制备色谱线性放大

作者简介 :程小卫 ,男 ,安徽怀宁 ,从事色谱及光谱技术的应用研究 ,Email :xwcheng @chemexplorer. com. cn 高效制备液相色谱的线性放大技术 程小卫1 ,何美莲2 (1. 上海开拓者化学研究管理有限公司 ,上海 201203 ;2. 复旦大学生命科学学院天然产物研究中心 ,上海 200433) 提要 :概述高效制备液相色谱线性放大技术研究的最新进展 ;并对其基本原理以及填料粒径、柱尺寸和操作方式等影响放大 的因素作了较为全面的评述 ;探讨了高效制备液相色谱技术的应用和发展前景。 关键词 :高效制备液相色谱 ;线性放大技术 ;综述 中图分类号 : O657 　 文献标识码 : A 　 文章编号 : 1006 - 0103 (2005) 04 - 0332 - 02 Linear magnifying technology in high preparative performance liquid chromatography CHENG Xiao - wei1 , HE Mei - lian2 (1. Shanghai Chemexplorer Co. Ltd. , Shanghai 201203 , China ; 2. Research Center of Natural Products , School of Life Sciences , Fudan University , Shanghai 200433 , China ) Abstract :　Recent progress of the linear magnifying technology in high preparative performance liquid chromatography was reviewed. The key2 stone of the linear magnifying technology , effect factors on scale up in packing size , column dimension and operating method , etc were de2 scribed. Perspective in the applications and developments of high preparative performance liquid chromatography were discussed. Key words : High preparative performance liquid chromatography ; Linear magnifying technology ;Summary CLC number :O657 Document code :A Article ID :1006 - 0103 (2005) 04 - 0332 - 02 　　高效制备液相色谱技术是一种能获得高纯度化 合物的分离技术。高效分离与纯化技术专家已将色 谱分离在理论上从线性色谱发展到非线性色谱 ,从 分析规模发展到制备规模和生产规模[1 ] 。目前 ,高 效制备液相色谱技术已可以将小粒径 (5μm)的填料 装填成直径至 150 mm 的制备柱 ,科学家们无需重新 开发制备色谱的分离技术 ,而直接利用在分析色谱 柱 (2. 1 mm 或 4. 6 mm 直径)上优化的方法进行线性 放大 ,节省了时间和费用。为此 ,特对线性放大技术 的基本原理以及填料粒径、柱尺寸和操作方式等影 响放大的因素作了较为全面的评述 ,进而探讨了高 效制备液相色谱技术的应用和发展前景。 1 　线性放大原理和影响放大的因素 1. 1 　原理 制备色谱不是分析色谱的简单放大 ,放大过程 中通常要考虑色谱柱尺寸、填料、流量、操作压力、进 样量、产品纯度、回收率以及色谱分离效果等因素 (可变和不可变因素) [2 ] 。线性放大的基本假设是分 析色谱系统和制备色谱系统的化学性质、传质过程 都保持不变 ,而进样量、流量、收集体积等乘以线性 放大系数 (表 1) 。线性放大系数即为制备色谱柱截 面积与分析色谱柱截面积之比。利用线性放大技 术 ,可以在分析色谱柱上优化分离方法 ,并直接用大 直径的制备柱 ,既可以节约溶剂的消耗 ,降低整个方 法开发过程的费用 ,也无过程放大风险和样品损失。 如果有可能可尽量使用相同的传输泵和检测器。 1. 2 　影响线性放大的因素 高效制备液相色谱分离过程是按照一定的纯度 要求 ,以最大的产率和可行的投资来生产所需要的 产品。为此 ,必须对过程进行优化和放大[3 ] 。 表 1 　线性放大时色谱柱直径与放大系数、样品负荷量的关系 Table 1 　The relation of column ID and scale - up factor , sample load2 ing during linear magnifying Column ID/ mm Scale - up factor Sample loading 4. 6 1. 0 1 - 4 mg 10. 0 4. 7 5 - 25 mg 21. 4 21. 6 22 - 88 mg 41. 4 81. 0 81 - 324 mg 77 280 0. 28 - 0. 78 g 100 472 0. 47 - 1. 89 g 150 1106 ×103 1. 06 - 4. 24 g 1. 2. 1 　填料粒径 　在高效制备液相色谱中 ,填料粒 径直接影响着柱效、负荷能力及压力。