真菌)，是广泛分布的土 居微生物，能与大多数自然生长的陆生 (Jeffrie，1987)和水生 (Khan&Belik，1995)植物形成 共生关系。它们对植物生长促进作用的能力已经得到充分的证明和很好的认识，对生态重要性的 影响也众所周~l(Lovato et a1．，1995)，但这些潜在的巨大作用没有充分开发出来。由于高水平的施 肥和真菌杀菌剂的经常使用，苗圃中已很少观察到这些真菌。菌根生物技术在园艺、农业和林业 中至今还没有得到普遍应用，AM 真菌在生物多样性和园艺、农林业的持续发展中所起的作用， 以及由此所产生的经济效益和生态效益，还远远没有得到充分的发挥 (陈应龙等，1997)，其部分 原因是由于大规模生产AM真菌接种剂的方法还不适宜 (Mohammad et a1．，2000)。 由于AM真菌被赋予了专性共生的性质，人们还无力对其进行单独的无菌纯培养，只能依赖 活体植物对之进行繁殖，因此，AM真菌的无菌培养是40余年来人们一直探索的关键技术，也是 研究的重点和热点。世界各国都在积极开展AM真菌无菌培养的研究工作，本文结合最新的研究 成果，对40余年来AM真菌的培养方法做一个较为系统的综述，供开展AM真菌无菌培养时参考。 l培养方法 1．1盆栽培养法(Pot culture) 丛枝菌根真菌繁殖体以孢子、生活菌丝、分离的泡囊、菌根根段或侵染土壤多种形式存在 (Biermann&Linderman，1983；Diop et a1．，1994；Sylvia&Schenck，1983)，盆栽法获得的是这些 繁殖体的混合菌剂。直到目前为止，来自丛枝菌根植物盆栽培养的根段和孢子 (Gilmore，1968) 仍然是最广泛和最可靠的菌剂。盆栽基质是繁殖菌种和培养宿主的载体，是盆栽培养最关键的影 中国博士后科学基金资助 (NO：8418) 收原稿日期：2004．02．0l，收修改稿日期：2004．04．13 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 杨晓红等：丛枝菌根真菌培养方法研究进展 445 响因素，要求基质疏松、保水、透气，一般采用石英沙、蛭石、泥炭、沙、土壤等的混合基质， 以高梁 (Sorghum YUlgare Pers．)和白三叶草( ifolium repens L．)为宿主植物，摩西球囊霉 (Glomus mosseae Nicolson&Gerdemann)盆栽培养的最佳培养基质是沙：土 (1：1，v／v)或沙：土：蛭 石：沸石 (2：1：1：1，v／v)的混合基质。基质中的速效磷浓度以10mg·kg 为宜 (王幼珊等， 2001)。盆栽基质颗粒的大小也影响着 AM真菌繁殖体的生产。以玉米(Zea mays L．)为宿主植物补 充适宜的营养液，根内球囊霉(Glomus intraradices Schenck&Smith)盆栽培养基质 (沙、珍珠岩、 木炭粉、粘土砖粉等)的颗粒直径在 0．50—0．78mm时，AM真菌的繁殖体数量、宿主植物的生长 状况都优于对照，在砖粉和沙的基质中，AM真菌的侵染繁殖体数量比其它基质高出40％一50％ (Gaur&Adholeya，2000)。盆栽基质的酸碱度控制在 pH5～7，经 125℃湿热灭菌 1～2h，或 1Mrad 的 射线灭菌后，将待繁殖的AM真菌菌种接种于基物上，宿主植物的种子经表面灭菌后播种于 该培养基质中。适于盆栽活体繁殖或保存 AM真菌的宿主植物多选择根系发达的多年生草本植物 或一年生植物 (刘润进和李晓林，2000)，如：三叶草、苜蓿、烟草、苏丹草、百喜草、玉米、高 梁、韭菜、葱等。然而，盆栽培养法进行接种剂的生产需要宽敞的空间和较长的时间，生产出的 接种剂繁殖体数量少、容积大、笨重，不便于运输或携带。 为克服盆栽培养的一些不足，曾利用盆栽培养原理，巧妙地设计了温室苗床扩繁 AM真菌菌 剂和对柑桔砧木幼苗成功接种的简易方法 (沈廷厚，万水林，1994)，即将柑桔球囊霉 (Glomus citricolum Tang&Zhang)等的柑桔根段菌剂分别接种温室中培养白三叶草的灭菌沙基质苗床中， 4个月后检查发现三叶草根系全部感染 AM真菌，表明基质中含有大量的AM根外菌丝体、孢子 等繁殖体，用此苗床的基质播种枳壳 (Poncirus trifoliata Raf．)，获得了大量带菌根的枳苗。 