红霉素产生菌的筛选与鉴定生物技术(1)

本 科 毕 业 论 文 红霉素产生菌的筛选与鉴定 Study on Erythromycin bacteria screening and evaluation 毕业设计（ 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 ）原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究成果，也不包含我为获得安阳工学院及其它教育机构的学位或学历而使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名：　　 　 　　 日　 期：　　　 　 指导教师签名：　　 　 　　 日　　期：　　　 　 　 使用授权说明 本人完全了解安阳工学院关于收集、保存、使用毕业设计（论文）的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本；学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名：　　 　 　　 日　 期：　　　 　 目 录 摘要 I Abstract II 引言 1 第一章 绪论 2 1.1 总体研究现状 2 1.2 生产工艺优化研究现状 2 1.3 红霉素简介 3 1.4 红霉素的特点 4 1.5 红霉素的性状 4 1.6 红霉素的药理作用 4 第二章 材料与方法 5 2.1 材料与仪器 5 2.1.1 试验材料 5 2.1.2 试验试剂 5 2.1.3 试验仪器 5 2.2 试验方法 6 2.2.1 发酵液的预处理和过滤 6 2.2.2 红霉素的提取 6 2.2.3 发酵方法 6 第三章 试验结果 8 3.1 选因素、定水平 8 3.2 实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及其实验结果 9 3.3 菌种的初筛与驯化 12 3.4 红霉素产生菌的筛选和鉴定 12 3.5 菌株的生物学特性及鉴定 13 3.5.1 菌株的形态特征 13 3.5.2 菌株的生理生化特征 13 3.6 菌种鉴定 16 第四章 讨论 18 结论 19 参考文献 20 致谢 22 红霉素菌种的筛选及鉴定 摘要：红霉素（erythromycin，Er）别名爱红康，是大家都非常熟悉的一种大环内酯类碱性抗生素，具有广谱抗菌活性，红霉素的抗菌谱和青霉素G相似，对革兰氏阳性菌具有抗菌活性。红霉素是临床上常用的抗生素之一，其游离碱供口服用，乳酸糖盐供注射用。有耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引致的疾病的首选红霉素药物，它也可用于青霉素过敏患者。由于红霉素的这种很普遍的用途，所以提高发酵液中红霉素产量显的至关重要。要想获得高质量高产量的红霉素就必须对菌种进行筛选和鉴定。所以本课题运用发酵方法研究红霉素菌种的筛选及鉴定，从筛选的方法和过程上进行详细的论述和解释，最后通过鉴定选择出了克雷伯氏菌属、氨基酸球菌属和变形菌属这几种优秀菌种。 关键词：红霉素；抗生素；发酵；糖多孢菌；链霉菌 Erythromycin strain screening and identification Abstract：Erythromycin is all very familiar with an antibiotic, is found that the erythromycin Streptomyces fermentation product broad-spectrum antibacterial activity of large ring lactone class antibiotic, antibacterial spectrum and its similar to penicillin G, have antibacterial activity for gram-positive bacteria Erythromycin