慢病毒包装手册

吉凯基因化学有限公司 慢病毒包装手册 吉凯基因 2008 年 4 月 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 2 目 录 慢病毒系统简介…………………………………………………………………………………3 实验流程描述……………………………………………………………………………………5 实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 …………………………………………………………………………………………6 病毒包装细胞 293T 的培养…………………………………………………………………7 Lentivirus 病毒包装……………………………………………………………………………8 病毒的收获及浓缩……………………………………………………………………………9 Lentivirus 滴度测定…………………………………………………………………………11 1) 孔稀释法测定滴度…………………………………………………………………………11 2) Real time 定量 PCR 法测定滴度…………………………………………………………14 示例: Real-time 定量 PCR 法测定 GFP-tagged 慢病毒……………………………………17 参考文献………………………………………………………………………………………20 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 3 慢病毒系统简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗 载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达且安全性高。 吉凯基因提供的 Lentivirus 为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞， 也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。Lentivirus 中的毒性基因已经被剔除并被外源性目 的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议 不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致 癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由 pGC-LV 载体、pHelper 1.0 载体和 pHelper 2.0 载体三质粒 组成。pGC-LV 载体中含有 HIV 的基本元件 5’LTR 和 3’LTR 以及其他辅助元件，例如 WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针 对 pGC-LV 载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、RNA 干扰等研究。pHelper 1.0 载体中含有 HIV 病毒的 gag 基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol 基因，编码病毒特异性的 酶；rev 基因，编码调节 gag 和 pol 基因表达的调节因子。pHelper 2.0 载体中含有单纯疱疹 病毒来源的 VSV-G 基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因慢病毒载体图谱： 1) pGC-LV 载体图谱： 以上载体为用于 RNA 干扰的 pGC-LV 载体，带有 GFP 标记。用于其他研究的 pGC-LV 载体的框架与此基本相同。[具体结构请参考克隆构建部分] Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 4 2) pHelper 1.0 载体图谱： 3) pHelper 2.0 载体图谱： 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 5 实验流程描述 制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分 别进行高纯度无内毒素抽提，按 Invitrogen 公司 Lipofectamine 2000 使用说明进行共转染 293T 细胞，转染后 8 h 更换为完全培养基，培养 48h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清 液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在 293T 细胞中测定并标定病毒滴度。在一定 滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。 慢病毒包装流程图： Administrator 线条 Administrator 线条 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 6 实验材料 细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 病毒载体 a) pGC-LV 重组载体；b) pHelper 1.0；c) pHelper 2.0 DNA 溶液的制备：以 Qiagen 公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒 DNA，质粒 DNA 溶于除菌的 TE 中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒 DNA 的 A260/A280 在 1.8～2.0 之间。 试剂 试剂名称 试剂来源 cat.No. 台盼兰 上海捷倍思基因技术有限公司 胎牛血清 FBS 上海微科生化试剂有限公司 A11-102 DMSO 上海生物试剂厂 DMEM GIBCO 12800-017 胰酶 上海化学试剂公司 Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-500 仪器 仪器名称 仪器来源 cat.No. 荧光显微镜 奥林帕斯 micropublisher 3.3RTV CO2 培养箱 日本三洋 SANYO MCO-175 生物安全柜 上海振样创空气净化设备有限公司 Bio 1200-Ⅱ-A2 Plus-20 离心超滤装置 MILLIPORE ufc910024 Administrator 线条 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 7 病毒包装细胞 293T 的培养 活细胞计数 用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200～2000 个/ml (一般稀释倍数为 100 倍)，在 0.1ml 的细胞悬液中加入 0.1 ml 的 0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数 细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 细胞株的冻存 1． 