测定细菌生长曲线（沈睿）

测定细菌生长曲线 生 92 沈睿 2009012372 同组成员：徐鲁斌 赵磊 韦人 杨丹灵 实验日期：2011-5-15 一． 实验目的 1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时。 2. 学习液体培养基的配制及注意事项。 3. 学习液体种子和固体种子的不同接种方法和注意事项。 4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同。 5. 利用细菌悬液浑浊度间接测定细菌生长。 二． 实验原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养， 定时测定培养液中的菌量，以总菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线 叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生 长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为调整期、对数期、平衡期和死 亡期。而代时则是微生物生长过程中衡量微生物增值速度的一项重要参数，可从生长曲 线数据计算得出。生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程动态。不同微生物有 不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测 定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。 1. 调整期 细菌接种到新鲜培养基而处于一个新的生长环境，因此在一段时间里并不马上 分裂，细菌的数量维持恒定，或增加很少。此时胞内的 RNA、蛋白质等物质含量有 所增加，相对地，此时的细胞体积最大，说明细菌并不是处于完全静止的状态。 2. 对数期 细菌经过前一段的诱导适应后进入对数生长期，并以最大的速率生长和分裂， 导致细菌数量呈对数增加，而且细菌内各成分按比例有规律地增加，很明显此时期 内的细菌生长是平衡生长。对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定，大小比 较一致，生活力强，因而它广泛地在生产上用作种子和在科研上作为理想的实验材 料。 3. 平衡期 当细胞的繁殖速度达到最高峰时，其细胞总数就不会再增加，由于上两阶段糖 类营养物质的消耗，代谢产物乙醇的积累和 pH、氧化还原电势等环境变化，逐步 不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零（即细菌分裂增加的数量等于细菌死 亡数），结束对数生长期，进入稳定生长期。稳定生长期的活细菌数最高并维持稳 定。 4. 死亡期 营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐 步减少，标志进入衰亡期。该时期细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶。该时 期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使 细菌死亡的速率降低。 5. 代时 从生长曲线可以计算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以 G 表示。计 算公式为：G = (t2−t1)×log 2 (log W2−log W1) 。式中 t1和 t2 为所取对数期两点时间，W1和 W2为相 应时间测得的细胞含量或 OD 值。 测定微生物的数量有多种不同的方法，如血细胞计数法，平板菌落计数法，称 重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD600 值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌液的光密度来推知菌液的浓度，并将所 测的 OD 值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此 法快捷、简便。 三． 实验器材 1. 取液器（5000ul, 1000ul 各一支），培养箱，摇床，722s 分光光度计，无菌 1000ul 吸头 80 个，无菌 5000ul 吸头 2 个，比色皿 7 个和共用参比杯 1 个，平板，培养瓶 等。 2. 菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌 3. 培养基（100ml/250ml 三角瓶×8 瓶/大组） 牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基，配方（总量 1000mL）： 牛肉粉 3g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；葡萄糖 10（g/L），pH7.5。 四． 实验步骤 1. 