膜片钳PPT课件

膜片钳(PatchClamp)I=V/R一、概述及设备二、膜片钳 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 基本步骤三、常用检测基本原理四、其它应用、进展2一、概述及设备离子通道是一种特殊的膜蛋白，是细胞内部与部外联系的桥梁和细胞内外物质交换的孔道，带电离子经此离子通道形成的膜内外的不同分布态势，是可兴奋细胞静息电位和动作电位的基础，是生命活动的基础。1.结构研究：生化确定蛋白质氨基酸序列+X线衍射确定结构+……2.功能研究：电生理技术（膜片钳）+……3.结构和功能相结合：电生理技术（膜片钳）+转基因技术+……34电流钳----测电压向细胞内注入恒定或变化的电流，记录相应膜电位变化电压钳----测电流为负反馈系统。注入电流，同时钳制电压于固定的某值，此时注入电流恰好与离子通道开放产生的离子流大小相等，方向相反，以此得知该离子流大小及方向。膜片钳----最初只是一种特殊的电压钳技术，之后……1976,德国马普生物物理化学研究所ErwinNeher&BertSakmann1991,诺贝尔生理学或医学奖                              ErwinNeherBertSakmann   1/2oftheprize   1/2oftheprizeFederalRepublicofGermanyFederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürBiophysikalischeChemie,Goettingen,FederalRepublicofGermanyMax-Planck-InstitutfürmedizinischeForschung,Heidelberg,FederalRepublicofGermany电压钳原理：用两根尖端直径0.5um的电极插入细胞内，一根记录跨膜电位，另一根电流注入，以固定膜电位。施加指令电位（Vc）时，经过短路，Vm=Vc。但施加Vc后，离子通道开放，Vm<Vc，为使Vm=Vc，输入电流补偿，此补偿电流即与离子通道开放引起的电流大小相等，方向相反，即可知该离子通道开放引起的电流大小及方向。6VmVc电压钳的缺点：1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性；2、不能测定单一通道电流。3、对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在10－30μm之间)进行电压钳实验，技术上有更大的困难。7膜片钳（PatchClamp)基本原理：尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到细胞膜表面，形成紧密封接，细胞膜小片区域（patch）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定膜电位(clamp)，然后对电极尖端下面积仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几个离子通道的电流进行记录。1pA；1μm；10μs8膜片钳实验系统电子学部件:放大器；计算机接口，数据采集、分析系统。光学部件和光电接口：显微镜；监视器等。机械系统:防震台等。辅助系统：电极拉制器；切片机；孵育槽；灌流系统等9AXONHEKA……防震台，屏蔽网，监视器，PCO高灵敏度冷却型CCD相机，BX51红外微分相差干涉显微镜（IR-DIC），微操纵器，10放大器，刺激器，CCD图像传感器，ISO-Flex刺激器及刺激隔离器(AMPI)11WarnerTC-324B细胞记录槽温度控制仪12olympus奥林巴斯生物显微镜电源箱，CSTKon-line3KVAups不间断电源13水平振动切片机，孵育槽14玻离电极拉制仪，蠕动泵15PR-10压力调节器（ALA压力灌流给药系统）SchmidbauerTransformatorenundGeraetebauGmbH变压器16此外，我们还有Till钙成像系统(不属膜片钳系统):单色光发生器(PolychromeV)和激光控制器（ICU）17软件系统：目前的数据采集和分析软件系统主要是Axon公司的Pclamp软件和HEKA公司的PatchMaster软件。在实验后期文章发表中还涉及到一些图形处理软件，如Minianalysis,Origin,Igor等软件。1819细胞贴附式全细胞记录式外面向外式内面向外式单通道电流膜电位或膜电流膜片钳的几种记录模式极其形成：各种记录模式的形成过程21单通道记录：操作简单，可获得单通道电导，通道开放概率，通道开关时间的分布特征。AXON200B是电容反馈式放大器，噪声低，适合做单通道膜片钳全细胞记录：反映细胞整体的功能信息变化，易于更换细胞外液。AXONMulticlamp700B放大器及HEKAEPC10放大器为国内主流放大器。AXON200B二、膜片钳记录基本步骤（一）膜片钳记录分类1.分散细胞膜片钳技术急性分离细胞（略）酶消化作用对通道、受体的影响细胞原代培养（略）基因表达及突触传递改变2.脑片膜片钳技术盲插钳制法（略）红外可视钳制法22（二）红外可视钳制法基本步骤(全细胞封接)配制切片液及灌流液ACSF，冻存切片液至冰水混合态二元气饱和ACSF动物麻醉、断头、取脑、切片ACSF中孵育脑片至少30min拉制玻璃电极脑片入记录槽，持续ACSF灌流1-3ml/min低倍镜定位，IR-DIC镜选择靶细胞23玻璃微电极充灌电极内液(预配)，并固定于电极夹持器维持电极正压，入液，补偿液接电位操纵电极尖端至靶细胞上方，压之有凹痕（快）撤正压，予负压，予半量钳制电压，GΩ（1min内）封接后予全量钳制电压补偿C-fast，破膜补偿C-slow，稳定10-15min24（三）膜片钳放大器的工作模式：(1).