取培养 2～3 天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成 2×106～2×107/ml。 2． 在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亚砜(或甘油)， 混匀后密封。置 4℃ 1 小时，-20℃ 2 小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后 浸入液氮中。 细胞复苏 1． 从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。 2． 迅速放入盛有 37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。 3． 用 70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加 3 ml 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，置温箱培养。 4． 次日更换一次培养液后再继续培养。 细胞传代 1． 弃去旧培养液，加入 5 ml 灭菌 PBS 溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去 PBS 溶液。 2． 加入 2 ml 胰酶消化液，消化 1- 2 min 直到细胞完全消化下来。 3． 加入含 10%胎牛血清和 100 U/ml 双抗的 DMEM 培养基 5 ml，用刻度吸管吹打数次，将 瓶壁上的细胞冲洗下来。 4． 混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。 Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 8 Lentivirus 病毒包装 细胞转染 1) 转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的 293T 细胞，以含 10%血清的培养基调整细胞 密度为 1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于 15 cm 细胞培养皿，37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内 培养。24 h 待细胞密度达 70%～80%时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要， 因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。 2) 转染前 2 h 将细胞培养基更换为无血清培养基。 3) 向一灭菌离心管中加入所制备的各 DNA 溶液(pGC-LV 载体 20 μg ，pHelper 1.0 载体 15 μg，pHelper 2.0 载体 10 μg)，与相应体积的 Opti-MEM 混合均匀，调整总体积为 2.5 ml， 在室温下温育 5 分钟。 4) 将 Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇匀，取 100 μl Lipofectamine 2000 试剂在另一管中与 2.4 ml Opti-MEM 混合，在室温下温育 5 分钟。 5) 把稀释后的 DNA 与稀释后的 Lipofectamine 2000 进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。 必须在 5 分钟之内混合。 6) 混合后，在室温下温育 20 分钟，以便形成 DNA 与 Lipofectamine 2000 稀释液的转染复合 物。 7) 将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37 ℃, 5% CO2 细胞培养箱中培养。 8) 培养 8 h 后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入 20 ml 的 PBS 液，10)轻轻左右 晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。 9) 每瓶细胞中加入含 10% 血清的细胞培养基 25 ml，于 37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内继续培 养 48 小时。 Administrator 线条 Administrator 线条 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 9 病毒的收获及浓缩 1． 收集转染后 48 小时（转染即可为 0 小时计起）的 293T 细胞上清液。 2． 于 4 ℃，4000 g 离心 10 min，除去细胞碎片。 3． 以 0.45 μm 滤器过滤上清液于 40 ml 超速离心管中。 4． 把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多 19 ml），盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收 集管中。 5． 组合好后，做好平衡，放在转头上。 6． 在 4000 × g 离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为 10-15 分钟。 7． 离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。 8． 将过滤杯倒扣在样品收集杯上。 9． 离心力不超过 1000g,时间为 2 分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集 杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 10 10． 将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80 度长期保存。取其中一支进行病毒 生物学滴度测定。 [详情登陆 www.millipore.com/网站，查看 Centricon Plus-20，P31925 信息] 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 11 Lentivirus 滴度测定 1) 孔稀释法测定滴度 1． 测定前一天，为测定滴度所需的细胞（吉凯基因公司用的 293T 细胞：贴壁生长）铺板， 96 孔板，每个孔加 4×104 个细胞，体积为 100 μl。 2． 根据病毒的预期滴度，准备 7~10 个无菌的 Ep 管。在每个管中加入 90 μl 的无血清培养 基。 3． 取待测定的病毒原液 10 μl 加入到第一个管中，混匀后，取 10 μl 加入到第二个管中。继 续相同的操作直到最后一管。 4． 选取所需的细胞孔，吸去 90 μl 培养基，丢弃。加入 90 μl 稀释好的病毒溶液。