准备菌种 将大肠杆菌，金黄色葡萄球菌分别接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中， 在 37oC，200rpm 摇床上培养 14-18h，另外准备大肠杆菌平板 1 块（37oC，24h）。 2. 接种 每 3 个小组组成一个大组，每小组负责以下部分实验内容，按照如下的方法在 培养瓶中进行接种和培养。 第一小组： 1-1：取 1.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 1-2：取 3.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 1-3：取 5.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 第二小组： 2-1：取一个大肠杆菌菌落接种到 100ml 培养基，30 oC，200rpm 2-2：取 1.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，110rpm 2-3：取 1.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，30 oC，200rpm 第三小组： 3-1：取 1.0ml 金黄色葡萄球菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 3-2：取 1.0ml 金黄色葡萄球菌菌液接种到 100ml 培养基，30 oC，200rpm 3-3：取 1.0ml 金黄色葡萄球菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，110rpm 3. 取样 在培养过程中，隔一小时（或半小时）取样一次.，3 个小组分别进行实验，最 终汇总实验结果。全班同时取样，同时开始振荡，取样期间时间不算。 4. 测量 取 500μl 培养液到 2000μl 蒸馏水中，以蒸馏水为对照，测 OD600；注意固定参 比杯，不要调动波长旋钮；固定一台分光光度计; 零小时也要测，把结果填入表格 中（也可测 OD420，OD620 等，本组选用 OD600）。 五． 实验结果与讨论 1. 培养菌液吸光度数据及处理 开始取样时间 9:36 10:36 11:35 12:10 12:45 13:25 14:00 15:05 16:10 17:10 18:15 19:20 结束取样时间 9:41 10:50 11:43 12:12 12:49 13:31 14:05 15:10 16:14 17:12 18:25 19:29 OD600 1-1 0.004 0.024 0.083 0.092 0.125 0.114 0.136 0.127 0.167 0.203 0.226 0.260 1-2 0.046 0.061 0.120 0.148 0.165 0.159 0.169 0.219 0.275 0.300 0.335 0.380 1-3 0.058 0.124 0.193 0.375 0.220 0.217 0.231 0.264 0.310 0.364 0.408 0.436 2-1 0.001 -0.009 -0.000 0.000 0.000 0.005 0.026 0.074 0.114 0.140 0.148 0.169 2-2 0.007 0.029 0.078 0.105 0.111 0.125 0.137 0.152 0.155 0.193 0.194 0.198 2-3 0.013 0.017 0.058 0.093 0.127 0.145 0.160 0.189 0.187 0.234 0.245 0.273 3-1 0.005 0.045 0.076 0.070 0.103 0.122 0.115 0.203 0.268 0.350 0.401 0.422 3-2 0.045 0.016 0.071 0.025 0.050 0.059 0.074 0.105 0.161 0.151 0.210 0.214 3-3 0.074 0.012 0.045 0.049 0.073 0.091 0.141 0.137 0.169 0.191 0.231 0.253 表 1 菌液吸光度原始数据 发酵时间（h） 0 1 2 2.5 3 3.5 4 5 6 7 8 9 OD600 1-1 0.000 0.020 0.079 0.088 0.121 0.110 0.132 0.123 0.163 0.199 0.222 0.256 1-2 0.000 0.015 0.074 0.102 0.119 0.113 0.123 0.173 0.229 0.254 0.289 0.334 1-3 0.000 0.066 0.135 0.317 0.162 0.159 0.173 0.206 0.252 0.306 0.350 0.378 2-1 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.004 0.025 0.073 0.113 0.139 0.147 0.168 