20世纪80年代中、后期,真核转录因子得到大量深入的研究,这类研究促成了酵母双杂交系统的诞生。研究发现,真核转录因子的DNA结合区(BD)和转录结合区(AD)在功能上和实质上都是可分的。BD能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上,AD能够使转录装置激活基因转录。1985年研究证明,将2种不同蛋白的BD与AD重组,仍能产生有活性的转录因子。后来,一些研究人员发现AD与BD不必在1条多肽上。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能,但当它们在空间上彼此联系时,则能够激活基因转录。Fields和Song证实利用这一特性建立了酵母双杂交系统。
酵母双杂交的原理:将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白,如果这2个目的蛋白能够互相作用,则该相互作用会促使AD和BD互相靠近而产生有活性的转录因子,进而激活事先构建到酵母基因组中的
报告
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基因的转录。
Gal4和LexA系统:Gal4和LexA系统均是依赖转录激活报告基因来检测蛋白相互作用的。
Gal4和LexA系统可用于
1、检测2个已知蛋白间的相互作用
2、从表达文库中筛选相互作用蛋白
3、用于鉴定蛋白相互作用区域
造成假阳性的原因有很多,归纳起来主要有以下几点
1、诱饵蛋白本身有激活作用;
2、靶蛋白本身就比较“黏”,不需诱饵蛋白的介导便可与报告基因的上游激活序列有直接作用,进而激活报告基因的转录;或者,靶蛋白同启动子区域上结合的其他蛋白质(而非诱饵蛋白)发生了相互作用,导致转录激活;
3、不在细胞同一时相、同一组织表达的蛋白质,相互之间也可能发生作用,尽管如此,这种相互作用是机械的而不是生理意义上的
4、还有一些假阳性结果产生的途径尚不能解释
假阴性的成因主要有:
1、Gal4和LexA系统要求被测蛋白定位于细胞核,然而有些蛋白却有强疏水结构域,还有些蛋白携带定位于细胞其他细胞器的强信号,这样,涉及后2类蛋白的相
互作用在Gal4和LexA系统中就检测不到
2、Gal4和LexA系统依赖转录激活报告基因而检测蛋白相互作用,而如果蛋白是抑制基因表达的,报告基因就不能被激活转录,双杂交系统就检测不到该蛋白相互作用了。
正是为了解决,Gal4和LexA系统这些固有的问
题
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,以下系统才得以发展:
酵母双杂交系统常用的DNA结合结构域有GAL4和LexA,常用的转录激活结构域有GAL4、VP16或B42。
酵母菌株:为双杂交系统而改造的酵母菌株包含不同拷贝的上游激活序列。菌株L40多用于Lex40系统,该菌株lacZ报告基因(编码B-半乳糖苷酶)上游包括8拷贝的上游激活序列。菌株HF7c一般用于基于GAL4的酵母双杂交
分析
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,在lacZ报告基因的上游只有3拷贝的GAL4上游激活序列。
酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记(如HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长)或编码酶的基因(MEL1基因的转录激活能使酵母产生a-半乳糖苷酶)组成。
目前, 酵母双杂交系统及其衍生方法广泛用于研究蛋白- 蛋白之间的相互作用、蛋白与其它分子相互作用, 筛选未知蛋白, 研究蛋白的功能等领域。利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。现在该系统已经尝试在药物机理研究方面的应用, 且有望用于研究蛋白质多复合
体中各种蛋白质的连锁图谱(P ro tein L inkageM ap ) , 从而研究转录的复合物、病毒等蛋白质复合体的相互作用。虽然该方法存在一些缺点, 如假阳性、假阴性等问题。但是, 双报告基因系统有效地解决了假阳性问题。综上所述, 酵母双杂交系统正在不断地完善和发展, 已经并将继续在蛋白质功能的研究中发挥巨大作用。
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