放入培养 箱培养。 5． 24 小时后，加入完全培养基 100 μl。小心操作，不要吹起细胞。 6． 4 天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。 说明： 第一个 Ep 管中加入 10ul 病毒原液，记为 1E+1 μl； 第二个 Ep 管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个 Ep 中的 1/10，记为 1E+0 μl； 第三个 Ep 管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个 Ep 中的 1/10，记为 1E-1 μl； 依次类推… 第七个 Ep 管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个 Ep 中的 1/10，记为 1E-5 μl； 第八个 Ep 管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个 Ep 中的 1/10，记为 1E-6 μl； 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 12 滴度荧光照片：[仅供参考] 样品组 明视野 100x 荧光视野 100x 1E+0 μl 1E-1 μl 1E-2 μl 1E-3 μl 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 13 样品组 明视野 100x 荧光视野 100x 1E-4 μl 1E-5 μl 1E-6 μl 滴度计算: 根据以上荧光图片中 GFP 表达情况，在加入 1E-6 μl 病毒原液的孔中观察到 2 个带有 荧光的细胞，说明该孔中至少有 2 个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的 细胞数除以病毒原液量，本例子中就是 2/（1E-6）=2E+6，单位为 TU/μl，也就等于 2E+9 TU/ml。 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 14 2) Real time 定量 PCR 法测定滴度 样品制备 1. 检测前一天，对 293T 细胞传代，每个 24 孔中加１×105 个细胞，体积为 500 l； 2. 次日，准备 7~10 个无菌的 Ep 管，在每个管中加入 90 μl 的培养基（DMEM+10% FBS）； 3. 取待测定的病毒原液 10μl 加入到第一个管中，混匀后，取 10 μl 加入到第二个管中。继 续相同的操作直到最后一管； 4. 选取所需的细胞孔，吸去 90 μl 培养基。加入稀释好的病毒溶液。放入 37℃ 5%CO2 培 养箱中培养； 5. 48 小时后，加入新鲜培养基 500 μl。小心操作，不要吹起细胞； 6. 4 天后，抽提 RNA 准备做 RT-qPCR。 说明： 第一个 Ep 管中加入 10ul 病毒原液，记为 1E+1 μl； 第二个 Ep 管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个 Ep 中的 1/10，记为 1E+0 μl； 第三个 Ep 管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个 Ep 中的 1/10，记为 1E-1 μl； 依次类推… 第七个 Ep 管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个 Ep 中的 1/10，记为 1E-5 μl； 第八个 Ep 管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个 Ep 中的 1/10，记为 1E-6 μl； 总 RNA 抽提 说明：根据 Invitrogen 公司的 TRIZOL 操作说明书进行，均为 RNase-free 操作。 1. 去细胞上清，每孔加入１ｍl TRIZOL 吹打，室温静置 5 min，后转移至另一新的 1.5 ml eppendorf 管中。 2. 每管加入 200 µl 氯仿，用力震荡 15s，室温静置 15 min。 3. 4℃，12000 rpm，离心 15min。 4. 从每管中吸取上清至另一新的 1.5 ml eppendorf 管。加入等体积-20℃预冷的异丙醇，混 匀后-20℃沉淀 10 min。 5. 4℃，12000 rpm 离心 10 min 后，去上清。 6. 加入至少 1 ml 4℃预冷的 75%乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 15 7. 4℃，10000 rpm 离心 5 min，弃上清。 8. 4℃，10000 rpm 再次离心 5 min，吸去残液，室温干燥（不需完全干燥）。 9. 加入 20 µl RNase-free 水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提 RNA 的浓度。 RNA 逆转录获 cDNA M-MLV 逆转录酶和 dNTP 购自 PROMEGA 公司。Oligo dT 购自上海生工。RNase -free 的物品都购自 Axygen。 说明：根据 Promega 公司的 M-MLV 操作说明书进行, 均为 RNase－free 操作。 Protocol: 1. 将 1 µl Oligo dT(0.5µg/µl) 和 2.0µg Total RNA 加入到 PCR 小管中，补充 DEPC-H2O 至 9ul。混匀后离心，70℃温浴 10min。 之后立即插入到 0℃冰水浴中，使 Oligo dT 和模 板退火。 2. 按下表的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将 M-MLV 酶等在冰上混匀，得到 RT 反应液。 3. 在每个反应管中加入的 11ul 的 RT 反应液,混匀后离心。 试剂 每管加入量 5×RT buffer 4 µl 10mM dNTPs 2 µl RNasin 0.5 µl M-MLV-RTase 1 µl DEPC H2O 3.5 µl 4. RT 反应在 42℃进行 1hour 后完成，之后用 70℃处理 10min 使 RT 酶失活。 5. 得到的 RT 反应产物-cDNA 可立即用于 PCR，也可保存在-80℃以后使用。 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 16 Real-time PCR 检测 Real-time PCR 在 Bio-rad 的 iQ5 上完成。SYBR Master Mixture 来自 TAKARA. 1. 按下列比例配置反应体系 ： 试剂 每管加入量 SYBR premix ex taq: 10 µl 上游引物（5µM）： 1.0µl 下游引物（5µM）： 1.0µl cDNA 1.0µl 水 7.5 µl 2. 设定程序为两步法 Real-Time 定量。预变性 95℃，15S，之后每一步变性 95℃，5S,退火 延伸 60℃，30S,共进行 40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。 