2-2 0.000 0.022 0.071 0.098 0.104 0.118 0.130 0.145 0.148 0.186 0.187 0.191 2-3 0.000 0.004 0.045 0.080 0.114 0.132 0.147 0.176 0.174 0.221 0.232 0.260 3-1 0.000 0.040 0.071 0.065 0.098 0.117 0.110 0.198 0.263 0.345 0.396 0.417 3-2 0.000 0.000 0.026 0.000 0.005 0.014 0.029 0.060 0.116 0.106 0.165 0.169 3-3 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.017 0.067 0.063 0.095 0.117 0.157 0.179 表 2 菌液吸光度处理后（扣去初始吸光度）数据（背景为浅蓝色的数据原为负数， 是数据较小时分光光度计不准确所致，所以在计算中作为 0.000 考虑） 2. 绘制生长曲线（OD-t） 根据处理后得到的表 2 数据分组、分条件绘制生长曲线图，并作拟合，使用的 作图软件为 origin8.0 和 Excel2007。具体曲线图和 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 见下。 1） 1-1 组：取 1.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 图 1 小组 1-1 的 OD-t 图 从图中可以观察到调整期（0-1 小时），但是之后的增长不太符合对数期的 增长模式，而且在培养的整个时间段内没有出现平衡期，因为在这个环境下培 养 9 个小时还不足以使细菌消耗的营养物质和积累的代谢产物达到平衡期的标 准。因为平衡期尚未出现，死亡期必然还没有经历。当然，在比浊法的使用过 程中，确实不易观察到死亡期，因为分光光度计所测的是总菌体含量，而不是 活菌含量。 2） 1-2 组：取 3.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 图 2 小组 1-2 的 OD-t 图 从上图可以看出 0-1 小时的调整期，而类似对数期的 2-9 小时增速不大， 平衡期没有出现。 3） 1-3 组：取 5.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 图 3 小组 1-3 的 OD-t 图 上图中，调整期大约出现在 0-0.5 小时段，由于第四个数据点异常地大，可 能是该小组未将样品混匀就进行了测定，导致图中显示的对数期也不同寻常， 平衡期从趋势看即将来到。比起 1-1，1-2 组，平衡期显得更近是因为初始加入 的菌液有 5ml，消耗营养物质和产生代谢产物的速度更快。 4） 2-1 组：取一个大肠杆菌菌落接种到 100ml 培养基，30 oC，200rpm 从图中能明显地看到调整期（0-4 小时），对数期（4-7 小时）及之后的平 衡期。相比第一大组，这小组由于初始加入的是平板上的菌落而非菌液，所以 图 4 小组 2-1 的 OD-t 图 需要更长的时间来调整适应培养基的环境，故调整期较长。另一方面，对数期 的斜率较之前大组小，说明生长较为缓慢。 5） 2-2 组：取 1.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，110rpm 图 5 小组 2-2 的 OD-t 图 从拟合曲线中可以看到调整期相当短，几乎在接种后就马上能适应培养的 环境了。而对数期（1-6 小时）增长比较缓慢，之后的平衡期能被观察到。 6） 2-3 组：取 1.0ml 大肠杆菌菌液接种到 100ml 培养基，30 oC，200rpm 图 6 小组 2-3 的 OD-t 图 细菌在这个培养环境下也很快进入对数期（0-9 小时），而平衡期没有出现。 7） 3-1 组：取 1.0ml 金黄色葡萄球菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，200rpm 图 7 小组 3-1 的 OD-t 图 调整期（0-3 小时），对数期（3-8 小时），平衡期（9 小时后）。 8） 3-2 组：取 1.0ml 金黄色葡萄球菌菌液接种到 100ml 培养基，30 oC，200rpm 图 8 小组 3-2 的 OD-t 图 调整期（0-4 小时），对数期（4-8 小时），品衡期（9 小时后）。 9） 3-3 组：取 1.0ml 金黄色葡萄球菌菌液接种到 100ml 培养基，37 oC，110rpm 图 9 小组 3-3 的 OD-t 图 调整期（0-4 小时），对数期（4-9 小时），根据趋势推测平衡期就在 9 小时 后。 10） 初始浓度对细菌生长的影响 图 10 不同初始浓度组的大肠杆菌菌液 OD-t 图 相同温度和摇床转速下，接种后初始浓度越高，调整期越短，而从图中较 难观察出对数期长短比较和增速比较，相差不大，但从理论上可以推断，初始 浓度较高组的对数期持续时间应该较短，因为含菌量大，单位时间内消耗营养 物质就会更多，产生代谢产物也会更多。