盆栽培养中宿主植物的栽培密度对 AM真菌的生长发育也有影响，陈宁等 (2003)报道，摩 西球囊霉 93(Glomus mosseae 93)在 10L培养钵的沙土 (3：1)混合基质中，以高梁为宿主植物， 在栽培密度为 60株／盆的处理时，AM真菌的繁殖体 (根外菌丝和孢子)数量显著高于其它处理， 适当密植对植物的生长虽有一定的影响，但可使菌根共生体由互惠共生向偏利共生或弱寄生转化， 认为密植是菌剂生产获得较大数量侵染根段、菌丝和孢子等繁殖体的调空手段。 Fracchiaa et a1．(2oo1)从盆栽培养技术获得启示，设计了一个获得单孢 AM真菌培养的简单技 术。供试菌种为Gigaspora rosea，Gigaspora sp，Glomus mosseae和 Glomus sp．。将单个表面灭菌 的孢子转移到直径为5cm的培养皿中，加入 10ml的 10mM的MES缓冲液，加入0．04g的Ge1．Gro， 三叶草在由蛭石和珍珠岩 (1：1，v／v)组成的培养基上生长2周后，连同基质转移至有萌发孢子 的 Ge1．Gro介质表面。所有的植物与单个萌发孢子形成菌根。用这个系统，可以对菌丝的发育、 扇状结构的形成、AM 真菌与植物根的菌丝接触和穿透进行非破坏性的观察，获得繁殖体的遗传 特性一致，可以克服某些AM真菌菌种还不能用转型根进行无菌培养、或转型根无菌培养成功率 偏低的的缺点，也可用于对某些转型根无菌培养获得孢子的遗传稳定性的恢复。 但是，盆栽培养还是不能满足科研和生产的要求，因为即使 护理 卵巢癌的护理查房优质护理服务内容doc优质护理服务内容肺癌的护理常规消毒供应室优质护理 非常仔细也容易污染 (Ames &Linderman，1978)。为此，AM真菌的多种无土培养方法应运而生 (Sylvia&Jarstfer，1994)。 1．2培养基培养法 (Medium culture) Mosse(1962)最早在无菌条件下的人工培养基上建立了丛枝菌根培养，后来Mosse&Hepper (1975)等又用不同的宿主植物重现了这个试验。这种方法是：将宿主植物 (如三叶草、番茄等) 种子表面消毒，用灭菌蒸馏水洗去消毒液后，在琼脂培养基上催芽萌发；然后，将 AM真菌的孢 子表面灭菌，用灭菌蒸馏水漂洗多次后，于低温下灭菌蒸馏水中保存；待种子萌发并长出侧根时， 将 10-1 5个准备好的孢子移入侧根附近的培养基上，室温条件下培养，当AM真菌侵染根系后， 维普资讯 http://www.cqvip.com 菌 物 学 报 23卷 即建立了共生关系，当AM真菌在根系中大量繁殖时，即实现了AM真菌在无机培养基中的扩繁。 一 定时间后，取出宿主植物，将根系洗净、凉干、剪成小段，即为无杂菌的AM真菌根段菌剂， 根段中含有菌种的菌丝、孢子、丛枝和泡囊等繁殖体结构。 1．3静止营养液培养法(Resting hydroponic culture) Crush&Hay(1981)设计了静止营养液培养法以利用白三叶草 (Trifolium repens L．)在灭菌的 营养液中培养珠状巨囊霉(Gigaspora margarita Becker&Hal1)。他们用漂浮在营养液面上的聚乙烯 支持网筛和放在网筛中的沙基质，三叶草的种子和 AM真菌孢子就放在此基质上进行培养，菌丝 和根系在营养液中生长，菌丝侵染根系形成菌根，菌丝也可在营养液中大量繁殖。获得的菌根和 营养液都可以作为接种剂。这种方法需要一定的装置，成本较高，实际应用中有较大的局限性(陈 应龙等，l9971。 还有一种近于半水培的静止营养液培养法。将河沙过3mm筛，水淘洗风干，干燥灭菌 (180 ℃，2h)后作固定基质，以大量元素减少 l0倍的Hoagland液为营养液，将接种了AM真菌的宿 主植物盆栽容器浸于稀释的 Hoagland液中，定期补充和更换营养液。用烟草 (Nicotiana tabacum L．)为宿主植物将盆栽法、半水培的静止营养液培养法和后面将介绍的流动营养液培养法对 Glomusmosseae的菌剂质量影响进行了比较 (许学明和岳风荣，l997)，结果表明，半水培的静 止营养液培养法在侵染率、产孢量、节约培育时间和空间方面都优于其它二种方法，认为半水培 的静止营养液培养法是这三种方法中首选的方法。由于宿主植物牛长在透气保水的灭菌河沙中， 培养的接种剂质量较高，可用于科研或 (和)生产上小面积应用所需要的接种剂的生产 (刘润进 和李晓林，2000)。 1．4营养流动液培养法 (Nutrition flow culture) l984年，Elmes&Mosse和 Mosse&Thompson分别以玉米 (Zea mays L．)和菜豆 (Phaseolus VUlgaris L．)