is one of the commonly used antibiotics, clinical treatment is resistant staphylococcus aureus infection and drug of choice for hemolytic streptococcus infection caused disease, and can be used for penicillin allergy sufferers So it is very important to increase production of erythromycin in the fermented liquid change So this topic with erythromycin fermentation method research the screening and identification of species, from the screening method and the process to explain in detail, finally selected through the identification of klebsiella genera coccus of amino acids and deformation of the several kinds of excellent strains Key Words: Erythromycin Antibiotics Ferment Saccharopolyspora streptomycete 引言 红霉素（erythromycin，Er）的发现和应用已有很长时间的历史。虽然现今抗菌药物越来越多, 但红霉素在医学领域仍然有很重要的地位。 对青霉素过敏、具有耐药菌感染的患者可以使用红霉素, 它也对支原体、军团菌和厌氧球菌感染等有效，所以它的适应症还在扩大。 红霉素是从红色链霉菌培养液中分离出来的一种大环内酯类碱性抗生素，具有广谱抗菌活性。正是由于红霉素的这种广泛而必不可少的用途，我国一直在不断地开发该领域的应用价值。经过多年的不断努力，我国成为全球第一大红霉素原料药生产国，而红霉素的应用也逐渐国际化，我国的这种原料优势使我国自然成为欧美和东南亚地区红霉素原料药的主要供应国。这也给中国的经济发展做出了不小的贡献。 本实验研究红霉素产生菌的筛选及鉴定，提高红霉素的质量和产量，使它能更好的用于抗生素类药物研究。同时也可以增强社会认知度，扩大市场需求，使红霉素的影响更广泛，为人们更好的认识了解红霉素打下基础。 第一章 绪论 红霉素（erythromycin，Er）是红色糖多孢菌（Saccharopolysporaerythraea）的次级代谢产物，是一种十四元大环内酯类碱性抗生素。它的抗菌谱和青霉素G相似，特别对抗酸杆菌、革兰氏阳性细菌、病毒及立克次氏体有抗菌活性，如果某些疾病是由耐药性金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌感染引起的，那么红霉素应该是首先要考虑使用的，它是这方面疾病的首选药物。在医学发展的过程中，红霉素衍生物的兴起使母体红霉素的需求大大增加。红霉素的产生主要通过发酵，而我国红霉素发酵水平都比较低而且是重复操作，与发达国家相比差距还比较大。当国外发酵单位已达8000U/mL~ 12000U/mL的时候，我国还处于研究开发阶段。由于这些原因造成我国生产红霉素的利润很低。为此我国学者为提高红霉素发酵水平在红霉素发酵、提取工艺优化、菌种筛选鉴定方面作了较多研究工作。 1.1 总体研究现状 在人类与致病微生物的斗争历史上，以抗生素为代表的微生物药物起到了至关重要的作用。阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等都是红霉素的半合成品，它们的出现以及红霉素应用领域的扩大都快速拉动了红霉素原料药的生产需求。因为红霉素是一种广谱抗生素药物，在临床上应用广泛，所以以提高其产生菌种发酵单位为目的的遗传育种工作一直未曾停止。