实验教学的组织与实施

生物化学与分子生物学实验指导 （补充讲义） 实验教学的组织与实施 南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心 二 O一一年九月 目 录 第 1章 实验讨论 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 …………………………………………………………1 第 2章 实验报告的要求………………………………………………………7 第 3章 实验操作考核的要求…………………………………………………12 第 4章 设计性实验教学的组织实施…………………………………………16 一、目的要求 二、组织实施 三、设计性实验要求 四、实验设计书格式要求 五、实验设计书范例 六、历届广东大学生生物化学实验技能大赛获奖项目 1 第一章 实验讨论题 实验 1-1 蛋白质的定量测定（微量凯氏定氮法） 1．用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量时，为什么要做空白管测定？消化、蒸馏和滴定 过程中各应注意什么问题？ 2．使用本测定法时产生误差的可能原因有哪些？ 实验 1-2 蛋白质的定量测定（双缩脲法） 1．干扰本实验的因素有哪些？ 2．用双缩脲法测定血浆总蛋白浓度时，所用的试剂和仪器能否含有铵盐？为什么？ 实验 1-3 蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法） 1．若所测得样品的浓度低于实际值，可能会有哪些影响因素？ 2．该方法有什么优缺点？ 实验 1-4 蛋白质的定量测定（BCA法） 1．比较 BCA 法与双缩脲法、Lowry 法有何异同？ 2．BCA 法常用于科研，其有哪些特点？ 实验 1-5 蛋白质的定量测定（考马斯亮蓝染色法） 根据下列所给的条件和要求，选择一种或几种常用蛋白质定量方法测定蛋白质的浓度： （1） 样品不易溶解，但要求结果较准确。 （2） 要求在半天内测定 60 个样品。 （3） 要求很迅速地测定一系列试管（30 支）中溶液的蛋白质浓度。 实验 1-6 蛋白质的定量测定（紫外吸收法） 1．若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 2．用紫外吸收法测定蛋白质含量有何优缺点？易受哪些因素的影响？测定时能否用玻 璃比色杯？为什么？ 实验 2 蛋白质相对分子量测定（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳） 1．在不连续体系 SDS-PAGE 中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 2．电极缓冲液中甘氨酸的作用? 3．在不连续体系 SDS-PAGE 中,分离胶与浓缩胶中均含有 TEMED 和 AP，试述其作用? 4．样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟? 实验 3 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量 1．电泳后各区带应明显分开，如分离不清或不整齐，试分析其可能存在的原因。 2 2．电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 实验 4 氨基酸的薄层层析 1. 实验操作过程中，为何不能用手直接接触滤纸？ 2. 薄层层析与纸层析相比有何异同？ 实验 5 氨基酸的纸层析 1．如果对照管在沸水中煮的时间不够充分，会在层析结果中出现什么现象？ 2．实验结果中有谷氨酸吗?为什么? 3．如果样品中如有多种氨基酸，且其中某些氨基酸的 Rf值相同或相近，如何有效分离？ 实验 6 过氧化氢酶米式常数的测定 1．根据实验结果分析过氧化氢酶 Km 测定值的影响因素。 2．细胞中存在谷胱苷肽过氧化物酶，这种测定方法对 Km 有如何影响？ 实验 7 血清丙氨酸氨基转移酶活性测定（赖氏法） 1．测定血清 ALT 活性有何意义？ 2．如果血清 ALT 活性超过 150 卡氏单位单位时如何处理？ 实验 8 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 1．反应时间与 [I]/[S]的关系及竞争性抑制的特点。 2．抑制的分类及其特点。 3．本实验中液体石蜡的作用? 4．各管中的反应体系配好后为什么不能再摇动? 5．制备心肌匀浆时用磷酸缓冲液的作用。 实验 9 乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖电泳法测定 1．LDH 同工酶活性染色测定，在临床上的作用。 2．总结做好本实验的关键。 实验 10-1 血糖的定量测定（Folin-吴宪法） 采用 Folin-吴宪法测定血糖浓度主要需要排除那些物质干扰？ 实验 10-2 血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法） 采用该方法测定血糖含量主要受哪些因素影响，与 Folin-吴宪法比较，有何优缺点？ 实验 10-3 血糖的定量测定（己糖激酶法） 己糖激酶法与葡萄糖氧化酶法相比具有更高的特异性，为什么？ 实验 11-1 尿中乳酸含量的定性分析 3 影响本实验结果的因素有哪些？ 实验 11-2 血液中乳酸含量的定量测定 试分析血乳酸测定的影响因素。 实验 12 血清甘油三酯的测定（乙酰丙酮显色法） 血清 TG 测定的影响因素有哪些，如何避免？ 实验 13 血清总胆固醇的测定（胆固醇氧化酶法） 总胆固醇测定的影响因素有哪些？ 实验 14 核酸的定量测定 实验 14-1 核酸的定量测定（定磷法） 1．