等作为宿主，探索了AM真菌菌剂的营养液流动培养技术 (nutrition flow culture)。 将预接种 5％以上的AM 真菌宿主植物固定在营养液槽中，槽内铺黑色塑料膜，槽中营养液淹没 根系，经修改的 Hoagland营养液以 8～l0L／min的流速循环流动，定期 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 循环液的养分浓度和 pH值。这种方法用于工，一化生产 AM 真菌菌剂，尽管没有了土壤微生物的污染，但由于根系长 期浸泡在液体中，不利于根系和真菌的呼吸，对菌剂的繁殖速度和质量仍然有一定的影响 (刘润 进和李晓林，2000)。 1．5汽雾培养法(Aeroponic culture1 为改善宿主根和真菌的通气状况，Hung&Sylvia(1988)设计了用工厂化生产 AM真菌菌剂的 汽雾系统，将预接种 5％～l0％的宿主植物架在空中，再用架设在根系周围的喷头每隔数秒钟对根 系喷雾营养液，保持根系 l00％湿度，以满足根系对水分和营养的需求。Carruthers(1992)比较 了产生优良营养雾汽的常规喷嘴喷雾和超声波汽雾系统，认为超声波雾化系统中营养溶液通过蒸 发容易丢失，其结果，使得汽雾培养的根营养吸收减少。Jarstfer&Sylvia(1995)测试了AM真 菌菌剂生产的 3种汽雾系统：雾化皿 (atomizing disc)雾化系统、微灌喷嘴加压喷雾 (pressurized spray through a micro—irrigation nozzle)系统和直径 3～lOHm营养液液滴超声波汽雾(ultrasonically generated fog ofnutrient solution with droplets 3一lOHm diameter)系统，结果表明，对于AM真菌菌 剂的汽雾生产来讲，泵和喷嘴系统功能是最普通和最可靠的。而超声雾化系统产生的 3～lOp．m的 雾滴直径较大，不能为根表面提供足量的自由湿度，导致根系生长不良，AM真菌蔓延侵染失败， 从而降低孢子产量，结论与 Carruthers(1992)相似。为了克服这些限制根生长和 AM 真菌侵染 的因子，Mohammad et a1．(2000)根据压电陶瓷原理 (piezo ceramic elements)技术，利用高频 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 杨晓红等：丛枝菌根真菌培养方法研究进展 447 声波将营养液雾化成直径仅为 llam的微小液滴，用最或然数法 (the Most Probable Number test， MPN)和根侵染百分数对利用苏丹草 (Sorghum sudanese Staph．)生产根内球囊霉 (Glomus intraradices Schenck&Smith)根段菌剂的汽雾皿法和超声波汽雾技术进行了比较研究。试验结果 表明，宿主根在超声波喷雾系统中比雾化皿雾化系统生长更快，菌根化作用更强，侵染繁殖体数 更多。认为，改良的超声波雾化系统较传统的雾化皿系统更加优良，可代替传统雾化皿系统或者 喷嘴喷雾系统生产更高质量的AM真菌菌剂，研究结果与Carruthers(1992)和Jarstfer&Sylvia (1995)相矛盾，其主要原因在于他们的超声波雾化系统中，营养液雾滴直径大小发生了变化， 直径由3～l01am减少到了 llam，缩小了 l～l0倍，在根的表面形成了更充足的自由湿度，利于根和 AM 真菌的生长发育。可见超声波雾化系统中，如果营养液雾滴太大，AM 菌剂质量就不如传统 雾化皿系统和喷嘴喷雾系统，如果将雾滴控制在直径 llam时，汽雾系统生产的AM真菌菌剂质量 就较传统雾化皿系统和喷嘴喷雾系统高。但总的来说，雾化培养系统对营养液要求的参数较多， 尤其是对P和pH值的控制十分严格 (刘润进和李晓林，2000)。 1．6玻璃珠分室培养法 (Glass beads split．compartment culture) 液体流动培养法和汽雾培养法尽管可以获得质量较高的菌根菌剂，但仍然不能获得纯净的根 外菌体，为了达到这个目的，并使培养的菌体与培养基质容易分离，Redecker et a1．(1995)首次 设计了玻璃珠分室培养技术，他们用细香葱 (Allium schoenoprasum L．)和根内球囊霉 (Glomus intraradices Schenck& Smith)建立了培养，获得了AM真菌纯净体，用于PCR和 RFLP研究， 没有发现污染迹象。