Cdc2和cyclinB在DHP诱导卵母细胞最终成熟阶段的表达

Cdc2和cyclinB在DHP诱导卵母细胞最终成熟阶段的表达 [摘要] 卵母细胞最终成熟促进因子是诱导细胞从G2期转入M期的关键因子，在配子成熟过程中具有重要作用。组成论文采用卵母细胞体外培养技术和实时定量PCR技术分析了两种主要的成熟促进因子：细胞周期调节蛋白( cyclin B )和细胞周期蛋白依赖性激酶-1(cdc2基因编码)在0.5μg/mL DHP处理的卵母细胞中的表达情况。结果表明，0.5μg/mL DHP处理组的卵母细胞GVBD率显著高于对照组，cyclinB，cdc2 2个基因的表达量也比对照组显著增加。这些结果表明cdc2和cyclinB是鲤鱼卵母细胞成熟的重要功能基因。 关键词：cdc2  cyclinB  卵母细胞成熟  DHP mRNA expression of Cdc2 and cyclinB induced by DHP finalduring final oocyte maturation Abstract：Final oocyte maturation promoting factor is a key factor in inducing cell into M phase from G2 phase has an important role in the maturation of gametes. Composition papers using oocytes in vitro techniques and real-time quantitative PCR analysis of the two major maturation promoting factor: cell cycle regulatory proteins (cyclin B) and cyclin-dependent kinase -1 (cdc2 genes encoding) at 0.5μg / oocytes mL DHP treated expression. The results showed that the rate of GVBD 0.5μg/mL DHP-treated group was significantly higher, cyclinB, also significantly increased compared with the control group cdc2 2-expressing the amount of the gene. These results suggest that cdc2 and cyclinB carp oocyte maturation is an important function of the gene. Keywords: Cdc2    CyclinB    Oocyte maturation    DHP 目录 工贸企业有限空间作业目录特种设备作业人员作业种类与目录特种设备作业人员目录1类医疗器械目录高值医用耗材参考目录 引言……………………………………………………………………………………1 1. 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ………………………………………………………………………2 1.1 实验材料………………………………………………………………… 1.2 鲤鱼卵母细胞培养液…………………………………………………… 1.3卵母细胞收集…………………………………………………………… 1.4卵母细胞体外培养……………………………………………………… 1.5卵母细胞形态观察………………………………………………………. 1.6引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ………………………………………………………………… 1.7总RNA的提取和DNA污染的去除………………………………………. 1.8逆转录合成cDNA第一链和PCR扩增……………………………………. 1.9实时荧光定量PCR反应…………………………………………………… 1.10基因引物特异性鉴定………………………………………………… 1.11引物扩增效率验证和标准曲线的绘制…………………………………. 1.12 数据分析………………………………………………………………. 2. 结果与分析………………………………………………………………….. 2.1 DHP对卵母细胞GVBD的影响……………………………………………. 2.2 DHP对细胞周期蛋白B（cyclin B）的影响…………………….. 2.3 DHP对细胞分裂周期2（cell division cycle 2，cdc2）的影响… 3．讨论…………………………………………………………………………. 