从总体上来说，初始浓度越高的组每 时刻的含菌量都相应更高。 11） 接种类型对细菌生长的影响 图 11 不同接种类型组的大肠杆菌菌液 OD-t 图 从实验结果可以看出，液体种子的调整期明显短于固体种子，可能是因为 液体种子接种至培养基前后培养环境差异较小，而固体种子前后环境差异大， 所以需要更长时间适应。菌落接种的对数期较短、代时较小，可能是因为但菌 落中细菌对营养等需求一致，在调整后，能迅速生长繁殖。 12） 温度对细菌生长的影响 在相同初始浓度和摇床转速下观察温度对细菌生长的影响。从图 12 可以看 到，调整期温度较高组菌含量较多，而到了对数期，反而温度较低组菌含量更 多，但总体上两者相差不大。由图 13 则可以发现，温度造成菌含量差异非常明 显，温度较高组的菌含量明显高于温度较低组。查阅资料后可知两种菌的最适 生长温度都是 37 度，金葡组的结果很符合，而大肠杆菌组出现了偏差。导致偏 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 时间（小时） 1ml，37度， 200rpm 3ml，37度， 200rpm 5ml，37度， 200rpm -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 时间（小时） 菌落，30度， 200rpm 1ml，30度， 200rpm 图 12 不同温度组的大肠杆菌菌液 OD-t 图 图 13 不同温度组的金黄色葡萄球菌菌液 OD-t 图 差的原因可能是一开始接种时取量出现了偏差，30 度组接种量多于 37 度组， 或者是测量吸光度时每次混得都不够匀，造成数值不稳定。 13） 摇床转速对细菌生长的影响 图 14 不同摇床转速的大肠杆菌菌液 OD-t 图 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 时间（小时） 1ml，37度， 200rpm 1ml，30度， 200rpm 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 时间（小时） 1ml，37 度，200rpm 1ml，30 度，200rpm 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 时间（小时） 1ml，37度， 200rpm 1ml，37度， 110rpm 图 15 不同摇床转速的金黄色葡萄球菌菌液 OD-t 图 摇床转速的增加表示溶氧度的提高，意味着供氧更充足，对于兼性厌氧（如 大肠杆菌）和需氧细菌（如金黄色葡萄球菌）来说，能提供更好的生长环境。 所以在图 14 和图 15 中可以看到在初始浓度和培养温度相同的情况下，摇床转 速越大，生长更旺盛，调整期也更短。 14） 不同菌种对细菌生长的影响 图 16 相同培养条件下大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长曲线对比图 （大表示接种大肠杆菌，金表示接种金黄色葡萄球菌） 在图 16 中分别对比三组相同的情况，除了 1ml，37 度，200rpm 组，其他 两组中大肠杆菌的生气长情况更好，调整期更短，对数期也短，意味着代时较 短，生长繁殖速度快。而 1ml，37 度，200rpm 组的结果产生主要是由于改组中 接种大肠杆菌的组出现了一些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，把这组大肠杆菌和 1ml，30 度，200rpm 组 的大肠杆菌比较也相差无几，而这与大肠杆菌在 37 度时生长最佳也是矛盾的。 3. 代时计算 根据表 2 中所得的 OD 数据，和所绘制的细菌生长曲线（OD-t），可计算每组细 菌生长的代时 G。计算时选取每组生长曲线对数期内的两组数据，带入代时的计算 公式：G = (t2−t1)×log 2 (log W2−log W1) ，式中 t1和 t2 为所取对数期两点时间，W1 和 W2 为相应时 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 时间（小时） 1ml，37 度，200rpm 1ml，37 度，110rpm -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 2 4 6 8 10 O D 6 0 0 时间（小时） 大，1ml，37度， 200rpm 大，1ml，37度， 110rpm 大，1ml，30度， 200rpm 金，1ml，37度， 200rpm 金，1ml，30度， 200rpm 金，1ml，37度， 110rpm 间测得的细胞含量或 OD 值。