LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 此实验步骤
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用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中（参见
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6了解建议的细胞密度）。 2. 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 此实验步骤设计用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。 1. 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中（参见表6了解建议的细胞密度）。 2. 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。LIPOFECTAMINE 2000稀释后，在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。 注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为LIPOFECTAMINE 2000的稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合。 4. 混合稀释的DNA（由第2步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第3步）。在室温保温20分钟。 注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。 表6. 在24孔板中转染Invitrogen细胞系的推荐使用量 Table 6 Cell Line Cill/well(×10) LIPOFECTAMINE 2000 Reagent(µl) CHO-S 1.5 2.5-3.0 COS-7L 0.8 2.5-3.0 293H,293F 2.0 1.5-2.0 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。 6. 在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。 贴壁哺乳动物细胞的DNA转染步骤 此步骤专门设计使用LIPOFECTAMINE，LIPOFECTIN，DMRIE-C或CELLFECTIN试剂在6孔板转染贴壁的哺乳动物细胞。 使用这些试剂时，欲得到最佳转染效率，条件的优化必不可少。参考右侧阳离子脂质体试剂和DNA优化步骤。健康的，正在增生的细胞和恒定的细胞密度对于可重复性的结果不可或缺。
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