如何控制所用水的质量、消化时间、钼酸铵的质量和显色时酸的浓度对测定结果的 影响？ 2．定磷法操作中有哪些关键环节？ 实验 14-2 核酸的定量测定（紫外吸收法） 1．若所测得样品的浓度低于实际值，可能会有哪些影响因素？ 2．若所测样品的 260 / A280 比值偏低，可能会由哪些因素造成？ 实验 14-3 DNA的定量测定（二苯胺法） 利用二苯胺法测定 DNA 含量时，若 DNA 样品中混有 DNA 或蛋白质、糖类时，是否 会有干扰？ 实验 14-4 RNA的定量测定（地衣酚法） 利用本法测定 RNA 的含量，灵敏度较高，但特异性较差，有哪些干扰因素？如何排除 干扰？ 实验 15 核酸的琼脂糖凝胶电泳 实验 15-1 DNA的琼脂糖凝胶电泳 1．若电泳结果没出现DNA条带，可能是由哪些因素导致？应该采取怎样相应的对策？ 2．如何通过分析电泳图谱评判基因组 DNA、质粒 DNA 等提取物的质量？ 实验 15-2 RNA的甲醛变性凝胶电泳 1．如何判断RNA提取物的质量？操作中如何避免RNA酶的污染？ 2．可用DNA 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品来衡量未知RNA片段的大小吗？ 实验 16 核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳 1．核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳有何不同？ 2．若DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳后不出条带甚至没有泳道，是何原因所致？ 4 实验 17 DNA的聚合酶链式反应 1．根据实验结果分析讨论本实验的成功经验或存在问题。 2．如何在 PCR 实验中设计对照（包括阴性、阳性、空白对照）以便在实验失败时寻 找原因？ 实验 18 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与定量 1．应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和 γ-球蛋白的纯度，根据什 么来确定它是清蛋白还是 γ-球蛋白？判定它们纯度的依据是什么？ 2．为什么实验中 DEAE 纤维素柱分离 γ-球蛋白后不用再生，可直接用于纯化清蛋白？ 3．硫酸铵盐析一步，为什么是 0.8ml 血清加 0.8ml 饱和硫酸铵？ 实验 19 碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析 实验 19-1 碱性磷酸酶的分离纯化和比活性测定 哪些因素会影响比活性测定的准确性？ 实验 19-2 底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响 根据实验结果分析影响测定准确性的因素。 实验 19-3 pH对碱性磷酸酶活性的影响 1．pH 影响酶活性的原因。 2．最适 pH 值的应用。 实验 19-4 温度对碱性磷酸酶活性的影响 1．温度影响酶的活性有哪些因素？ 2．热稳定性曲线的应用 实验 20 肝糖原的提取、鉴定与定量 1．糖原为什么与碘作用成红色？这与淀粉有何不同？ 2．在提取肝糖原实验中，使糖原从溶液中沉淀析出应添加什么试剂？ 实验 21 血清脂蛋白的电泳分离与定量测定 实验 21-1 血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳 1．比较比色法与扫描定量法的结果，并分析原因。 2．根据实验结果分析患者的高脂蛋血症分型。 实验 21-2 血清高密度脂蛋白-胆固醇的分离与定量测定（磷钨酸-镁沉淀法） 该方法测定 HDL-C 有哪些影响因素？怎么影响测定结果？温度有影响吗？ 实验 22 质粒 DNA的提取、定量与酶切鉴定 5 实验 22-1 质粒 DNA的小量提取（碱裂解法） 实验 22-2 高纯质粒小量制备（试剂盒法，离心柱型） 1．提取的质粒 DNA 进行定量测定或电泳后，结果显示提取的量很少，可能的原因是 什么？ 2．质粒 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳后，电泳点样孔中有亮带，原因是什么？是哪些操 作步骤失误会导致这种现象？ 3．质粒 DNA 进行定量测定后，A260/A280 > 1.8， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 了什么？怎样解决这个问题？ 实验 22-3 质粒 DNA的定量（紫外分光光度法） 实验 22-4 质粒 DNA的酶切鉴定 1．如果酶切要用的两种限制性内切酶的缓冲液不同，应该怎样做？ 2．酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，只看到一条区带，大小与未酶切的质粒相同，出 现这种现象的原因是什么，如何解决？ 3．如何设立对照，判断双酶切是否成功？ 实验 23 基因组 DNA的提取、定量与鉴定 实验 23-1 细菌基因组 DNA的提取、定量与鉴定 实验 23-2 动物组织基因组 DNA的提取、定量与鉴定 1．提取基因组 DNA 后定量测定或电泳检测后，发现产物的量很少，分析造成这种现 象可能的原因，并提出相应的解决办法。 2．提取的基因组 DNA 进行电泳检测时看到如下图 1 所示的现象，说明了什么？如何 解决？ 6 图 1 某实验基因组 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图 3．一条染色体含有一条 DNA，基因组中不同的染色体 DNA 的大小是不同的。