由于我们对微生物次级代谢产物的生物合成机制了解的不是太全面，常规的诱变选育的方法存在很多缺点如：周期长、效率低和随机性大。所以近年来我们在红霉素高产菌株的筛选方面收效不大。随着分子生物学技术的发展，国际上对红霉素产生菌种的基因工程改造进行了诸多尝试，然而研究者并不是对红霉素生物合成的次生代谢途径做特异性的遗传修饰，而是着力于与产生红霉素相关的底物供应或者是限制红霉素产生的因素上。因此，当红霉素生产中面临的有效组分偏低等这些问题时，我们缺乏有效的针对性的解决办法。 1.2 生产工艺优化研究现状 发酵是红霉素生产过程的一个关键环节，具有操作经验的操作者通过生产过程中的信息和自己的经验知识，需要随时补加营养物料，调整基质，使微生物沿着理想的生长代谢方式进行。在发酵过程中，尽管对环境的参数，如发酵温度、pH值、溶解氧浓度（DO）、接种量等都可以控制得很好，但是由于微生物生长过程是微观的、不能随时掌握，发酵过程中的关键变量如总糖浓度、菌丝浓度不可在线测量，使得发酵过程的控制问题变得很复杂[3]。现在人们都懂得一个道理：是药三分毒，任何药物或许都存在一定的副作用。欧洲药典规定在红霉素产品中ErB的含量不能超过5%。因此，提高红霉素发酵液中ErA的含量和纯度，降低副产物ErB、ErC含量，是当前红霉素生产的一个重要问题[6]。发酵过程中可能会产生某些杂质，通过简单的预处理可能很难完全去除，会导致红霉A、B、C的分离效果不好，而常用的预处理方法在萃取红霉素时又会造成很大损失。所以这方面的研究还处于试验阶段。 1.3 红霉素简介 红霉素是1952 年从红色链霉菌培养液中分离出来的一种14 元环大环内醋类碱性抗生素。它是白色或类白色的结晶性粉末，微有吸湿性，味苦，易溶于醇类、丙酮、氯仿、酯类（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙醚。在水中的溶解度为2mg/ml（25℃左右），它随着温度的升高而减少。在室温和pH 6～8的条件下，其溶液相当稳定，温度升高稳定性下降。红霉素熔点为135～140℃（游离碱水合物），190～193℃（无水游离碱）。且具有旋光性和紫外吸收峰。红霉素碱能和有机酸或无机酸类结合成盐，其盐类易溶于水[7]。我国于1957年试制成功并投入生产。 红霉素是国内外应用最广的大环内酯类抗生素之一。红霉素是广谱抗生素,其抗菌谱和青霉素G相似, 特别对革兰氏阳性细菌、抗酸杆菌、立克次氏体及病毒有抗菌活性, 不但由耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引致的疾病可以用红霉素治疗, 对青霉素过敏的患者也可以使用红霉素。红霉素在临床上的应用也很广泛，主要用于呼吸道感染、皮肤与软组织感染、泌尿生殖系统感染及胃肠道感染等。 另外，红霉素是大环内酯类抗生素。这类抗生素结构具有聚烯酮衍生的，被一内酯键闭合的大环内酯骨架，并通过羟基以糖苷键联结1～3个罕有的中性或碱性糖。化学结构如下： 1.4红霉素的特点 红霉素是大环内酯类抗生素的代表药，其抗菌作用在同类中较强；在碱性环境中作用较强，pH值小于4时几乎没有抗菌作用；主要使用各种革兰阳性菌感染，特别是耐青霉素的葡萄球菌感染和青霉素过敏的病人，还可用于白喉带菌者、百日咳、军团菌、厌氧菌感染等敏感性前列腺炎；口服大剂量可出现肠道反应；红霉素酯化物可引起肝脏损伤，停药后数日可恢复；静脉用药时宜用葡萄糖液而不用含盐液体。 1.5红霉素的性状 红霉素为白色或类白色的结晶或粉末；无臭，味苦；微有引湿性。在甲醇、乙醇或丙酮中易溶，在水中极微溶解。 1.6红霉素的药理作用 类似苄青霉素，对革兰阳性菌有强大抗菌作用，包括金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌及梭状芽孢杆菌；对革兰阴性菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、百日咳鲍特菌、布鲁菌有较强作用；对嗜肺军团菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体也有作用。