在制备液相 的线性放大过程中 ,使用小颗粒填料 ,可以获得较高 的柱效 (尤其是对于难分离物系 ,可以获得较高的分 离度) ,但压力太大 ,填料价昂 ;也可使用大颗粒填 料 ,获得较大的生产能力 ,且填料便宜 ,但必须以牺 牲柱效为代价 ,或者增加柱长以获得与小颗粒填料 相同的柱效。王志祥等[4 ]利用制备型高效液相色谱 分离装置 ,对牛血清白蛋白 (BAS) 和牛血清红蛋白 华西药学杂志 W C J ·P S 　2005 ,20 (4) :332～333 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (HG)进行了分离 ,考察了填料尺寸对柱效和分离度 的影响。结果表明 ,在制备分离过程中 ,对于难分离 物系 ,可以采用较小直径的色谱填料 ,以提高分离效 率 ,但在分离度可以满足分离要求的前提下 ,使用较 大直径的色谱填料将更为有利。Colin 等[5 ]研究了 溶菌酶在 C18反相填料上的吸附容量与填料孔径的 关系 ,结果表明 ,随孔径增大 ,单位重量填料的比表 面积减小 ,单位重量填料的样品吸附量也随之减小。 因此 ,对不同的目标产物 ,根据其分子大小及物化性 质的不同 ,选择合适孔径及孔径分布的填料是获得 高负载量的一个关键因素。 1. 2. 2 　柱尺寸 　在高效制备液相色谱的线性放大 过程中 ,柱尺寸 (包括柱径和柱长) 同填料粒径、柱 效、操作方式等一起优化时 ,增加柱长 ,可以明显地 提高效率 ,但在满足分离要求的前提下 ,宜采用较短 的制备柱 ;增加柱径 ,虽然分离效果会有一定程度的 损失 ,但可以显著提高制备量。 王志祥等[6 ]证明 ,分离度和柱效与流速变化的 规律相同 ,但柱径不同 ,在相同的流速下 ,大内径柱 的分离效率和柱效明显低于小内径柱的分离效率和 柱效。在色谱分离过程中 ,样品的处理量通常随所 用色谱柱内径的增加而增加。因此 ,为了提高制备 量 ,可以使用内径较大的制备柱 ,但随着柱径的增 加 ,填料装填的不均匀程度也加剧 ,柱子的渗透性较 差 ,浓度、液流速度等在柱内的分布不均匀而使色谱 柱的柱效降低 ,导致分离效果下降。 在制备液相色谱分离中 ,色谱柱不宜太短 ,流动 相在柱进口和出口的不规则流动使柱效降低。增加 柱长所获得的收益有一个极限值 ,当柱长超过某一 长度后 ,由于填充床层的不均匀性 ,使柱效不能随柱 长线性增加 ;另一因素是泵的能力 ,即柱长受泵的最 大操作压力限制。王志祥等[7 ]研究了两种不同柱长 条件下流动相流速对分离度的影响 ,结果表明 ,当柱 长增加一倍时 ,虽然柱效有一定程度的损失 ,但分离 度却明显提高 ,揭示了塔板数与柱长近似成正比 ,分 离度与塔板数的平方根近似成正比。 1. 2. 3 　操作方式　在制备型高效液相色谱中 ,为了 节省投资和操作费用 ,必须以最少的时间生产最大 量的产品。由于目的不同 ,分析型 HPLC 和制备型 HPLC 所选用的操作条件有显著不同。前者要求进 样量愈小愈好 ,且避免柱超载 ;而后者为了提高柱产 量 ,一般需采用柱超载方式进行操作[8 ] 。在制备型 HPLC 中 ,提高处理量可以采用使用小的注入体积 , 但增加样品浓度 ,即所谓的质量超载和保持较小的 样品浓度 ,但增加样品体积 ,即所谓的体积超载两种 操作方式。文献[9 ]讨论了制备型高效液相色谱中的 质量超载 ,认为分离度和柱效均随质量超载程度的 增加而下降 ,但在分离度可以满足要求的前提下 ,采 用质量超载的方式操作可以提高制备量。文献[10 ] 利用自行设计的制备型 HPLC 分离装置 ,以牛血清 白蛋白 (BAS)和牛血清红蛋白 ( HG) 为物系 ,考察了 操作方式对柱效和分离度的影响。结果表明 ,在满 足分离要求的前提下 ,可以采用柱超载方式 ,以提高 制备量。但当一次操作所处理的样品量较小时 ,采 用质量超载较为有利。当一次操作所要处理的样品 量太大 ,导致分离效果不能满足分离要求或样品在 流动相中的流动度达到极限时 ,采用体积超载方式 更为有利。 2 　展望 从分离科学的现有水平来看 ,高效制备液相色 谱法是目前纯化有机小分子以及生物大分子的最佳 手段。然而 ,现有的理论结构还很不完善 ,不能指导 高效制备液相色谱分离过程的放大和优化 ,特别是 柱超载、柱设计等问题并未解决。从工业应用角度 出发 ,研究应着重深入探讨高效制备液相色谱的非 线性色谱理论 ,对其分离过程进行模拟、优化和放大 研究 ,为整个过程的最优设计提供科学依据。作为 一种高效的分离与纯化技术 ,高效制备液相色谱在 中国的工业现代化进程中具有广阔的发展与应用前 景。 参考文献 : [1 ] 　李瑞萍 ,黄骏雄. 高效制备液相色谱柱技术的研究进展 [J ] . 化学进展 ,2004 ,16 (2) :273 [2 ] 　祝立群. 线性放大一制备液相色谱的有效技术[J ] . 现代科学 仪器 ,2001 ,5 :72 [3 ] 　何志敏 ,王志祥 ,余国琮. 制备型高效液相色谱分离技术及其 在生化工程中的应用[J ] . 化工进展 ,1992 ,3 :28 [4 ] 　王志祥 ,张志炳 ,何志敏 ,等. 制备型高效液相色谱分离过程 的放大研究 ( I)填料尺寸[J ] . 化工时刊 ,2001 ,15 (1) :28 [5 ] 　 Colin H , Ludemann - Hombourger O , Nicoud RM. 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