cDNA文库的构建

一、 cDNA文库的构建在细胞分化方面的知识 （一）在某种特定细胞中的某个特定时期提取总RNA（mRNA与micro-RNA、NATs、long no-coding RNA）： 以小鼠股骨组织为例； 以小鼠骨髓巨噬细胞系RAW264.7为例； 以原代小鼠骨髓巨噬细胞（纯度70%？）为例； cDNA文库（百度） 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。 目录 1概述 2定义 3原理 4注意事项 5 mRNA ? 制备 ? 来源 ? 完整性 ? 丰度 ? 分离 6 TRNA 7 cDNA ? 第一链 ? 第二链 ? 自身引导 ? 置换合成 8克隆 9筛选鉴定 10载体制备 11鸟枪法 12物化方法 13分离基因 14化学合成 15 PCR 1概述 cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。 cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有10^5种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都仅有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。 2定义 (cDNA Library)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。（所有发育阶段？） 3原理 经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 4注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 获得起始RNA 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 反转录 这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。 层析柱cDNA分级 这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。 连接载体 噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。 5 mRNA 制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备 来源 选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量 完整性 1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统"。 无细胞提取物的制备： 用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心除去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统. 常见的体外无细胞翻译系统: 兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白. （一个血红蛋白由四条珠蛋白组成，即两个α肽链，两个β肽链。） 缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。 麦胚系统。 用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中. 利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。 优 点：适于研究mRNA,活力强,价格低廉等. 缺 点：不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止. （哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译 *SDS-PAGEanalysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells） 2、mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力 3、mRNA分子的大小 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间. 4、总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力 利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA *Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA; Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII 丰度 1)高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA . 2) 低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下. 5、mRNA的富集方法 典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝. mRNA的丰度与文库克隆子数的关系 ln(1-P) N= ln(1-1/n) N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例 1) 按大小对mRNA进行分级分离 * 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低. * 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA. 2) cDNA的分级分离 * mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来. * 优 点: a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解 b)增加了获得全长cDNA克隆的概率 c)获得更准确的分级分离效果(分子量) 3)多聚核糖体免疫学纯化法 * 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝. 分离 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 准备工作： 1）.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex., 然后置于室温。 2）.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。 3）.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。 试验步骤： 表3：加入试剂量据此表 Total RNA RNase-free Water to: Buffer OBB (ul) Oligotex Suspension (ul) Prep size <=0.25mg 250ul 250ul 15 Mini 0.25-0.5mg 500ul 500ul 30 Midi 0.5-0.75mg 500ul 500ul 45 Midi 0.75-1.00mg 500ul 500ul 55 Midi           1）. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul 2）. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀 3）. 置于70℃水浴中3min 4）. 取出置于室温（20℃－30℃）10min 5）. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。 6）. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min 7）. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，离心1min 8）. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。 9）. 测OD,并电泳定量。 2. 磁珠法分离mRNA 1）. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul. 2）65℃加热10分钟。 3）加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。 4）同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml. 5) 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。 6). 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc, 注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。 7). 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。 8). 用磁性分离架捕获SA-PMPs, 小心去上清，但不要弃去。 9). 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs. 10) 将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。 11) 用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。 12) 将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。 13) 将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。 14) 加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20℃沉淀过夜。 15).4℃，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。 16).4℃，7500g离心10 分钟。 17).去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。 18).重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱 注意事项： (1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行 (2．如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。 (3．mRNA的电泳图是smear。 6、TRNA TRNA提取 试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳 22.94g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠10g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲变性裂解液： 0.78M柠檬酸钠 8.25ml 10%肌氨酸钠12.375ml 异硫氰酸胍118.05g 加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） ▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M醋酸钠 PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲ 4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用 ▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸): MOPS 41.86g NaAC·3H2O 4.10g 0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml 用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。 ▲ 1x MOPS: 10x MOPS 30ml 加DEPC水270ml，用时现配。 ▲4x RNA Loading buffer: 10x MOPS 400ul 甘油（高压过） 200UL 溴酚兰 10ul 甲醛(37%) 72ul 去离子甲酰氨310ul EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul 在4℃ 可保持3个月 ▲ 10x PBS pH=7.4 NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g KH2PO4 2.4g 定容至 1000ml ▲变性电泳胶： 称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。 ▲变性电泳缓冲液： 在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml 2.动物组织t RNA的提取 1． 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。 2． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。 3． 根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。 4． 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。 