常用于对青霉素耐药的革兰阳性细菌感染及对青霉素过敏的患者。首选于军团菌肺炎、支原体肺炎、白喉带菌者、沙眼衣原体所致的婴儿肺炎及结肠炎；也可用于扁桃体炎、中耳炎、鼻窦炎、大叶性肺炎等。 第二章 材料与方法 2.1材料与仪器 2.1.1 试验材料 本次试验材料取自学校实验室的红霉素链霉菌 2.1.2 试验试剂 甲基红指示剂，酚酞指示剂，次甲基蓝，12%中性甲醛，硼酸溶液，浓硫酸； 葡萄糖：北京益利精细化学品有限公司， 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯； 乙酸：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； 无水乙醚：北京奥博星生物技术责任有限公司，分析纯； 次甲基蓝：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； 亚铁氰化钾：北京奥博星生物技术责任有限公司，分析纯； KH2PO4：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； K2HPO4：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； ZnSO4：国药集团化学试剂有限公司，分析纯； NaCl：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； NaOH：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； CuSO4：国药集团化学试剂有限公司，分析纯； Cu2O：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； KMnO4：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； KI：北京奥博星生物技术责任有限公司，分析纯 。 2.1.3试验仪器 试管，移液管，培养皿，玻璃棒，烧杯，锥形瓶，量筒，碱式滴定管，酸式滴定管，胶头滴管，蒸发皿，石棉网，小漏斗，试管架，试管夹 ，漏斗，漏斗架 ； 电子天平(FA2104；上海恒平科学仪器有限公司)； 分光光度计(VIS-7220N；北京瑞利分析仪器公司)； 电热恒温水浴锅(GSY-10；北京市医疗设备厂)； 台式高速离心机(TGL-20；武汉中科仪器发展有限公司)； 旋转蒸发器(RE52-99；上海亚荣生化仪器厂)； 索氏提取器(SXT-02；上海洪纪仪器设备有限公司)； 凯式定氮装置(SBD-100；北京市通润源机电技术有限公司)； 调温电炉(SXL-1200；上海大恒光学精密机械有限公司)； 酸度计(MP-9000；上海大恒光学精密机械有限公司)； 水浴锅(DZKW)，100 mL三角瓶，10 mL刻度吸管，25 mL刻度吸管，酸式滴定管，100 mL容量瓶，250 mL锥形瓶，大试管：9支，容量瓶：50 mL×2 ，刻度吸管：1 mL×3 ， 2 mL×1 ，5 mL×1 。 2.2 试验方法 红霉素发酵属于好氧发酵过程，在发酵过程中，需不断通入无菌空气并搅拌，以维持一定的罐压和溶氧。发酵过程中应严格控制发酵温度、发酵液还原糖量、pH值、溶氧量及发酵液粘度等，以便红色糖多孢菌能够大量合成红霉素并排至胞外。生产中还要加入消泡剂以控制泡沫。在发酵期间每隔一定时间也要取样进行分析、镜检及无菌试验， 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 生产状况，分析或控制相关参数。 2.2.1发酵液的预处理和过滤 发酵液中除含有约0.8%的红霉素外，绝大部分是菌丝体、蛋白质、色素、油等杂质，会给提取和精制带来很大的困难。尤以蛋白质和油等的存在，在溶媒萃取时将产生严重的乳化现象。一般采用硫酸锌沉淀蛋白质，目的是使菌丝结成团加快过滤速度。因为硫酸锌呈酸性，为了防止红霉素局部酸解而被破坏，我们一般要用NaoH来调节pH值。