电压钳模式：在钳制细胞膜电位的基础上改变膜电位，记录离子通道电流的变化，记录的是诸如通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。是膜片钳的基本工作模式.(2).电流钳模式:向细胞内注入刺激电流，记录膜电位对刺激电流的反应。记录的是诸如动作电位，EPSP;IPSP等电压信号。25(一)突触化学性突触电突触三、常用检测基本原理1.突触的概念.突触的分类神经元间紧密接触并进行信息传递的部位。定向突触非定向突触前膜:突触递质小泡间隙:20－40nm后膜:上有受体2.经典化学突触的传递1).突触的微细结构蛋白AP突触后膜突触前神经元突触间隙突触小泡受体电压门控Ca2+通道Ca2+Ca2+内流突触前动作电位神经递质释放突触后受体变构离子通道开放突触后电位变化2).突触传递过程(电－化学－电)3).突触后电位(1)兴奋性突触后电位Excitatorypostsynapticpotential,EPSP突触前轴突末梢AP兴奋性递质释放递质与后膜受体结合后膜离子通道开放EPSPNa+内流(K+外流)Ca2+内流去极化(2)抑制性突触后电位Inhibitorypostsynapticpotential,IPSP突触前轴突末梢AP抑制性递质释放递质与后膜受体结合后膜离子通道开放IPSPCl-内流(K+外流)Ca2+内流超极化(2)动作电位的产生(1)突触传递的总和3.动作电位在突触后神经元的产生空间总和时间总和4.突触的可塑性(Plastcity)（1）强直后增强（posttetanicpotentiation）高频刺激后，突触后电位持续增大（2）习惯化（habituation）和敏感化(sensitization)（3）长时程增强（long-termpotentiation,LTP）和长时程抑制(long-termdrepression,LTD)强直后增强（posttetanicpotentiation）连续刺激运动神经元轴突，可使得：1（蓝框）、骨骼肌细胞的EPP首先出现易化和压抑；2（红框）、刺激中断之后，单脉冲刺激引起的EPP幅度加大（强直后增强）。习惯化（habituation）习惯化和敏感化测试的实验模型：由诺贝尔生理学和医学奖获得者EricR.Kandel用海兔及其缩腮反射所创立。敏感化（sensitization）一次刺激（伤害性刺激）使突触对原有刺激（非伤害性刺激）的反应增强和延长，传递效率提高的现象。（二）受体:细胞膜或细胞内能与某些化学物质(递质、调质、激素)特异性结合并产生生物效应的特殊分子。细胞膜上涉及到离子通道的主要受体：Glu能离子型受体激动剂拮抗剂AMPAGluR1GluCNQXGluR2AMPAGluR3GluR4KainateGluR5GluCNQXGluR6KAGluR7KA1KA2NMDANR1GluAP5NR2ANMDAMK801NR2BNR2CNR2DGlu能离子型受体介导快信号传递，另有Glu能代谢型受体与膜内G蛋白偶联，介导较缓慢的生理反应，与膜片钳实验关系小，略。39GABA受体激动剂拮抗剂GABAa苯二氮卓类GBZ荷包牡丹碱GABAb巴氯酚CGP35348CGP36742GABAcTPMPA（三）几个名词PSC突触后电流EPSC兴奋性突触后电流sEPSCmEPSCIPSC抑制性突触后电流sIPSCmIPSCEPSP和IPSP40（四）常用检测基本原理41PSCIPSCEPSCbicuculine&CGP35348CNQX&APVsEPSCmsEPSCTTXsIPSCTTXmsIPSCEPSC，sEPSC,mEPSC,eEPSC突触前释放的谷氨酸，作用在突触后的AMPA或者NMDA受体上，产生的突触后电流，谓之EPSC。谷氨酸的释放有两大类：1，自发释放，就是spontaneousEPSCs,即sEPSC；这类释放，包括不依赖突触末梢的动作电位发生，和依赖动作电位两种；那么：2，如果TTX阻断动作电位，此时依然有谷氨酸的释放，这类释放不依赖动作电位，是谓miniatureEPSC;3，人为刺激突触前，一般用电，就是evokedEPSC；现在还有用光遗传法，光刺激释放，也都属于eEPCs。4243PSCIPSC44动作电位45分离离子通道电流策略特异性通道阻断剂阻断，阻断前后电流相减阻断其它通道电流用特定的电压钳制激活通道电流……快钠通道-40mv低阈值钙通道-100mv高阈值钙通道-20mv钾通道-40mv-----0mv以上漏电流:膜电容电流+膜电阻电流Leaksubstraction46离子通道电流----Na+阻断K电流：电极内液用Cs代K，胞外加TEA&4-AP47离子通道电流----K+阻断Na电流：细胞外液中加TTX阻断Ca电流：细胞外液中加CrCl2或BaCl248离子通道电流----高阈值Ca+阻断Na电流：细胞外液中加TTX阻断K电流：细胞外液中加TEA,4-AP49离子通道电流----低阈值Ca+阻断Na电流：细胞外液中加TTX阻断K电流：细胞外液中加TEA,4-AP50区分突触前还是突触后作用一般可用mEPSC的指标来反映药物的作用位点如果加药后mEPSC的频率改变，认为药物作用于突触前如果加药后mEPSC的幅度变化，则认为药物影响了突触后受体的敏感性而sEPSC则不能做此简单推断51四、其它应用、进展穿孔膜片钳全自动膜片钳在体膜片钳膜片钳与PCR结合single-cellPCR膜片钳结合显微荧光探针技术（钙成像）膜片钳结合双光子显微技术52