10 毛细管电泳法

null第二十一章 毛细管电泳法第二十一章 毛细管电泳法21.1概述21.1概述电泳是电解质中带电粒子在电场中作用下向电荷相反方向向迁移的现象。 由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白； 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖；21.1.1 经典电泳分析 traditional electrophoresis21.1.1 经典电泳分析 traditional electrophoresis 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法叫电泳法。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。21.1.2 高效毛细管电泳分析 high performance capillary electrophoresis21.1.2 高效毛细管电泳分析 high performance capillary electrophoresis高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管,； 二是采用了高达数千伏的电压。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加， 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。21.1.3 分离过程21.1.3 分离过程 电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。 带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。21.1.4 高效毛细管电泳的特点21.1.4 高效毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶 2.分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数； 3.操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行； 4.应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等； 21.2 高效毛细管电泳(HPCE)基本原理 21.2 高效毛细管电泳(HPCE)基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？ 当带电离子以速度ν 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE = qE 阻 力：F = fν 故： qE = fν q—离子所带的有效电荷； E —电场强度； ν—离子在电场中的迁移速度； f —平动摩擦系数 ( 对于球形离子： f =6πηγ；γ —离子的表观液态动力学半径；η —介质的粘度； )null所以，迁移速度：（球形离子） 物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。 淌度μ ：单位电场强度下的平均电泳速度。 21.2.1电渗现象与电渗流 21.2.1电渗现象与电渗流 1.电渗流现象 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。 当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。 2.HPCE中的电渗现象与电渗流2.HPCE中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。 在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。3.HPCE中电渗流的大小与方向3.HPCE中电渗流的大小与方向 电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即 ν电渗流 = μ E 电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即 μ = ε0εξ ε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。 ν电渗流 = ε0εξ E 实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 ν电渗流 = Lef/teo Lef —毛细管有效长度； teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。HPCE中电渗流的方向HPCE中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极； 改变电渗流方向的方法： （1）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。4. HPCE中电渗流的流形4. HPCE中电渗流的流形 电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。5. HPCE中电渗流的作用5. HPCE中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： ν+ =ν电渗流 + ν+ef 阳离子运动方向与电渗流一致； ν- =ν电渗流 - ν-ef 阴离子运动方向与电渗流相反； ν0 =ν电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致； （1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速； （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在HPCE中，控制电渗流非常重要。四、淌度 mobility 四、淌度 mobility 淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度； 淌度不同是电泳分离的基础。 1.绝对淌度(absolute mobility)μab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。 2.有效淌度(effective mobility)μef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 μef=∑aiμi ai —溶质i 的解离度；μi —溶质i 在解离状态下的绝对淌度 3.表观淌度 μap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）： νap=μap  E五、HPCE中的参数与关系式 parameters and relation in HPCE五、HPCE中的参数与关系式 parameters and relation in HPCE1.迁移时间（保留时间） HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。V—外加电压；L—毛细管总长度； 2.分离效率（塔板数） 在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。3.分离度 3.分离度 影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：分离类型分离类型根据试样性质不同，采用不同的分离类型； 每种机理的选择性不同；一、毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis ，CZE一、毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis ，CZE 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。 最基本、应用广的分离模式；二、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC二、 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 在电场力的作用下，胶束在柱中移动。null 2. 电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流 > ν电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动； 5.色谱与电泳分离模式的结合。 3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；三、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE三、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis ，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。 特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。四、毛细管电渗色谱 capillary electroosmostic chromatography ，CEC四、毛细管电渗色谱 capillary electroosmostic chromatography ，CEC 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；五、非水毛细管电泳 Non-aqueous capillary electrophoresis，NACE五、非水毛细管电泳 Non-aqueous capillary electrophoresis，NACE 在有机溶剂为主要的非水体系中进行的毛细管电泳。 优点：增加了在CE的可优化参数，如介质的极性、介电常数等；还可增加溶解度，提高操作电压产生更高的分离效率等。