在处理滤渣时也会遇到一些问题，因为锌离子是有毒性的，所以我们改用碱式氯化铝处理滤渣。经过预处理的发酵液便可进行过滤去除菌丝体及沉淀的蛋白质。红霉素发酵液过滤采用板框过滤机。 2.2.2红霉素的提取 红霉素分子结构中有一个二甲基氨基官能团，是一个弱碱，在酸性条件下与某些酸会形成盐，如红霉素乳酸盐。如果是纯红霉素碱那么在水中溶解度较小，并且会随温度升高而减小，在55℃时溶解度最小，当pH＞10.0时红霉素基本以游离碱的形式存在，能溶于乙酸丁酯中，当pH＜6.0时，红霉素以盐的形式存在，其在水中的溶解度随pH降低而迅速增大。提取方法是在乙酸丁酯及水溶液（乙酸缓冲液）中反复萃取。 2.2.3发酵方法 A．摇瓶培养 用种子培养冷冻管取红霉素菌种接种于30度母斜面上，养7d 接种于30度子斜面继续培养，7d后接种于一级种子瓶。30000r/min培养48-56h转入二级种子瓶30000r/min 继续培养26-30h，发酵培养将上培养好的二级种子接种于发酵瓶，30000r/min 培养16h。摇瓶装液量为50ml/250ml，每组结果均为5只摇瓶的平均效价。 B．发酵罐培养 种子培养的步骤与摇瓶培养相同，发酵培养就是将上面培养好的二级种子接种于3L发酵罐自动发酵，同时控制发酵罐的发酵温度、PH、 接种量、搅拌速度和溶解氧等条件，培养16h。 第三章 试验结果 3.1选因素、定水平 （1）仅超声波诱变法定水平　 分别取10ml出发菌株的菌悬液于30支25ml的试管中，放入超声波清洗器中，水淹没至试管2/3左右，进行超声波处理。超声波功率分别为200W、300W、400W，诱变时间分别为0min、3min、6min、9min、12min、15min、18min、2min、24min、27min、30min。 根据实验结果可以发现：随着超声波诱变时间的增长，红色糖多胞菌的致死率都在不断的增加；在3个不同功率的超声波诱变中，超声波功率为200w时，随着诱变时间的增长，致死率上升得不明显，诱变效果不显著；超声波功率为400ｗ时，红色糖多胞菌很快就全部致死，反而没有达到诱变效果；超声波功率为300ｗ时，诱变时间20min，致死率接近83%，且平板上的红色糖多胞菌菌落大小不均一，诱变效果较好。 （2）仅LiCl诱变法定水平 Licl诱变法定水平的实验采用两种方法：一是在培养基中加入不同浓度的氯化锂；二是用不同浓度的氯化锂处理孢子后在培养。根据菌株致死率来判断诱变效果。 根据实验结果：第一种方法能取得比较好的致死效果，可能是因为在培养的过程中，培养基中始终有氯化锂存在，对红色糖多胞菌起着长期诱变的作用，因此诱变效果更好。随着氯化锂浓度的提高，致死率也随着提高，当氯化锂浓度超过0.5%时，红色糖多胞菌的致死率增加幅度不在显著，因此在诱变中氯化锂浓度确定为0.5%。在正交实验中，氯化锂浓度分别选0.3%、0.4%、0.5%三个水平，并分别采用两种方法进行实验。 根据实验具体情况选定的因素及其水平： 因素A：超声波功率（W） 水平：200W 300W 400W 因素B:诱变时间（min） 水平：10min 20min 30min 因素C:LiCl浓度（%） 水平：0.3 0.4 0.5 因素D：LiCl使用方法 水平：1、培养基中加入LiCl 孢子悬浮液里4h 同时处理 可以确定此实验为四因素、三水平实验，可以选择正交表L9(34) 项目 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 表头设计 水平 A、 超声波功率 （W） B、诱变时间 （min） C、Licl浓度 （%） D、Licl使用方法 1 200 10 0.3 培养基中加Licl 2 300 20 0.4 孢子悬浮液处理 3 400 30 0.5 同时处理 顶行：实验考虑的因素 最左列：实验进行的次数，每一列代表试验中安排的各个因素的水平 3.2实验方案及其实验结果 水平 A、超声波功率 （W） B、诱变时间 （min） C、Licl浓度 （%） D、Licl使用方法 1 200 10 0.3 培养基中加Licl 2 300 