陈保东等 (2000)在 Redecker et a1．(1995)的基础上，改进了培养条件，建 立了玉米 (Zea mays L．)和红三叶草 (Trifolium pratense L．)与 Glomus mosseae和 G．．versiforme 的培养体系，并获得了相应的纯净真菌。玻璃珠分室培养中使用的玻璃珠直径为 0．8～1．2mm，培 养室用有机玻璃板分成 l～5(或 3)室，各室间用不同孔径的尼龙网隔开，尼龙网依次编号为A、 B、C和 D，尼龙网A、D孔径为 lmm，尼龙网B、C孔径为301am，l、5室为宿主植物生长室fplant growing compartment)，装入 l：l(v／v)的沙土和细沙混合物，2、4室为菌根室 (mycorrhizal compartment)，装入河沙或玻璃珠，3室为真菌生长室(fungi growing compartment)，装入玻璃珠。 根系可以穿过尼龙网 A和 D在菌根室中生长，菌丝可穿过尼龙网B、C进入真菌生长室，经过一 段时间的生长后，即可收集到真菌菌丝、孢子或孢子果 (陈保东等，2000)。 玻璃珠分室培养技术的最大优点就是真菌和基质易于分离，可以培养出大量保持自然菌落的 真菌，同时免除其它外源污染，对于多数研究具有不可替代的作用，尤其是为 AM真菌分子生物 学及生理生化研究所需的大量纯净真菌的培养提供了一条简便易行的途径 (陈保东等，2000； Baodong Chen et a1．，2001) 。 1．7离体无菌纯培养 (In vitro axenic culture) 由于在纯培养过程中不能持续性地生长，AM 真菌至今都被认为是专性活体营养微生物，然 而，对于这些真菌不能进行腐生生长的原因又没有一个明确的解释。尽管纯培养条件下AM真菌 生长还不能通过完整的生活史，但已经证明，AM 真菌与宿主根系接触之前以及离体条件下对不 同的处理反应中，有一定程度的无宿主发育。实验已经确认，AM 真菌在孢子萌发和萌发菌丝的 伸长过程中能够合成细胞质蛋白质、某些形式的RNA以及线粒体 DNA。AM真菌萌发孢子中也 具有谷氨酸脱氢酶(DH)、琥珀酸脱氢酶和甘油醛．3．磷酸脱氢酶活性。前面两个特征显示有三羧酸 循环(TCA)存在，后者表明有糖酵解(EMP)途径在运作(Siqueira，l987)，只要提供简单的物理化学 条件如适宜的湿度、温度和 pH， AM 真菌所具有的相应遗传信息和生物合成能力就能够使孢子 萌发(Barea，l986)。AM真菌也有能力在没有宿主存在的培养基中吸收标记碳(B6card&Pich6．1989) 维普资讯 http://www.cqvip.com 448 菌 物 学 报 23卷 和磷(Thompson，l990)，甚至产孢 (Ulrich et a1．，2002)。这些事实表明，AM真菌在特殊条件下有 可能进行合成代谢。为此，人们对 AM真菌的离体培养研究进行了多方尝试。 彭生斌和沈崇尧 (1989)用从北京市郊蔬菜地分离到的 AM 真菌球囊霉属 (Glomus sp．)菌 株为 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 进行离体条件下的多孢子纯培养，研究在低温 (0~4~C)、液体培养和其它微生物等条件 下的孢子发芽、菌丝生长和 “无性孢子”的发生，结果表明，AM 真菌孢子的萌发受到多种因素 的影响，如：低温 (0～4℃)的刺激、厌氧和孢子表面的活性因子。没有灭菌的孢子，在自来水 中培养 20天 (0~4℃)后开始产生少量的 “无性孢子”，约 30天后产孢增加，产孢可持续60～80 天。获得的孢子薄壁、透明，着生在菌丝的顶端，直径 l5～30gm，但不能发育成正常的厚垣孢子。 培养在蒸馏水中的孢子有微弱的芽管菌丝生长，培养在无菌水中的孢子没有发芽能力，经过表面 灭菌的孢子，在自来水中的培养，无论是在 20"C或 0 ℃条件下孢子都不萌发。由此认为，AM 真菌孢子的萌发和菌丝的延伸生长对营养的要求并不复杂，仅自来水中的营养就能一定程度满足 它的需要，推测未灭菌孢子中存在着孢子表面活性剂，这些孢子表面活性剂可能是环境微生物， 其它的环境因子如厌氧等对 AM真菌的生长也可能具有重要的作用。由于这些自来水中产生的新 孢子是在有环境微生物存在下形成的，且不能发育成正常的厚垣孢子，达不到对 AM真菌 (菌丝) 生理、遗传等科学研究的需要，而且他们对具有孢子表面活性剂作用的环境微生物也没有作进一 步的分离和鉴定。十年后，Budi et a1．