所以理 论上所提取的基因组 DNA 中含有多条大小不一的 DNA。但为什么用琼脂糖电泳后仅能见 到一条主带呢？ 实验 24 总 RNA的提取、定量与逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 实验 24-1 总 RNA的提取与定量 结合实验结果分析讨论 RNA 提取操作时影响实验成败的原因。 实验 24-2 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR） 1．根据实验结果分析讨论本实验的成功经验或存在问题并提出改进的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。 2．利用 RT-PCR 方法比较基因表达的差异时应如何设计实验？ 实验 25 Southern杂交 实验 25-1 基因组 DNA样品的限制性酶切 1．如何确定基因组 DNA 的酶切用量？ 2．如何设计对照反应，使样品基因组 DNA 消化完全？ 3．如果需要多种酶消化 DNA，如何进行多酶切？ 实验 25-2 酶切样品的琼脂糖凝胶电泳 实验 25-3 DNA的变性、转膜与固定 实验 25-4 杂交与杂交后清洗 实验 25-5 杂交结果的检测 1．如果没有杂交信号或者信号很弱，分析可能由哪些情况引起？ 2．泳道背景较高，如何降低背景？ 实验 26 斑点及狭缝杂交 1．狭缝杂交结果中不同深浅的条带代表什么意义？ 2．利用斑点杂交对样品 DNA 进行半定量分析时应如何设计实验，结果如何分析？ 7 第二章 实验报告的要求 实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告，并在 24 小时内送交老师评 阅。生化实验报告主要包括五个部分内容：①实验原理；②实验材料；③实验步骤；④结 果；⑤讨论。 一、实验报告的基本格式 【实验名称】 【实验日期】 【实验地点】 【合 作 者】 【指导老师】 [实验预习报告]（此标题不写） 一、实验原理 二、实验材料 三、实验步骤 评分： [实验结果与讨论] （此标题不写） 四、结果 五、讨论 评分： 【总 分】 【教师签名】 【批改日期】 【实验记录】（另起一页，此标题保留） 评分： 教师签名： 二、实验报告的基本要求 实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提 高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。 1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪 器与器材）、③实验步骤（包括实验流程与操作步骤）要求在实验课前预习后撰写，作为实 验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 8 3．每项内容的基本要求 （1）实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 （2）实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪器。说明化学试剂时要避 免使用未被普遍接受的商品名和俗名。试剂要标清所用的浓度。 （3）实验步骤：描述要简洁，不能照抄实验讲义，可以采用工艺流程图的方式或自行 设计的表格来表示，但对实验条件和操作的关键环节应写清楚，以便他人重复。 （4）结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整 理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果，如实验组与对照组实验结果 的比较表等(有时对实验结果还可附以必要的说明)。 （5）讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。如对定性实验， 在分析实验结果的基础上应有中肯的结论。还可以包括关于实验方法、操作技术和有关实 验的一些问题，对实验异常结果的分析和评论，对于实验设计的认识、体会和建议，对实 验课的改进意见等。 （6）结论：一般实验要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的结果。 三、实验报告的评分标准（100分制） 1．实验预习报告内容（30分） 学生进入实验室前应预习实验，并书写预习报告。实验预习报告应包括以下三部分： ①实验原理（10 分）：要求以自己的语言归纳要点；②实验材料（5 分）：包括样品、试剂 及仪器。只列出主要仪器、试剂（常规材料不列）；③实验方法（15 分）：包括流程或路线、 操作步骤，要以流程图、表格式给出要点，简明扼要。依据各部分内容是否完整、清楚、 简明等，分以下三个等级给分。 优秀 合格 不合格 30~25 24~18 分 17~0 分 优秀：项目完整，能反映实验者的加工、整理、提炼。 合格：较完整，有一定整理，但不够精炼。 不合格：不完整、缺项，大段文字，完全照抄教材，记流水账。 实验预习报告不合格者，不允许进行实验。该实验应重新预约，待实验室安排时间后 方可进行实验。 2．实验记录内容（20分） 实验记录是实验教学、科学研究的重要环节之一，必须培养严谨的科学作风。 9 实验记录的主要内容包括以下三方面：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂 的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对 和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变 化）；③原始实验数据：设计实验数据表格（注意三线表格式），准确记录实验中测得的原 始数据。