20 0.4 孢子悬浮液处理 3 400 30 0.5 同时处理 试验号 A B C D 生物效价（ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 试验号 A B C D 生物效价（ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 （1）实验结果中重要数据的计算方法： K1即第j列上水平号为1的各实验结果之和的平均值 K2即第j列上水平号为2的各实验结果之和的平均值 K3即第j列上水平号为3的各实验结果之和的平均值 R 即第j列的极差或其所在因素的极差 （2）计算公式：Rj=MAX{Kj}-MIN{kj} R值（极差）的作用，一般来说，各列的R值（极差）是不相等的，这说明各因素改变时对实验结果的影响是不相同的。极差越大，说明这个因素的水平的改变对实验结果的影响越大。极差最大的那一列的因素，就是因素的水平改变对实验结果影响最大的因素，也就是最主要的因素。本题中：D>B>A>C,即因素的影响程度为：氯化锂使用方法＞超声波诱变时间　＞超声波功率＞氯化锂浓度。 (3)分析结果确定最优实验方案 挑选因素的最优水平与所要求的指标有关，若指标越大越好，则应该选取使指标大的水平，即各列K1j、K2j、K3j中最大的那个水平：反之，若指标越小越好，则应该选取使指标小的那个水平。本题中的实验目标是提高红霉素的产量，指标越大越好，所以应该选取每个因素的K1j、K2j、K3j中最大的那个水平。结合表中可以得到实验号为1、2、5、6的诱变菌株的相对效价较高，其中5号菌株的效果最好，其最佳诱变方法为将5号菌株进行检测，其发酵水平比出发菌株提高了很多。5号菌株即为正交实验所得到的最优结果 （4） 小结： 正交实验的缺点： 1、实验次数太多，费时、费事； 2、不做重复实验就无法估计误差； 3、无法区分因素的主次； 正交实验的优点： 1、 试验点代表性强，试验次数少； 2、不需要重复实验，就可以估计实验误差； 3、可以分清因素的主次； 4、可以使用数理统计的方法处理实验结果，提出好的条件； 试验号 A B C D 生物效价（ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 因素主次： D>B>A>C 最优方案: A2B2C3D1 3.3菌种的初筛与驯化 如果通过自然筛选获得高效菌种需要较长的时间，所以通过人工富集培养分离，筛选出降解能力强的高效菌株，是筛选鉴定过程中获取适宜菌种的有效途径。我们在实验室采用富集培养的方法，从自然界筛选驯化降解红霉素的高效菌株，并对菌株进行初步的鉴定，研究外界的营养与环境对条件对菌株生长的影响，以便在实际应用中通过控制适当的条件达到最佳的生长效果。 3.4红霉素产生菌的筛选和鉴定 将含有所要筛选的微生物的污泥按摇瓶培养的步骤操作,分别往50ml普通培养基和发酵培养基中加入5ml活性污泥33℃厌氧条件下进行富集培养。取5mL最终富集液分别接种于红霉素浓度为l00mg/L的驯化培养基中,在33℃厌氧条件下培养48h。取培养后的该培养液5mL再接种驯化培养基中,红霉素浓度为200mg/L,在上述条件继续下培养。重复上述过程,驯化培养基中抗生素含量逐渐加大,而碳氮源的含量逐渐降低,直至红霉素浓度达到2000mg/L。 菌种的复筛与分离纯化达到目标浓度后,取一环菌悬液按稀释、平板分离法进行操作,待菌株生长后,选取长势最好,且形态稳定相似的菌落按三平板划线分离法进一步分离纯化,最后在驯化培养基一中获得3株菌株,对它们进行编号分别为:A、B和C,接种至斜面并保存于冰箱中,以备进一步的驯化以及后续试验使用。 3.5菌株的生物学特性及鉴定 3.5.1菌株的形态特征 经过驯化筛选后得到的几株菌株的形态特征如下 A:在牛肉膏蛋白胨固体培养基上菌落呈略黄色,半透明,表面隆起,光滑但不湿润,中间颜色较周边深,菌落呈不规则状且较小,边缘呈波状。在固体培养基平板的表面、中部和底部都有生长,这表明A为兼性厌氧菌。用光学显微镜观察该菌的菌体形状呈短杆状,革兰氏染色后菌体呈紫红色,判断为革兰氏阴性菌;无荚膜,无芽孢。 