3.1 DHP对卵母细胞GVBD的影响……………………………………… 3.2 DHP对细胞周期蛋白B（cyclin B和 细胞分裂周期2（cell division cycle 2，cdc2）的影响…………………………………………. 4．结论………………………………………………………………………… 致谢语………………………………………………………………………… 参考文献………………………………………………………………………… 引言 硬骨鱼类卵母细胞的最后成熟(Final Oocyte Maturation)从第一次有丝分裂G2期未(或M期始) 至卵子排出( 第二次有丝分裂中期)。这个时期经历的时间虽短，但卵母细胞发生的变化却很大，包括胚泡破裂(Germinal vesicle breakdown，GVBD)、染色体融合和第一极体的排出[1]。许多基因参与了鱼类配子发生减数分裂过程的调控。其中，成熟促进因子 ( maturation  promoting  factor，MP F ) 是诱导减数分裂暂停的卵子重新进入成熟过程的关键因子[2]。在酵母、两栖动物、无脊椎动物和哺乳动物细胞均有发现[3]。 MPF包括2个亚基：调节亚基细胞周期蛋白 B( cyclin B，) 和周期蛋白依赖性蛋白激酶 ( cyclin dependent kinase 1，CDK1，由cdc2基因编码 )[3] 。 cyclinB和 CDK1结合形成MP前体 ， 经过磷酸化／去磷酸化作用成为具有活性的MPF 。活化的MPF可以催化一系列靶蛋白的磷酸化，诱导G2期向M期转换 ； 在卵子发生过程中，则诱导发生卵泡破裂( GVBD )、停滞减数分裂启动等细胞行为的发生[4-7] 。现有研究资料表明，MPF的有序表达、活化及降解是保证两性生殖生物配子发生、 成熟与分化等生物过程有序进行的重要条件[8]。 17α，20β双羟孕酮（17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one，DHP）是大多数硬骨鱼的成熟诱导激素(MIH),MIH 是传导 GtH 作用的类固醇激素 , 离体情况下, DHP类固醇对卵母细胞 GVBD 具有较强的诱导能力。在离体情况下, 卵黄发生时DHP含量很低, 而在最后成熟时显著升高, 并与GtH 剧增相符。因此在马苏大麻哈鱼,DHP是最有效的 MIH。用大致相同的方法, Patrino等证明鲤科鱼类的MIH也是DHP[9]。实际上, 大多数硬骨鱼类的MIH都是DHP[10] 。 鲤鱼（Cyprinus carpio）是我国本土的淡水鱼类，也是我国重要的淡水养殖鱼类之一。目前关于鱼类性腺发育和配子发生的知识主要集中于细胞水平，分子水平的研究报道较少。因此，本研究利用DHP诱导体外培养鲤鱼卵母细胞，并利用实时荧光定量 PCR ( qRT—PCR ) 技术分析了在DHP诱导下cdc2和cyclinB这2个基因在鲤鱼卵母细胞的 m R N A表达水平 ，为解析DHP诱导下 MPF在鲤鱼卵母细胞成熟过程中的作用机理奠定基础。 1  材料与方法 1.1 实验材料 实验用鲤购买于超市，选择腹腔饱满，体重600 g左右的雌性成熟鲤鱼。 17α,20β-双羟基-4-孕烯17α,20β-di-hydroxy-4-pregnen-3-one(DHP)、 Trizol Reagent (Molecular Research Center，USA) 17α,20β-di-hydroxy-4-pregnen-3-one、diethylstilbestrol (Sigma，USA) PrimeScript? RT reagent kit (Takara，China) SYBR Green Real-time PCR Master Mix (Takara，China) 1kb Plus DNA Ladder (Tiangen，China) 1.2 鲤鱼卵母细胞培养液 采用Cortland培养液[105]：160 mmol/L NaCl，2.55 mmol/L KCl，1.56 mmol/L CaCl2，0.93 mmol/L MgSO4，17.85 mmol/L NaCO3，2.97 mmol/L NaH2PO4，5.55 mmol/L葡萄糖，100 U/ml 青霉素，0.2 mg/ml链霉素，pH7.5。在不同化合物对鲤卵母细胞最终成熟的影响实验中，各化合物分别溶于Cortland溶液中。DHP浓度为0.5 μg/mL。 1.3卵母细胞收集 性成熟雌性鲤鱼腹部75%的酒精消毒后，进行腹腔解剖，小心取出两侧卵巢，置于预冷的Cortland培养液中，用Cortland培养液[106, 107]清洗三次以去除周围血液及结蹄组织，将清洗干净的卵巢转移到另一放有新鲜Cortland培养液的培养皿中，用镊子小心把卵母细胞剥离卵巢，然后选取直径0.5-0.7mm的不透明状态卵母细胞，用剪掉尖头的1mL移液枪放在六孔板中进行体外培养，每孔约300个卵母细胞。