记录测量值时，要根据仪器的精确度准确记录有效数字（如吸光值为 0.050，不应 写成 0.05），注意有效数字的位数。 实验记录应附在实验报告后，另起一页在实验过程中书写；应该用钢笔或者圆珠笔记 录，不能用铅笔。记录不可擦抹和涂改，写错时可以准确划去重记。记录数据时请教师审 核并签名。 实验记录分以下三个等级给分。 优秀 合格 不合格 20~17 16~13 分 12~0 分 优秀：如实详细地记录了实验条件、实验中观察到的现象、结果及实验中的原始数据 （如三次测定的吸光度值）等；实验记录用钢笔或者圆珠笔记录，没有抹擦和涂改迹象。 书写准确，表格 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 （三线表）。有教师的签字审核。 合格：记录了主要实验条件，但不详细、凌乱；实验中观察到的现象不细致；原始数 据无涂改迹象，但不规范。有教师的签字审核。 不合格：记录不完整，有遗漏；原始数据有抹擦和涂改迹象、捏造数据（以 0 分计）； 图、表格形式错误；用铅笔记录原始数据；无教师的签字审核。 若记录的结果有怀疑、遗漏、丢失，必须重做实验，培养严谨的科学作风。 3．结果与讨论（45分） （1）数据处理（5 分） 对实验中所测得的一系列数值，要选择合适的处理方法进行整理和分析。数据处理时， 要根据计算公式正确书写中间计算过程或推导过程及结果，得出最终实验结果。要注意有 效数字的位数、单位（国际单位制）。经过统计处理的数据要以 X±SD 表示。可分成以下 三个等级给分。 优秀 合格 不合格 5 分 4 分 3~0 分 优秀：处理方法合理，中间过程清楚，数据格式单位规范。 合格：处理方法较合理，有中间计算过程；数据格式单位较规范。 10 不合格：处理方法不当；无中间过程；有效数字的位数、单位不规范。 （2）结果（20 分） 实验结果部分应把所观察到的现象和处理的最终数据进行归纳、分析、比对，以列表 法或作图法来表示。同时对结果还可附以必要的说明。 要注意图表的规范：表格要有编号、标题；表格中数据要有单位（通常列在每一列顶 端的第一行或每一行左端的第一列）。图也要有编号、标题，标注在图的下方；直角坐标图 的纵轴和横轴要标出方向、名称、单位和长度单位；电泳图谱和层析图谱等要标明正、负 极方向及分离出的区带、色带或色斑的组分或成分。电泳结果还要标记泳道，并在图题下 给出泳道的注释；要标出分子量标准的各条带的大小。并且注意需要结合图表对结果进行 较详细的解释说明。 可分成以下三个等级给分。 优秀 合格 不合格 20~17 16~13 分 12~0 分 优秀：实验结果有归纳、 解释说明，结果准确，格式规范。 合格：堆砌实验现象、数据，解释说明少。 不合格：最终实验结果错误且无解释说明，图表、数字不规范。 （3）讨论（20 分） 讨论应围绕实验结果进行，不是实验结果的重述，而是以实验结果为基础的逻辑推论， 包括实验方法（操作步骤）、实验过程中遇到的问题、差错教训和实验现象、数据的综合分 析、解释说明，如实验异常结果的原因分析；提出今后实验中需要注意和改进的地方；以 及对实验设计的认识、体会和意见；对实验技术、方法的改进意见等等。同时能结合查阅 的其他文献等资料进行讨论，有独到的见解。讨论的最后应在实验结果的基础上有一个简 短而中肯的结论。也分三个等级给分。 优秀 合格 不合格 20~17 16~13 分 12~0 分 优秀：分析实验结果的问题与经验；分析实验设计的优劣；能提出实验技术、方法的 改进意见；能结合自己查阅的其他资料来讨论，有自己独到的见解；有结论。 合格：仅针对实验结果进行讨论，有一定自己的见解。 不合格：将讨论写成注意事项分析或回答思考题等，与实验结果无关。 4．格式与版面（5分） 11 按照实验报告的书写格式、版面是否整洁、工整，分三个等级给分。 优秀 合格 不合格 5 分 4 分 3~0 分 优秀：实验报告字体工整，版面整洁。 合格：实验报告字体较工整，版面较整洁。 不合格：实验报告字体潦草，版面凌乱。 （何肖娟） 12 第三章 实验操作考核的要求 选用肝糖原的提取、鉴定与定量作为操作考核实验 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项， 掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20 分）； 2．可调式微量移液器操作（20 分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15 分）； 4．溶液转移操作（10 分）； 5．分光光度计比色操作（25 分）。 6．整体表现（10 分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作 5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节 吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约 0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进 入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体 吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流 13 净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少 3 秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作 