B:在牛肉膏蛋白胨固体培养基上菌落呈淡黄色,不透明,表面呈凸透镜状,光滑湿润,菌落呈不规则状且较小,边缘规则且光滑。在固体培养基平板的表面、中部和底部都有生长,这表明B为兼性厌氧菌。用光学显微镜观察,该菌的菌体形状呈球状,革兰氏染色后菌体呈紫红色,属于革兰氏阴性菌;无荚膜,无芽孢。 C:在牛肉膏蛋白脉固体培养基上菌落呈黄色,不透明,表面呈凸透镜状,光滑较湿润,菌落呈圆形,边缘规则且光滑。在固体培养基平板的表面、中部和底部都有生长,这表明C为兼性厌氧菌。用光学显微镜观察,该菌的菌体形状呈杆状,革兰氏染色后菌体呈紫红色,属于革兰氏阴性菌;无荚膜,无芽孢。 3.5.2菌株的生理生化特征 （1）唯一碳源试验 本实验的原理是不同菌种在碳源一样的培养基中，由于其利用情况不同会影响菌株的生长，我们可以根据菌株生长情况来判断其对该碳源的利用情况。所以我们将A、B和C接种到这种特定的含各种不同氮源的碳源试验培养基上后,各培养基中菌株的生长情况如下表所示: 唯一碳源实验结果 菌种编号 葡萄糖 乙醇 蔗糖 DL-甲硫氨基酸 柠檬酸 草酸 A +++ +++ ++ + + + B +++ +++ +++ ++ — — C ++ + ++ — — — 上表说明A能够利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、DL-甲硫氨基酸、柠檬酸和草酸作为唯一碳源;B能够利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、DL-甲硫氨基酸为唯一碳源,不能利用柠檬酸和草酸;C能够利用葡萄糖、乙醇、蔗糖为唯一碳源,不能利用DL-甲硫氨基酸、柠檬酸和草酸。 （2）唯一氮源试验 唯一氮源试验就是在碳源不同而氮源却唯一确定的的情况下看看各菌株的利用情况，所以要将A、B和C接种特定试验培养基上,我们通过看各培养基中菌株的生长情况来判断利用状况。 唯一氮源实验结果 菌种编号 硫氨酸 酵母膏 硝酸胺 蛋白胨 硝酸钾 A +++ +++ ++ ++ + B + +++ +++ ++ + C ++ + + — — 上表说明A和B能够利用硫酸按、酵母膏、硝酸按、蛋白胨和硝酸钾作为唯一氮源;而C能够利用硫氨酸、酵母膏和硝酸胺作为唯一氮源,却不能利用蛋白胨和硝酸钾。 （3）运动性试验 将接种过三种菌种的试管分别直立放于试管架上,并把它们放在恒温箱中用适宜温度培养，经定期观察发现,A、B、C接种后菌株仅在在接种线处生长,细而密,并未出现扩散。这说明A、B、C都不具有运动性。 （4）糖、醇、糖苷类碳源的分解试验 不同的细菌在分解糖或醇(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油)的能力上有很大差异。菌种在发酵后能产生各种有机酸(如乳酸、醋酸、甲酸琥珀酸)及各种气体(如H2、CO2、CH4)。酸的产生可以用指示剂来指示。我们在配制培养基时预先加入澳百里酚蓝,当细菌发酵产酸时,培养基的颜色就会由紫色变为黄色。气体的产生可由糖发酵管中倒立的杜氏小管中的气泡的有无来证明。 实验结果如下所示，A菌种的发酵结果既产酸又产气，B菌种能产酸但不产气，C菌种既不产酸又不产气。 糖、醇、糖苷类碳源的分解实验结果 菌种 A B C 实验结果 ++ + — 注：++表示产酸产气 +表示产酸不产气 —表示不产酸不产气 （5）淀粉水解试验 我们知道，有些菌种可以合成淀粉酶并把它分泌到胞外。而淀粉酶可以把淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖。淀粉的特性是遇碘变蓝，但淀粉水解后遇碘不再变蓝。我们可以在充分生长后的A、B、C淀粉水解培养基上滴加碘液，看是否有蓝色出现。 试验结果为菌落周围仍为蓝黑色,无水解圈产生。由此可见,菌株A、B、C都不具有淀粉水解能力。 淀粉水解试验结果 菌种 A B C 实验结果 — — — 注：—表示没有淀粉水解能力 （6）甲基红试验 设计该实验的目的是想看看菌株是否能分解葡萄糖产酸。