具体计算结果如下表所示： 组别 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 t1(h) N/A 4 N/A 4 3 3.5 5 4 5 W1 N/A 0.123 N/A 0.025 0.104 0.132 0.198 0.029 0.063 t2(h) N/A 6 N/A 5 4 7 6 5 6 W2 N/A 0.229 N/A 0.073 0.130 0.221 0.263 0.060 0.095 代时 G (h) N/A 2.23 N/A 0.65 3.11 4.71 2.44 0.95 1.69 表 3 各组代时计算表（N/A 表示由于数据的波动太大，无可用于计算的数据） 4. pH 值 对照组：6.7 组号 7-1 小组 7-2 小组 7-3 小组 -1 7.5 7 未测 -2 7.7 7.2 未测 -3 7.7 7 未测 表 4 培养结束后测得的 pH 表 经过培养后，大肠杆菌作为产酸的菌种，pH 相比于对照组应该有所下降，但 是实验结果却比对照组 pH 值大。可能原因是大肠杆菌先利用糖，分解产酸会使 pH 下降，但随后继续繁殖或杂菌的生长，促使蛋白胨的分解，产生了代谢产物又呈现 碱性，因此会表现出 pH 增大现象。 六． 实验思考 1. 计算出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基中对数生长期中 的代时（min）（繁殖一代的时间），为什么比理论时间长好多？ 答：大肠杆菌由实验计算得到的代时为 0.65 小时即 39 分钟，理论值为 17 分钟。金黄 色葡萄球菌实验得到代时为 0.95 小时即 57 分钟，理论值为 27-30 分钟。造成实验测得 代时比理论值长的原因可能有以下几点： 1） 细菌不断消耗营养物质，产生代谢产物，影响了细菌生长，增加代时。 2） 培养过程中通风不好，摇床速度也不一定是最佳，溶氧度不够，影响细菌生长，增 加代时。 3） 培养基中没有酸碱缓冲液，所以 pH 改变较大，影响细菌生长，增加代时。 4） 取出培养瓶测 OD 值时有一定的时间脱离了培养环境，造成温度和溶氧情况的改变。 2. 为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况？ 答：因为菌液中菌体的总浓度（包括活菌和死菌）和其浑浊度成正比。用分光光度计可 测定菌液的吸光度来表示菌液的浑浊度，从而得出菌体总浓度。作 OD-t 图，可得菌液 中菌体总含量随时间变化的关系曲线，即生长曲线，从而反应细菌的生长状况。但是， 吸光度指示的是菌液中菌体总含量，而非活菌量，所以在生长曲线中没有明显的死亡期。 3. 生长曲线中为什么会有稳定期和衰退期？ 答：实验中细菌的培养环境是封闭式的，中途也没有补料，所以随着营养物质的消耗、 代谢产物的积累和 pH 等环境因素的变化，培养基会变得不再适于细菌生长繁殖。从而 导致细菌量的净增长率接近于零（单位时间内细菌二分裂增加的细胞数接近于细菌死亡 的细胞数量），标志细菌生长进入稳定期（活菌数量恒定）。 之后，随着营养物质的耗尽和有毒代谢产物的大量积累，以及 pH 等条件的进一步恶化， 细菌死亡的速率逐步增加，活细菌逐渐减少，生长进入衰退期（活菌数量下降）。 4. 什么条件下接种为宜？液体种子比固体种子有什么优越性？ 答：最适宜的接种环境是和原生长环境相似的培养环境。这样细菌不需要很长时间调节 就能适应新环境。最适宜的接种菌种应该是处在生长曲线的对数期的菌液。此时细菌已 度过调整期，生长繁殖最旺盛，生命力最强大，各种分解和合成代谢反应都被充分激活， 对环境有最强的适应能力。 液体种子与固体种子相比，更易于扩散分布到培养基中，而且前后培养环境也很相似， 细菌不需要经过太长的调整期。而固体种子会有一部分粘附在接种环上，即使是进入培 养基的细菌也不易扩散，前后环境改变较大，需要一段较长时间适应。 5. 根据实验结果，谈谈在工业上如何缩短发酵时间？ 答：从实验结果来看，接种量、温度、摇床速度（溶氧度）、接种类型（固体种子或液 体种子）等条件对细菌的生长情况都有较大影响。所以在工业上也应该依据类似的原则， 采取液体接种的方式，将已经在与发酵培养基相同条件下培养好的菌液（接种量适当大） 接种至发酵体系中，同时保证培养基内溶氧量充足，温度也始终保持在发酵菌种的最适 温度，同时保证营养的充足供应和 pH 等环境条件的稳定，从而缩短发酵时间。 6. 有人觉得摇瓶发酵和发酵罐发酵测量的生长曲线一样，需要取消一次实验，你认为 一样吗？试比较摇瓶发酵和发酵罐发酵测量的生长曲线的异同点？ 答：两者有一定的区别，所以不应取消。 相同点是，都在制定温度和接种量下培养，前者的摇床用摇床来保持一定溶氧度，后者 用搅拌器保持一定溶氧度。 不同点是： 1） 摇瓶发酵在测定 OD 值时细菌会脱离培养环境，造成中断，温度、溶氧量等都会受 到影响，而发酵罐不会，取液的同时依旧在培养中，过程连续。 2） 摇瓶虽然用摇床控制溶氧度，但实际上很难保持一个恰当的度，而发酵罐则可以通 过搅拌、通气来控制。 3） 发酵罐可以全过程追踪 pH，并进行相应调节，以维持酸碱环境适合细菌生长。 七． 致谢 感谢陈老师和所有助教的及时的答疑解惑，给了我们实验很大的帮助。这次实验靠全组 同学通力合作才得以完成，谢谢伙伴们。 八． 参考资料 1. 《微生物学实验指导》，清华大学出版社，陈金春 陈国强 主编，2005 年 8 月 2. http://www.kepu.net.cn/gb/lives/microbe/microbe_life/200310170086.html