5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动 旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液 器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间 隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下 2~3 毫米处,然后缓慢 平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留 2-3 秒，使管尖外 侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持 100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器 除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液 器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作 5分，共 15分） 1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加 5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒 混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入 100 ml 容量瓶，加水至刻线后 的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约 45º 再作旋转混匀。因 蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管底（加试剂的顺序一 定不能颠倒），不倾斜试管旋转混匀不了。 （四）溶液的转移（操作流程中下划波纹线的两处，每项操作 5分，共 10分） 1．在研钵中研磨后的肝匀浆转入试管离心可用滴管或取液器吸取转移，如果采用倒入， 不能洒落管外，应尽量转移干净。 14 2．肝组织沸水浴后的消化液转入 100 ml 容量瓶前应冷却；转入时用玻璃棒引入，玻璃 棒头插入容量瓶靠瓶颈磨口下约 1cm 处，玻璃棒上端不要靠上瓶口边沿，引入时试管口靠 玻璃棒的位置靠近容量瓶口，不要离开瓶口太高，以免消化液沾染玻璃棒较长；转入过程 中，溶液不要沾染到容量瓶磨砂口上，更不能滴洒到容量瓶外面；应用蒸馏水洗消化管 3 遍以上，洗液一并全部转入容量瓶。 （五）分光光度计的操作（25分） 1．波长选择，仪器调零，灵敏度挡选择等操作正确（5 分）。 2．溶液转移到比色杯操作（10 分） 手接触比色杯毛面；倒液量不超过比色杯体积的 2/3；比色溶液不能洒落在色杯外或试 管外；溅出比色杯外液体的擦拭；空白液、标准液、待测液的放置顺序；不能在仪器上方 倒液。 3．比色操作（5 分）：盖盖；调透光度；空白调零；测定（拉杆、记录）。 4．比色后操作（5 分）：比色杯溶液的倒出；比色杯清洗。 （六）整体表现（10分） 1．小组分工协作有序，不忙乱。 2．实验结束后实验台面的整理：器材按要求清洗干净、器材与试剂瓶归回原位和台面 卫生整洁。 四、实验报告结果要求 1．肝糖原的提取、鉴定 鉴定方法①和鉴定方法②中最后的“呈色对比”和“观察颜色变化”，结果一定要明确表达 是“有变化”或“没有变化”，有变化的话还要具体写出变成什么颜色了。而且要作出明确结论： “有糖原”或“没有糖原”，如果颜色转变成红色不很明显，可以写“有少量糖原”、“有极少量 糖原” 或“有微量糖原”等，但不能写“可能有少量糖原”、“可能有极少量糖原”或“可能有微 量糖原”等带“可能”的结论。在这里结论“没有糖原”不是说绝对没有糖原，而只是说用这种 鉴定方法鉴定不出有糖原的存在。 2．肝糖原的定量测定 测定数据应记入结果栏内，计算过程应先写出计算公式，再代入测定数据进行计算， 结果保留小数点后 3 位。如果是直接列式计算，至少前面要出现过有记载计算糖原的公式， 否则必须适当扣分；如果只列出计算公式和有测定数据的记录，没有将测定数据代入公式 的计算过程而直接写出结果的可结合其它情况酌情扣分。 15 五、实验报告评分 按平时实验报告要求评分（按百分制计）。 六、监考记录表 月 日 （刘安玲） 序号 姓名 吸量管操作 （20 分） 加样枪操作 （20 分） 混匀(下划实线 3 处) （15 分） 溶液转移（下划波纹线 2 处，10 分） 比色操作 （25 分） 整体 （10 分） 1 2 3 4 16 第四章 设计性实验教学的组织实施 设计性实验主要可分为完全自主设计型实验、指定设计型实验（给出实验题目或范围， 如第二节中各类实验设计的实践题目）、改进、补充型设计。本节以自主设计性实验教学的 组织实施为例进行详细介绍。指定设计性实验除选题范围已确定外，其余程序基本相同。 一、目的要求 引导学生自主学习生命科学专业知识，提高学生综合设计实验、分析解决问题和实践 操作能力，培养学生创新意识及团队精神。 1．明确本课程的意义、目的和要求，依靠自主学习，综合运用所学的知识和技能，在 老师指导下独立地、保质保量地完成课程任务。 2． 各小组发挥团队精神，既有分工、又有协作，自我组织协调好课程过程中的各项工 作。 3．课程结束后，每个小组完成一篇学习心得，总结通过本实验学习所取得的收获和体 会，存在的不足之处，以便不断完善该课程。另外，在网上也开设了该课程的论坛，鼓励 大家在上面发表感想体会，也可以在课程进行中互相交流。 二、组织实施 1．