(1999)在接种摩西球囊霉 (Glomus mosseae)的双色高梁 (Sorghum bicolor)菌根际分离到了一种微生物，依据其形态特征和 l6S．核糖体 DNA分析鉴定 为 Paenibacillus sp．属细菌，发现这种细菌对土生真菌病害有拮抗作用，并能促进菌根的形成。 Ulrich et a1．(2002)在进行根内球囊霉(Glomus intraradices)与胡萝 卜转型根双重培养时，发现经常 有50％左右的污染率，污染微生物在平板培养基上形成光滑、整齐具粘性的菌落，分离并鉴定了 这种微生物是粘菌 Paenibacillus validus，用这种粘菌在缺少宿主植物根组织时与 Glomus intraradices不直接接触地共同培养，不仅促进 G．intraradices菌丝的生长，也促进了G．intraradices 在密集分布的卷曲菌丝结构处产孢。尽管他们还没有观察到新孢子的萌发和对植物的侵染，也没 有鉴定出来粘菌中的什么因子在促进 AM真菌生长，但是这种发现将标志着人们在朝着利用 AM 真菌不依赖宿主植物而进行定向生长方向迈出了重要的一步。 彭生斌和沈崇尧(1990a)用大豆根愈伤组织和愈伤组织的细胞抽提液分别处理离体培养的三 种球囊霉属真菌 Glomus mosseae、G．versiforme和 G．sp。结果表明，大豆根细胞和愈伤组织抽提 液对其中两种真菌孢子发芽和芽管伸长均有明显的促进作用 (对 G．versiforme芽管的伸长无明显 的影响)，认为在大豆根愈伤组织和愈伤组织抽提液中有促进AM真菌生长的因子存在，抽提液 的上清液 (即残留的 MS培养基)2-l00倍稀释液对这些真菌孢子发芽和芽管伸长有显著的抑制 作用，l000～l0000倍稀释液没有影响。 日本的Ishii et a1．(1995)在水琼脂培养基上也开展了无菌培养，他们观察到 AM真菌孢子萌发 后在固体水琼脂培养基上大量延伸生长的菌丝，但没有观察到产孢，推测是缺乏 AM真菌生长促 进物质的原因。因此，他及他的研究小组在一段时间内都集中精力研究AM真菌的生长促进物质， 并分别在百喜草(Paspalum notatum FlUgge)根 (Ishii et a1．，l997)、2种海藻 (Laminariajaponica Areschoug和 Undaria pinnatifida Suringar)(Kuwada et a1．，l999)和榨汁后的柑桔果渣 (Ishii et a1．，2000)中提取和分离AM真菌生长促进物质，鉴定了百喜草根中三种生长促进物质之一是黄酮 类物质3 一去羟泽兰素 (Eupalitin，3，5一dihydroxy．6，7．dimethoxy．4 ．hydroxy flavone)，海藻中是 褐藻寡糖 (alginate oligosaccharide)，果渣中为橙皮素(Hesperidin，hesperetin．7．13．rutioside)和柚皮 素-7一芸香糖甙(Narirutin，naringenin．7．13．rutioside)，这些物质都能促进离体条件下 Gigaspora 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 杨晓红等：丛枝菌根真菌培养方法研究进展 449 margarita菌丝的生长。 杨晓红等(2001)在 Ishii et a1．(1997)的基础上研究了百喜草茎叶发酵前后甲醇溶提物对珠状巨 囊霉(Gigaspora margarita Becker&Hal1)菌丝生长的影响，发现新鲜百喜草茎叶中同时含有AM 真菌生长促进物质和抑制物质，生长促进物质主要存在于25％的甲醇溶提物中，并以25％的甲醇 溶提物对 AM真菌菌丝的生长促进作用最显著，抑制物质主要存在于 100％的甲醇溶提物中，发 酵过程能有效地分解 100％甲醇溶提物中 AM真菌生长的抑制物质，保留AM真菌生长的促进物 质。 活性 AM真菌孢子即使在离体条件下的水琼脂培养基中菌丝生长的速度也是相当快的，有时 可观察到孢子萌发后菌丝很快延伸布满培养基，更甚者菌丝分支密集，卷曲缠绕菌丝增多。此时 要进行菌丝长度和生长速度的测量十分艰难，为克服观察测量中的这种困难，杨晓红等 (2001) 设计了垂直平板定时转动培养方法，他们每 24小时转动一次垂直竖放的水琼脂培养基，发现菌丝 基本上径直向垂直方向生长，且菌丝分支较少，每次转动后菌丝都随之有一个折点，折点将菌丝 分成若干菌丝段，各菌丝段围绕转动轴旋转排列，菌丝际范围大为缩小，十分便于显微测量菌丝 长度和菌丝生长速度，并直观地观察到了AM真菌菌丝生长的向地性性质。 