某些菌株在糖代谢过程中,将培养基中的糖先分解为丙酮酸,丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳酸等。因为培养液中含有有机酸，我们可以加入甲基红指示剂看培养液颜色变化来进行检验。 甲基红试验结果 菌种 A B C 实验结果 + — — 结果表明A、B、C培养24h后,在培养液中加入甲基红指示剂,A的培养液的颜色变化是由黄色变为红色,B和C的培养液仍为黄色。这说明菌株A的培养液中含有有机酸，B、C培养液中没有产生有机酸。 （7）乙酰甲基甲醇试验 本试验用的是间接测定法，细菌在分解葡萄糖的过程中会产生代谢产物，而我们就是通过检测这种代谢产物来检测该种细菌。乙酰甲基甲醇是丙酮酸脱羧缩合和脱羧后转变而成的，丙酮酸又是葡萄糖的代谢产物。乙酰甲基甲醇在碱性条件下,被空气中的氧气氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基起作用生成红色化合物,此为VP.正反应。我们在培养基中加入乙酰甲基甲醇，看微生物能否分解这种代谢产物来判定微生物的种类。 试验结果如下所示，表明A、B、C、三种菌种都不能分解乙酰甲基甲醇。 乙酰甲基甲醇试验 菌种 A B C 实验结果 — — — （8）柠檬酸盐试验 因为有些细菌可分解柠檬酸形成CO2,而培养基中钠离子可以形成碳酸钠,使培养基的碱性增加,我们可以在培养基中加入指示剂，根据培养基中的指示剂变色情况来判断试验结果。我们使用的指示剂是1%的澳百里酚蓝酒精溶液,它的变色范围为pH6.3-7.6，颜色变化是由黄到蓝;也可以用酚红水溶液作为指示剂,其变色范围pH6.3-8.0，颜色变化为由黄到红。 试验结果如下所示,结果表明,A具有利用柠檬酸的能力B、C不能利用柠檬酸。 柠檬酸盐试验 菌种 A B C 实验结果 + — — 注：+表示能利用 —表示不能利用 3.6菌种鉴定 通过以上多个实验的综合结果，我们初步确定了微生物的种类，现在将结果汇总展示如下： 实验项目 结果 A B C 细胞形状 短针 球形 杆状 形成芽孢 无 无 无 有荚膜 无 无 无 革兰氏染色 阴性 阴性 阴性 好氧性 兼性厌氧 兼性厌氧 兼性厌氧 运动性 无 无 无 糖、醇、糖苷类碳源分解实验 ++ + — 淀粉水解实验 — — — 甲基红实验 + — — 乙酰甲基甲醇实验 — — — 柠檬酸盐实验 + — — 初步鉴定结果表明A为克雷伯氏菌属，B为氨基酸球菌属，C为变形菌属 第四章 讨论 本次课题的研究都是基于实验操作的基础之上的，是在老师的指导下顺利完成的，实验过程尽量要求准确，避免可能出现的错误和漏洞，具有科学依据。 菌种的筛选需要大量的实验，每个试验我们都设有对照，旨在准确的的得到试验结果。在实验过程中我们也许会遇到一些难以避免的问题，比如发酵过程中的污染问题、溶氧量的控制问题，在红霉素的生产过程中可能会出现红霉素降解问题，还有其含有的杂质可能会影响红霉素产量和质量。红霉素发酵属于有氧发酵，其中的好氧菌可能会争夺一部分氧分而导致发酵罐通氧量不足，红霉素产量受到影响。所以在发酵过程中可以不断监测可控条件的变化，及时做出应对措施，使损失降到最低。筛选的过程我们也要求准确，影响菌种的因素我们都有考虑在内，实验最终得出了结果。 结论 本次课题的实验是在安阳工学院实验室完成，从接种到发酵再到后来的菌种筛选及鉴定都有作者和老师共同完成。 在正交试验时，我们选定的是四因素三水平，我们比较了各个菌种的形态特征，菌落特征，有无荚膜和革兰氏染色情况等等。通过对各种菌种的形态和性能对比，我们筛选出来的优质的、符合我们要求的菌种是克雷伯氏菌属、氨基酸球菌属和变形菌属。 同时，通过这次课题研究我也学习到了红霉素对于抗生素领域的重要意义，对于指导工业生产也具有很大的意义和价值，只有懂得了菌种的筛选要求及鉴定准则才能提高红霉素质量，更好的服务于人们的生活。 参考文献 [1] 范代娣, 陈斌, 尚龙安. 红霉素发酵工艺优化研究[J]. 生物工程学报, 1999, 12(5): 106-110. 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