自由组合小组成员（3~4 人一小组，原则上专业内组合）。 2．按设计性实验要求进行选题。 3．查阅资料，讨论实验设计，撰写实验设计书，上交。 4．实验设计书评分：由教师根据设计方案的目的性、科学性、创新性和可行性进行初 评。 5．进行课堂报告，对实验设计方案进行论证（以汇报、提问、答辩为主）。 6．确定指导老师，对优秀设计书进行指导。 7．开展实验研究，做好实验记录与小结。 8．实验总结报告、撰写实验报告（或论文）。 注：自主设计性实验考核优秀者可推荐参加学校生物化学实验技能大赛，从中择优选 拔参加广东省大学生科技学术节生物化学实验技能大赛。进一步补充到“实验教学助理”团 队，参与生化实验教学辅助工作及科研实验培训；再选送进入本科生创新教育基地，开展 课外科研课题的研究。 三、设计性实验要求 （一）实验设计书要求 17 要求每组学生认真查阅国内外相关文献 10 篇左右，要求在设计书中列出的参考文献不 能少于 5 篇，选择研究题目、拟定实验方案，各小组按照设计书格式要求（见附录-1）独立 完成实验设计书，于规定时间上交实验设计书（打印稿与电子稿），由评阅老师对实验设计 书进行评定。 （二）实验设计课堂报告要求 各小组选派一人以 PPT 形式在实验室汇报该组的实验方案，其他组员可作补充，全组 成员听取老师、其他小组同学的提问和建议，并答辩。 （三）具体要求 1．设计实验题目的选定和文献查阅 （1）根据布置题目、关键词及所学知识自选一个设计实验题目； （2）通过各种检索工具和方法查找相关文献，特别是英文文献检索，对文献进行总结， 写成小综述。 2．实验方案的拟定 在查阅参考资料和写作小综述的基础上，运用所学过的理论知识和基础实验知识，拟 定实验设计方案。 实验方案包含以下几个部分：①实验原理；②实验材料：包括实验样品、试剂及溶液 的配制方法、仪器设备；③实验方法：详细操作步骤；④实验数据的处理方法和表格设计。 实验方案拟定后，要对整个实验设计进行可行性分析、预期结果分析、经费预算；并 附上主要参考文献。在此基础上独立完成实验设计书。 3．实验过程的实施 实验设计书经教师评阅、课堂汇报答辩后，选出优秀设计书，进一步确定指导教师进 行修改、完善定稿。经过相关下实验室前培训、经指导教师签字后，进入实验室按实验设 计方案进行实验。 要求明确实验的具体步骤和注意事项，独立完成实验，认真详细记录实验过程中出现 的实验现象和实验数据，对实验数据进行计算和分析。 4．实验报告的撰写 对所获实验结果进行数据处理与分析，得出结论。课堂汇报实验结果与结论并答辩。 在此基础上，独立撰写实验报告（或论文）。 （四）选题范围 1．物质提取类 18 如从柑橘皮中提取果胶；从果蔬中提取类胡萝卜素；从芦荟中提取碳水化合物；从鸡 蛋清中提取某蛋白等。 2．物质检验类 如检验市面上某几种品牌牛奶是否掺假；检验市面上某几种食品是否含有防腐剂等。 3．物质含量测定类 如洗衣粉磷含量的分析；比较几种饲料中某物质的含量等。 4．探索物质在某一方面的应用 如探索蛋白酶对草菇保鲜的影响机理；探索木瓜蛋白酶在食物色氨酸测定上的应用等。 5．比较不同品牌物质的价值 如对不同品牌螺旋藻片营养成分测定和营养价值的评价测定；对不同品牌饲料中营养 价值比较等。 6．其他感兴趣的方面 （五）注意事项 1．每组只能上交一份实验设计书。 2．实验方案要求具有一定的科学性、实用性、创造性和安全性，具有较强的实际意义， 以创新及紧密联系生产为佳，同时在实验室内的可操作性强。 3．实验方案中所用试剂中严禁使用剧毒、危险药品，实验用品中严禁使用易爆装置。 （六）评分方法 实验设计主要分三部分计分：①实验设计书评分。②课堂答辩得分：为课堂汇报、PPT 制作及答辩等评分。③个人贡献度评分。 1．实验设计书占 40%，小组每个成员得分相同； 2．课堂答辩占 40%，小组每个成员得分相同，但小组中汇报人与其他成员根据其答辩 中表现酌情加分。 3．个人贡献度（20%） 衡量每位同学在整个课程过程中的参与程度，包括查阅文献、实验设计、撰写论文、 课堂报告等方面。本部分成绩由个人自评，组员互评、老师核准产生，记入每一人的成绩 中。 张 1 王 2 李 3 赵 4 查阅文献（100） 50 20 30 实验设计（100） 20 50 30 19 撰写论文（100） 30 20 50 课堂报告（100） 50 20 30 合 计 80×20% 110×20% 100×20% 110×20% 注： 如果每组成员＞4 人或＜4 人，则每人总分乘以相应校正系数，使每人平均总分 为 100 分，再乘以 20%。 优秀实验设计被选出并完成实验研究后，其评分要增加④实验报告的评分及⑤实验结 果课堂报告的评分，共五部分，适当调整各部分所占比例。 （七）具体评分标准 1．实验设计书评分标准（满分 100 分） （1）内容价值（20%）：是否贴近生活或生产；是否有一定的实用价值；是否解决了某 个问题； （2）创造性（30%）：方法是否有创新； （3）可操作性（40%）：实验方法是否可行、是否科学； （4）设计书的书写（10%）：原理明确与否、过程是否详细、参考文献是否详实。 2．课堂答辩评分标准（满分 100 分） （1）幻灯制作（20%）：背景、对比度，字体颜色、大小及版面，图文并茂 （2）语言表述（40%）：口齿清晰，条理清楚，每小组 10 分钟，超时适当扣分。 （3）提问答辩（30%）：简明扼要，语速适度。 （4）小组合作（10%）：体现团队合作 课堂答辩评分一般主要由教师评分，视情况可增加其他组同学的评分以提高参与度。 综合上述得分，给出每一位学生的自主设计性实验考核得分。 四、实验设计书格式要求 （广东大学生科技学术节生物化学实验技能大赛实验设计书格式要求） （一）排版 1．页面设置：页边距上下左右各用 2.4cm。 2．行距：全部采用 1.5 倍行距。 3．