迄今为止，AM真菌离体纯培养尚没有获得新一代的AM真菌孢子(刘润进，李晓林，2000)， 纯培养工作进展缓慢。 1．8 AM真菌与植物根器官的双重无菌培养法(Dual axenic cultures) 既然 AM真菌是专性活体营养真菌，用活体植物培养费时费工易污染，离体纯培养又难于完 成生活史，于是人们试图用AM真菌与离体的植物活体根建立共生关系来无菌培养AM真菌产孢。 Mosse(1962)不仅是无菌条件下在人工培养基上建立丛枝菌根最早的人，也是离体根器官接种 AM 真菌平板培养技术 (Mosse& Hepper，1975)的创始人，她和她的研究小组用摩西球囊霉 (Glomus mosseae Nicolson&Gerdemann)与红三叶草(Trifolium pratense L．)和番茄(Lycopersicum esculentum Mil1)离体根建立了AM共生联合体，即双重培养，首次证明AM真菌的孢子能在无机矿 质 营养 培 养 基上 成功 接种 并 与离 体根 器 官形 成 菌根 。Miller—Wideman& Watrud(1984)和 Janardhanan et al(1990)用番茄根与AM真菌也建立了双重培养体系，并获得了新一代的孢子，显 示出双重培养的灿烂前途。 彭生斌和沈崇尧f1990b)用改良White培养基上连续继代培养的红三叶草 (Trifolium prasense L．)根器官与球囊霉 lomus sp．1建立了VA菌根离体培养体系，观察到菌丝侵染前首先形成附着 胞，通过附着胞进一步向根内侵染，形成根内菌丝、丛枝和不明显的泡囊。由于AM是在完全无 菌的条件下形成的，使得影响研究的环境及生物因子大大减少，同时也进一步表明，AM 的形成 可以不依赖植物的地上部分和复杂的土壤因子，使得 AM真菌与宿主间的关系更加明确。然而， 获得的无性孢子不能发育成正常的厚垣孢子，用侵染的根段和根外菌丝进一步培养试图获得纯的 培养物，但没有成功。 赵志鹏和郭秀珍(1991)采用根段培养技术，以红三叶草为载体植物，分别用三叶草丛枝菌根 根段和已经培养 6天的孢子为接种剂，于改良White培养基上成功地建立了三叶草与地表球囊霉 (Glomus versiforme Berch)的双重培养体系，并获得了具有侵染泡桐 (Paulownia albiphloea)试 管幼苗能力的地表球囊霉纯种 AM 菌剂。其工作对无菌条件下制备单一的 VA菌根菌剂是一个成 功的探索，也首创了 AM生物技术在组培苗接种应用中的纪录，对随后的丛枝菌根及其应用技术 的研究具鼓舞和推动的作用。 双重培养法还可用于研究丛枝菌根与其它共生关系的互作。汪洪钢等(1990)在无菌条件下， 维普资讯 http://www.cqvip.com 450 菌 物 学 报 23卷 将离体的绿豆 (Ph口seolus aureus Roxb．)根器官、AM真菌和根瘤菌在不同的培养基上分别进行 了隔离培养，并用 AM真菌(Glomus versiforme)的厚垣孢子、根瘤菌(Rhizobium sp．76)分别单一接 种培养的绿豆根器官，获得了 26．7％的菌根感染率和 100 的根瘤菌感染率。同时，用三叶草的 丛枝菌根根段和根瘤菌悬液双重接种绿豆根器官后，观察到了绿豆根双重侵染的现象，并发现 AM 真菌不仅可以侵染根的皮层，还可以侵染根瘤，双重侵染率为 l1．8％。他们的工作为研究宿主的 营养状况、AM真菌和根瘤菌的生长条件、共生关系可能产生的影响等，提供了一种试验方法。 1．9 AM真菌与 Ri T．DNA转型根的双重单胞无菌培养法(Dual monoaxenic culture of AM fungi with Ri T．DNA transformed root) 由于Mosse(1962)和 Mosse&Hepper(1975)的开创性工作，80年代以来建立的AM真菌与转 移 Ri T．DNA胡萝 卜根器官双重培养体系(Mugnier&Mosse，1987；Chabot et a1．，1992；B6card& Fortin，1988)是研究AM真菌菌丝功能的有效方法。这种方法中，作为宿主的Ri T．DNA转型胡萝 卜(Daucus carota L．)根促进 了 Glomus mosseae(Mugnier& Mosse，1 987；Douds Jr，1 997)、 G。intraradices(Chabot et al。，1992；B6card&Fortin，1988；St—Arnaud et a1．