5． 冰浴10分钟。 6． 4°C，12000g离心20分钟。 7． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。 8． 加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。 9． 4°C，12000g离心20分钟。 10． 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。 11． 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。 12． 4°C，12000g离心20分钟。 13． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。 14． 4°C，12000g离心20分钟。 15． 弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。 16． 弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。 17． 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。 表 1 Mg# of tissue 500 800 1000 变性裂解液(ml) 5 8 10 2M NaOAC pH 4 (ml) 0.5 0.8 1 水饱和酚 (mL) 5 8 10 氯仿 (mL) 1 1.6 2 异丙醇(mL) 4 6 8 变性裂解液 (mL) 0.5 0.8 1 异丙醇(mL) 0.5 0.8 1 75% 乙醇(mL) 1 1 1 DEPC-treated H20 (mL) 0.5 0.8 1         3.植物组织t RNA的提取 1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。 2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。 3. 加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。 4. 加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。 5. 冰浴10min。4℃，12000g离心10min 6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。 7. 4℃，12000g离心20min。 8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。 9. 4℃，13000rpm离心15min。 10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。 11. 4℃，13000rpm离心10min。 12. 取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。 13. 4℃，13000rpm离心15min。 14. 弃上清，用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。 15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。 16. 用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。 17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。 4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO) 1． 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。 2． 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。 3．室温温育10分钟 。 4． 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。 5． 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。 6． 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20℃沉淀1小时以上。 7． 4℃,12000g离心10分钟。 8． 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。 9． 4℃，7500g离心5分钟。 10． 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。 11． 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80℃冰箱中保存。 表2 组织量 TRIzol Reagent 氯仿 异丙醇 75%乙醇 50~100mg 1ml 0.2ml 1ml 1ml           7 cDNA cDNA双链合成 1. Superscipt II—RT合成第一链: 1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入 xul mRNA(大约500ng) 1ul Xho I Primer(1.4ug/ul) (5’ GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’) 11-x ul RNase-free water （大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.） 2. 混匀后,70℃反应10分钟; 3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min; 4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂: 4ul 5×first strand buffer 2ul 0.1M DTT 1ul 10mM dNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟; 6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀; 7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶. 2. cDNA第二链的合成 1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega): 20ul 10×DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP(自己配制) xul dd H2O 1ul RNase H(2U/ul) 10ul DNA Polymerase I(10U/ul) 总体系为200ul; 2. 混匀后,16℃反应2.5小时; 3. 70℃灭活10分钟; 4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上; 5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。 注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。 3. 双链cDNA末端补平 1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega): 6ul 10mM dNTP 2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul) 2ul BSA(10mg/ml) 2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟; 3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟; 4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟; 5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA; 6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA; 7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟; 8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味. 注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。 PCR纯化试剂盒操作流程： 1．溶液PE使用前应加入适量体积95%－100%的乙醇，混匀。 2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB，混匀。 3．加入spin column中，13000rpm离心1min。 4．加入0.75ml buffer PE，13000rpm离心1min。 5．13000rpm，再离心1min。 6．将spin column放入一新的离心管中，加入50ul buffer EB，静置10min。 7．13000rpm离心2min。 8．加入30ul buffer EB，静置10min。 9．13000rpm离心2min。 10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。 4 EcoR I adaptor 加接 1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀; 2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂: 1.2ul 10×Ligase Buffer 1ul 10mM rATP 1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul) 3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接; 5 双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切 1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase; 2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂: 1ul 10×Ligase Buffer 1ul 10mM rATP 6ul dd H2O 1ul T4 PNK(10U/ul) 3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟; 4. 稍微离心使反应物集中至管底; 5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂: 4ul Xho 10×Buffer 2ul BSA 5ul ddH2O 8ul Xho I (10U/ul) 6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟; 7. 反应完成,双链cDNA合成完毕。置于4℃准备回收。 6.胶回收cDNA 1．配制小胶数板（每个样品一板）：1%琼脂糖凝胶，2ul EB/300ml 胶 2．取4℃保存样品上样，40ul/孔。 3．电泳50V；1hr 4．紫外灯下分别切下500~1kb、1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.，分别放入已做标记的1.5ml离心管中。 5．称取胶重，加入三倍体积buffer QXI（例如，100mg胶中加入300ul buffer QXI） 6．50℃ 水浴数分钟，至胶完全融化。用手指弹 QIAEX II 使重悬，每管中加入5ul QIAEXII 7．50℃ 水浴10min，每隔2min 取出颠倒混匀数次，使QIAEX II 保持悬浮 8．4℃，13000rpm，30sec。（弃上清，离心机中甩一下，吸取上清） 9．加入500ul buffer QXI，轻弹管底使QIAEX II 重悬 10． 离心并去上清（同操作8） 11． 加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，去上清 12． 再加入500ul buffer PE，重悬QIAEX II，离心30sec，弃上清，离心机中甩一下，吸去上清 13． 超净台上吹干（至无乙醇味），加入10ul elution buffer，重悬QIAEX II，静置5min，13000rpm，30sec。吸上清，冰上放置。 14． 取1ul上清上样电泳，同时做分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 （1kb ladder）及DNA含量标准（10ng，20ng）作对照。 15． 将收回的cDNA置于-20℃内保存，据电泳结果，取适量DNA进行连接。 注意事项： 1．胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜。 2．胶回收时电压要稳定。 第一链 第一链的合成 oligo(dT)引导的DNA合成法: 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链. 缺 陷: 因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦. 随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) : 根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.