页码：每页下端居中，全部采用阿拉伯数字排序，如 1，2，3 等，不要写“第 1 页” 或“-1-”等。 4．页眉：全部不加页眉。 20 （二）标题 1．实验名称（居中、三号宋体、加粗） 2．小组成员资料（居中、小四宋体）：年级专业 姓名 学号（按学号排序） （三）摘要 1．“摘要”两字用黑体加粗 4 号字居中，字与字之间留 4 个字距。摘要正文用宋体小 4 号字。 2．“关键词”三个字用黑体加粗小 4 号字，与摘要正文左对齐。 3．关键词宋体小 4 号字，各关键词之间空 2 个字距，且不加标点符号。 （四）正文 （1．前言；2．实验目的；3．实验原理；4．实验设备；5．实验材料及试剂：a.试剂 的配制 b.材料的处理；6．实验操作步骤；7．结果及计算；8．注意事项；9．费用预算） 1．正文层次标题题末不加标点符号。各层次一律用阿拉伯字连续编号，如：“1”，“2.1”， “3.1.2”，一律左顶格，后空一字距写标题。一级标题从前言起编，一律用黑体加粗 4 号字， 左顶格；二级标题用黑体加粗小 4 号字，左顶格；三级标题用楷体加粗小 4 号字，左顶格。 2．正文其他部分全部用宋体小 4 号字。 3．图题放图下方居中，用阿拉伯数字编号，如：图 1，图号后不加任何符号，空 1 个 字距写图题；表题放表上方居中，用阿拉伯数字编号，如：表 1，表号后不加任何符号，空 1 个字距写表题。 4．文中的拉丁学名采用右斜体字母。 （五）参考文献 1．“参考文献”四字用黑体加粗 4 号字居中，字与字之间空 1 个字符。 2．中文参考文献采用宋体小 4 号字，英文参考文献采用 Times New Roman 小 4 号字。 （六）附录 如有附录，放在参考文献后。“附录”两字用黑体加粗 4 号字居中，字与字之间留 4 个 字距。 五、实验设计书范例 马铃薯中消炎成分的提取及其消炎作用的比较研究 南方医科大学生物技术学院 2009级生物制药专业 陈蕾 南方医科大学生物技术学院 2009级生物制药专业 李昕 南方医科大学药学院 2009级药学专业 伍慧敏 21 摘 要 目前马铃薯用于消炎止痛时一般采取现切现用、以马铃薯片敷于患处的方法，但是片 状马铃薯久放或贴敷后变色，需频繁更换，使用不便。本实验拟提取马铃薯中的主要消炎 成分、进行定性、定量分析，并将主要消炎成分制成软膏，以小鼠皮肤炎症模型比较马铃 薯软膏、马铃薯片与消炎药物的疗效。 关键词 马铃薯 消炎 生物碱 水溶性维生素 马铃薯提取物软膏 1 前言 马铃薯又名土豆、洋芋、山药蛋、薯仔、茨仔等，富含淀粉、蛋白质、多种维生素 及矿物质等，一直深受百姓喜爱。同时作为中草药的一种，马铃薯也常被中医用作和胃健 中、解毒消肿的天然药物。马铃薯性平味甘，具有抗感染、解毒、消肿镇痛、缓解痉挛、 促进细胞再生和伤口愈合等作用，对人体无刺激，副作用小。 以片状马铃薯贴敷患处的方法来消除红肿及疼痛已经广为人知，并有显著效果。临床 常用马铃薯片来缓解肿瘤病人因化疗而导致的外周静脉输液外渗性损伤，而且效果比 50% 硫酸镁更有效，即使长期使用也不会产生消炎止痛膏的毒副作用及依赖性。但是片状马铃 薯在使用上存在一定弊端，如必须现切现用、贴敷时需经常更换、水份容易蒸发等，给病 人的使用带来了很大的不便。因此需要寻找一种更好的利用马铃薯消炎的替代方法。 本实验拟提取马铃薯中消炎的有效成分，并将主要消炎成分以不同配比制成软膏，以 动物模型比较马铃薯软膏、马铃薯片与消炎药膏的消炎效果。 2 实验目的 提取马铃薯中消炎的主要有效成分并制成软膏，鉴定马铃薯软膏的消炎效果，为临床 探索一种利用马铃薯消炎的最佳方案。 3 实验原理 3.1 马铃薯中消炎成分分析 马铃薯中的龙葵碱（茄碱）具有兴奋平滑肌和加强血液流通作用。维生素 B2参与糖、 蛋白质及脂肪的代谢，可保护皮肤免受炎症的侵害；维生素 B1能激活胆碱乙酰化酶，有维 持神经系统的功能及抗神经炎的作用，从而防止病人皮肤受损，减少医源性损害。 3.2 龙葵碱和水溶性维生素的提取 3.2.1 龙葵碱 22 马铃薯中所含的生物碱主要为龙葵碱，其化学结构见图 1。大多数生物碱几乎不溶 于水或难溶于水，易溶于乙醇、甘油等有机溶剂。 图 1 龙葵碱的化学结构 3.2.2 维生素 B1 维生素 B1 的化学结构见图 2，在酸性溶液中很稳定，在碱性溶液中对热极不稳定， 易被氧化和受热破坏。 3.2.3 维生素B2 维生素B2（结构见图3）能溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，在 酸性条件下也有一定的溶解度，对空气、热稳定，且在酸中非常稳定，即使短时间内高 压加热亦不至于破坏。但在碱性溶液中则较易被破坏。游离核黄素对光敏感，特别是紫外 线，可产生不可逆分解。 图 2 维生素 B1的结构 图 3 维生素 B2的结构 本实验选用制药时常用的提取剂——盐酸一次提取维生素 B1 和 B2。在酸性条件 下维生素 B1和 B2 都有一定的溶解度，且化学性质比较稳定。 3.3 龙葵碱和水溶性维生素的鉴定 3.3.1 龙葵碱的鉴定 龙葵碱的鉴定有沉淀反应和显色反应两种。但由于马铃薯含大量蛋白质及多糖，对沉 淀反应影响较大，所以选用显色反应。在稀硫酸中龙葵碱与甲醛溶液作用生成橙红色化合 23 物。 3.3.2 水溶性维生素的鉴定 利用重氮苯磺酸反应鉴定维生素 B1：在碳酸氢钠存在的碱性条件下，硫胺素可与重氮 苯磺酸作用产生红色。 维生素 B2的乙醇中性溶液和水溶液呈黄色，在中性或酸性溶液中经光照射自身可产生 黄绿色荧光，在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比。核黄素能被亚硫酸盐还原成 无色的二氢化物，失去荧光。但此氢化物在空气中易被重新氧化，恢复荧光。 