，1996；Jolicoeur et a1．， 1999；Vimard et al。，1999；毕银丽等，2000；Ulrich et a1．，2002)、G。versiforme(汪洪钢等，1994； Declerok et a1．，1996；Diop，1994)、Gigarspora margarita(B6card&Pich6，1989；B6card&Fortin， 1988；汪洪钢等，1994；毕银丽等，1999a，b)、Gigarspora gigantean(李晓林和冯固，2001)、 Sclerocystis sinuosa(李晓林和冯固，2001)的孢子生产。即在无菌条件下，利用双重培养技术在 同一平板上同时培养胡萝 卜转基因根与 AM真菌，建立共生联合体后产孢。 AM真菌与转移 Ri T．DNA胡萝 卜根器官双重培养体系的基本作法如下：首先将发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes Conn．)Ri质粒上的 T—DNA(简称Ri T．DNA)转移到胡萝 卜肉质直根细胞 中去，使胡萝 卜根产生正常植株所没有的冠瘿碱，在无激素培养基上形成多分支并旺盛生长的毛 状根(hairy root)，毛状根经抗生素选择培养和多次继代培养后，即为菌根研究理想的离体根器官； 接下来，将表面灭菌后发芽的AM真菌单个孢子接种到在 M培养基上生长的Ri T．DNA转移胡萝 卜根器官旁的菌根室 (mycorrhizal compartment)中，让 AM 真菌菌丝侵染根形成共生体系；共 生体系建立后，根外菌丝大量产生，根外菌丝越过培养皿中间的横隔，从贴附在横隔上孔径为30~tm 的尼龙网眼中进入培养皿的另一半室，由于该半室中只有菌丝没有根，故称菌丝室(hyphal compartment)。在菌丝室中的菌丝，为单孢纯种 AM 真菌菌丝，这些菌丝的大量生长，即实现菌 丝际的建立。用这种方法获得的菌丝际，不仅避免了人为环境条件的干扰，而且可以在不破坏菌 根菌丝生长的前提下，原位观察到它的形态发育及其生理生化特性，为研究菌丝及菌丝际的生理 生化提供了一条有用的途径 (李晓林和冯固，2001；毕银丽等，2000)。 有关根内球囊霉(Glomus intraradices)离体条件下孢子生产方法的研究文章中，生产效率变化 很大。Chabot等 (1992)描述了表面灭菌孢子作为起始接种剂的双重培养的建立，但在4个月的 培养中每皿仅产生700个新孢子。Diop等 (1994)使用菌根根段作为起始接种剂，3个月内每皿 生产了893个孢子。Jolicoeur等 (1999)研究的气升式生物反应器 (airlift bioreactor)，每升生 产 12400个孢子 (大约相当于一个分室培养中产生 375个孢子)。St．Arnaud等 (1996)为研究 AM 真菌与根病源微生物间的相互作用时也应用了根内球囊霉(G。intraradices)与转型胡萝 卜根的 分室单胞培养技术，观察到AM真菌在远室 (菌丝室)中快速增殖并产孢，认为这为研究AM真 菌提供了一种较好的方法。他们利用双重培养技术将 G．intraradices的产孢效率提高了约 10倍。 该法在直径为 9cm培养皿 (30cm )的分室培养的远室半皿中平均生产了 1．5万个孢子，AM真菌 菌丝越过隔板后只用了3-4个月，总共只花了4～5个月的时间。用 2室培养皿从宿主根室培养出 维普资讯 http://www.cqvip.com 3期 杨晓红等：丛枝菌根真菌培养方法研究进展 45l 丛枝菌根共生体菌体是实现大量生产 G．intraradices孢子最成功的方法(Fortin et a1．，1996； St．Arnaud et a1．，1996)。国内毕银丽等(2ooo)~过 1个月的转型根双重培养，也获得了大量的 G． intraradices孢子，这使得 AM真菌与Ri T．DNA转型根双重培养技术在AM真菌接种剂的批量生 产中更具有魅力。 1．10 AM真菌与 Ri T—DNA转型根双重培养的改良分室单胞培养系统 (Improved the split—plate monoxenic culture system of AM fungi with Ri T—DNA transformed root) Douds Jr(2002)的研究在无菌条件下获得了更高的根内球囊霉(Glomus intraradices)产孢效率。 他在 St．Arnaud et a1．