Cycle 1: (1X) Step 1: 95.0 ℃ for 00:15. Cycle 2: (40X) Step 1: 95.0 ℃ for 00:05. Step 2: 60.0 ℃ for 00:30. Data collection and real-time analysis enabled. 3. 制作熔解曲线。PCR 结束后，在 95℃变性 1min。然后冷却至 55℃，使 DNA 双链充分 结合。从 55℃开始到 95℃，每一步增加 0.5℃，保持 30S, 同时读取吸光值。 Cycle 3: (1X) Step 1: 95.0 ℃ for 01:00. Cycle 4: (1X) Step 1: 55.0 ℃ for 01:00. Cycle 5: (81X) Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30. Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃ 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 17 示例: Real-time 定量 PCR 法测定 GFP-tagged 慢病毒滴度 引物信息： GFP 引物: 被扩增的片段位置： 211bp-496bp Tm GC% 上游引物序列： TGCTTCAGCCGCTACCC 57.4 64.7 下游引物序列： AGTTCACCTTGATGCCGTTC 57.3 50.0 ACTIN 引物:（NM_001101） 被扩增的片段位置： 932bp-1233bp Tm GC% 上游引物序列： GTGGACATCCGCAAAGAC 52.6 55.6 下游引物序列： AAAGGGTGTAACGCAACTA 51.0 42.1 Real-time 定量 PCR 结果： 下图为实时定量 PCR 曲线图： 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 18 具体数值： 样品 Actin Ct 值 GFP Ct 值 GFP Ct 均值 1.00E+0 ul 16.72 18.51 18.53 18.55 1.00E-1 ul 16.49 21.69 21.65 21.61 1.00E-2 ul 16.52 24.80 24.75 24.71 1.00E-3 ul 16.34 28.52 28.53 28.54 1.00E-4 ul 16.48 30.61 30.65 30.69 control 16.26 32.50 32.485 32.47 注：曲线颜色和样品颜色相同。 加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总 RNA 后反转录为 cDNA，然后进行定量 PCR 检测，通过比较 control 组和试验组的 Ct 值差异判断滴度值。通常情况下，认为 Ct 值差异 2 以上存在显著差异。 反转录反应所获得的 20 ul cDNA 中只取了 1 ul 用于实时定量检测，所以该结果仅表示 1/20 样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数 20。 在本次滴度检测中，1.00E-03ul 组样品和 control 组样品的 Ct 值差异大于 3 以上，所以 认为在 1.00E-03 ul 组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少有 1 个病毒颗粒，则病 毒的滴度为： 1/(1.00E-03) ×20＝2.00E+4 TU/ul=2.00E+7 TU/ml 滴度值：>2.00E+7 TU/ml 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 19 熔解曲线 Actin 的熔解曲线 GFP 的熔解曲线 吉凯基因化学有限公司 地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720弄 1号楼 517 室 电话： 86-21-51320189 邮编：201203 传真： 86-21-51320179 网址：http://www.genechem.com.cn Email： service@genechemat.com 20 熔解曲线说明： 由于 SYBR GreenⅠ与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以 及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以 帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析 SYBR Green Real-Time PCR 定量结果。 在 PCR 结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘 制熔解曲线时，Real-Time PCR 仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过 和中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和 GC 含量不同而在不一样的温度下解 链，当产物解链时，SYBR GreenⅠ的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度 随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线 是扩增反应的质控途径，图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现 污染、引物二聚体和非特异性扩增。 参考文献 1. Maurizio Federico, Lentivirus Gene Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 1 edition, April 30, 2003 2. Tiscornia G, Singer O, Verma IM. Production and purification of lentiviral vectors.Nat Protoc. 2006;1(1):241-5. 3. Sena-Esteves M, Tebbets JC, Steffens S, Crombleholme T,Flake AW. Optimized large-scale production of high titer lentivirus vector pseudotypes. J Virol Methods 2004; 122:131–139. 4. Reiser J.Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.Gene Ther. 2000 Jun;7(11):910-3. Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条 Administrator 线条