3.4 龙葵碱和水溶性维生素的定量 根据 Lambert-Beer定律 A=KCL计算龙葵碱、维生素 B1、B2的质量浓度 C (mg/ml) ， 并转化为 50g马铃薯中的含量。其中 A为吸光度；L为比色皿厚度单位是 cm；K为吸光系 数，在入射光的波长、溶液种类和温度一定的条件下 K为定值： 530nm波长处龙葵碱的 吸光系数 K为 177；246nm波长处 Vit B1的吸光系数 K为 421；444nm波长处 Vit B2 的吸光系数 K为 323； L(cm)为比色皿厚度。（上述吸光系数为根据已有文献的实验数据 计算而得到[12]）。 4 实验设备 实验主要仪器包括离心机、电子天平、台式酸度计、紫外-可见分光光度计、紫光灯。 实验器材主要包括索氏提取器、抽滤装置、研钵、一次性皮试点刺针、计时器、直尺 等。 5 实验材料及试剂 5.1 实验材料 马铃薯（新鲜马铃薯及发芽马铃薯）、小鼠、消炎止痛膏（喜疗妥软膏）。 5.2 试剂及其配制 5.2.1 试剂 95%乙醇、5%稀硫酸、甲醛；0.01mol/L的盐酸、碳酸氢钠、氢氧化钠、对氨基苯磺酸、 浓盐酸、亚硝酸钠、2.5%亚硫酸氢钠溶液（用 2%碳酸钠作溶剂）；甘油、明胶；8%硫化钠 酒精溶液、花生四烯酸。 5.2.2 主要试剂的配制 碳酸氢钠碱性溶液：取氢氧化钠 1g溶于 30 ml蒸馏水中，加碳酸氢钠 1.5 g，混匀后， 用水稀释至 50 ml。 重氮试剂的配制：溶液 A：将对氨基苯磺酸 1 g溶解于 15 ml浓盐酸中，然后加水稀释 24 至 100 ml。溶液 B：将亚硝酸钠 0.5 g溶解于水中，稀释到 100 ml。现用现配。需用时，将 3 ml溶液 B加到 100 ml溶液 A中，混匀即得重氮试剂，在冰浴中保存，至少 15 min后方 可使用。此溶液配好后，存放时间不能超过 24 h。 4%花生四烯酸稀释液：取 10%食品级花生四烯酸 10g溶于 25ml无水乙醇中。 明胶溶液：称取 20g明胶，放入盛有 70 ml温热（40℃）的甘油和 10ml蒸馏水的烧杯 中，并使其充分溶解后备用。 6 实验操作步骤 6.1 龙葵碱的提取、鉴定与定量 6.1.1 提取 称取 50g马铃薯，切成小块，用研钵、研杵稍加研磨后装滤纸筒内。加入 3~5ml 95%乙 醇溶液清洗研钵、研杵后洗液转移入索氏提取器（图 4）中。在圆底烧瓶中倒入 80ml 95%乙 醇溶液，在索氏提取器中抽提 1~1.5 h后，得到龙葵碱提取液，测量提取液的体积为 V1 ，单 位 ml。 图 4 龙葵碱的提取 6.1.2 鉴定 将少量提取液进行离心，得到滤液，取滤液 2ml，加入 5滴 5%稀硫酸，震荡，充分混合 后加入甲醛溶液，如溶液显橙红色，则证明提取液中含龙葵碱。 6.1.3 定量 测定 530nm处的吸光度（A530），根据 A=KCL，计算龙葵碱的质量浓度 C(mg/ml)。530nm 波长处龙葵碱的吸光系数 K为为 177；L(cm)为比色皿厚度。 6.2 水溶性维生素的提取、鉴定与定量 6.2.1 提取 25 在锥形瓶中加入 0.01mol/L的盐酸 100ml，称取 50g马铃薯磨成碎末放入锥形瓶中，用 力振荡 5min并搅拌 5min。放置 10 min后，用抽滤装置抽滤，将滤液离心后取上清液，备 用，标记为维生素提取液，测量提取液的体积为 V2，单位 ml。注意避光保存。 6.2.2 鉴定 维生素 B1的鉴定：取提取液 1 ml，加入碳酸氢钠碱性溶液 1.5 ml，再加入重氮苯磺酸， 摇匀后，在 10 min内观察到深红色的出现，则为维生素 B1。 维生素 B2的鉴定：分别取提取液 2ml于 A、B两试管中，在紫光灯下观察其黄绿色荧 光。在 A试管中加入 5～10滴亚硫酸氢钠溶液，比较两管的荧光。若 A试管荧光消失，则 为维生素 B2。 6.2.3 定量 分别测定 246nm、444nm 处吸光度（A246、A444），根据 A=KCL，分别计算维生素 B1、B2的质量浓度 C(mg/ml)。246nm波长处维生素 B1的吸光系数 K为 421；444nm波 长处维生素 B2的吸光系数 K为 323；L(cm)为比色皿厚度。 6.3 马铃薯提取物软膏的制备 按下表分别取生物碱提取液、维生素提取液、明胶溶液若干，混合，在蒸发皿中加热 溶解，再在室温下冷凝为胶状，制备不同配比的马铃薯软膏。 表 1 马铃薯提取物软膏主要成分的配比 成分（ml） 1号软膏 2号软膏 3号软膏 4号软膏 生物碱提 取液 5 10 5 10 95%乙醇 5 - 5 - 维生素提 取液 5 5 10 10 0.01mol/L HCl 5 5 - - 明胶溶液 30 30 30 30 总体积 50 50 50 50 6.4 马铃薯提取物软膏与马铃薯片、消炎药膏的疗效比较 6.4.1 小鼠皮肤炎症模型的制备 选取同种系、同性、年龄、体重等指标相近的小白鼠共 10只，每只小鼠均用 8%硫化 26 钠酒精溶液脱毛，再在后腰两侧位置上用 4%花生四烯酸稀释液对称点刺共 4处，并作好记 号。30min后测定红斑的直径。 6.4.2 消炎处理 将 10只皮肤炎症模型小鼠随机分成两组。第一组五只小鼠分别编号为 A、B、C、D、 E。该组小白鼠点刺部位标记为 1~4号位置，消炎处理方法为：1 号位置为空白对照，2 号 位置敷马铃薯片（约 1cm×1cm，新鲜制备），3号位置敷马铃薯提取物 1号软膏，4号位置 涂抹消炎止痛膏。比较不同处理对伤口消肿的作用。 消炎处理后每隔 10min揭开贴敷处测定红斑的直径。 6.5 不同配比的马铃薯提取物软膏的消炎作用比较 取第二组皮肤炎症模型小鼠共五只，分别编号为甲、乙、丙、丁、戊。该组小白鼠点 刺部位标记为 a~d位，消炎处理方法：a位敷 1号软膏，b位敷 2号软膏，c位敷 3号软膏， d位敷 4号软膏。敷上马铃薯提取物软膏后用保鲜膜包裹贴敷处。 在 6.4.2确定的消炎处理疗效显著的时间点，测定红斑