(1996)方法的基础上，设计了一种新的分室单胞无菌培养系统 (split．plate monoxenic culture system)，与一般的AM真菌和 Ri T．DNA转型根双重培养不同的是要在远室 (distal compartment，即菌丝室)中置换培养基，近室 (proximal compartment，即菌根室)中补 加葡萄糖(glucose)。培养 3个月后，每 2个月在远室中置换一次培养基，同时在近室中补充200mg 的碳源，从第 3个月开始，每 2个月可依次从培养皿 (直径 9cm)的远室收集约 2万个孢子，产 孢效率是St．Arnaud et a1．(1996)的3倍。这种方法在 7个月内生产了6．5万个孢子，即是说，在单 位时间内比一般的分室培养技术几乎是将孢子产量提高了3倍。用第四代孢子，即那些在 7-9月 置换培养基后产生的孢子侵染百喜草(Paspalum notatum Fliigge)幼苗，温室中生长4周后，检查供 试百喜草的所有根段，根内球囊霉在百喜草根中的侵染率平均为20％～26％。Douds Jr(2002)的方 法，可以说是到目前为止 Glomus intraradices孢子菌剂生产最高效的最安全的一种方法，值得大 力推荐使用。随着人们对 AM真菌认识的逐步伸入，相信 AM真菌在园艺、农业、林业和生态建 设中的诸多效应将日渐显著。 2讨 论 离体生产AM真菌孢子接种剂需考虑的一个问题是：在琼脂培养基上维持继代培养多年后， 这些孢子的侵染力和遗传稳定性会如何呢?Laiho(1970)以及Marx&Daniel(1976)已经表明，外生 菌根在继代培养几年后会失去它侵染植物根系的能力。Plenchette et a1．(1996)报导，离体生产的 (Glomus versiforme)孢子和菌根根段，在仅三代后就降低了对韭菜根系的侵染能力。因此，应对连 续单孢无菌培养的AM真菌繁殖体不同代的接种势进行评价，兼顾离体和活体收集保存，维护AM 真菌生物多样性。然而，继代培养的根内球囊霉(Glomus intraradices)似乎没有没有这方面的问题。 Vimard et a1．(1999)专门设计了测试Glomus intraradices不同接种剂类型接种势的试验，对利用 Ri T．DNA转型胡萝 卜根双重培养技术(B6card&Fortin，l988)生产的Glomus intraradices孢子菌剂 与开放盆栽培养的Glomus intraradices菌根根段菌剂侵染韭菜 (Alliumporrum L．)的侵染势进行了 比较研究 (韭菜生长在控制环境中)。结果表明，混合土壤基质中，前4周内，根段接种剂的侵染 势强，孢子接种剂基本无侵染；第八周时，混合土壤中的根侵染持续上升，孢子菌剂的侵染开始 发生；到16周时，两种菌剂的接种势几乎达到相同水平，分别为58％和44％。用第三十代继代培 养的离体孢子与土壤基质中的非离体生产接种剂比较，在经过一个最初的迟滞期后，前者的生活 力和侵染力仍然很高。更有意义的是，用单胞无菌培养的孢子接种的韭菜，菌根中仅含有 G．intraradices真菌，而根段接种的韭菜，菌根中含有14％～16％的其它真菌污染。毕银丽等f1999) 在利用Ri T．DNA转型根与Gigaspora margarita建立双重培养中，获得的新孢子无需休眠即可萌发， 接种到根的周围，又能侵染。这些试验有力地证明了AM真菌孢子在无菌条件下生产AM真菌繁殖 体仍然是获得高质量无病源菌污染接种体的最有前途的方法之一。 维普资讯 http://www.cqvip.com 452 菌 物 学 报 23卷 3结束语 笔者结合最新研究成果着重从十个不同的层面对丛枝菌根真菌 (AM 真菌)的培养方法研究 做了较为系统的介绍与评述。认为活体宿主植物盆栽培养法是最简单、最容易、也是最可靠的AM 真菌培养方法，玻璃珠分室培养可方便地将培养基质与AM真菌分开，能获得纯净的AM真菌菌 体，具有其它方法不可替代的作用，单胞无菌的分室Ri T—DNA转型胡萝 卜根双重离体培养是获 得 AM真菌纯净菌体和研究 AM真菌遗传、生理、生化等特性的理想方法，以此方法为基础，在 根室中补充碳源、在菌丝生长室置换培养基、多次收获菌体的转型根改良双重培养法是提高 AM 真菌孢子产量力荐的方法。 IREFERENCESl Ames R N，Linderman R G，1 978．The 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