基因工程----花粉管通道法原理

花粉管通道法　　在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。　　1花粉管通道法的生理学基础　　花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道形成的途径渗透，经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞。这一技术原理可以应用于任何开花植物。水稻是自花授粉作物，因此这种方法同样适用于水稻。围绕着花粉管通道的形成是一个发生在植物花器结构中的传粉授精的过程。从狭义上理解就象字面表明的那样，授粉是指从花粉被送到柱头上到在柱头上萌发的过程，实际上应该是一个以狭义授粉为中心的包括这一过程的非常复杂的生理现象，即包括花粉形成、传粉、花粉萌发、花粉管伸长以及继花粉管伸长之后的受精问题，甚至还包括拒绝受精现象。　　被子植物的花器结构已研究得比较清楚，最外面的是子房，子房中有胚珠，它由外胚珠、内胚珠及珠心、珠孔、珠柄组成。珠心内有8核，近珠孔端有3个核，一个分化为卵细胞，2个分化为助细胞。助细胞和卵细胞组合成卵器。这三个细胞排列成三角形，各细胞都呈梨形，尖部朝着珠孔端。近合点端的3个核分化为反足细胞。胚囊的中央有两个极核，并和周围细胞质组成一个中央细胞。因此典型的被子植物胚囊为8核7细胞胚囊，亦称为雌配子体，卵细胞称为雌配子。雄配子体由含有大量淀粉的营养核和具有微管的两个精细胞、此外还有多糖类、线粒体组成。　　植物开花以后，落在柱头上的花粉粒，被柱头分泌的粘液所粘住，以后花粉的内壁在萌发孔处向外突出并继续伸长，形成花粉管，这一过程，称作花粉粒的萌发。花粉落在柱头上以后，首先向周围吸收水分，吸水后的花粉粒呼吸作用迅速增强，多聚核糖体数量增多，蛋白质的合成也有显著的提高。吸水的二细胞花粉粒，其营养细胞的液泡化增强，细胞内部物质增多，细胞的内压增加，这就迫使花粉粒的内壁向着一个（或几个）萌发孔突出，形成花粉管。禾本科作物中，当花粉粘着在柱头上以后，就会引起柱头的萎缩现象，从粘着部分开始逐渐扩大到相邻细胞，最终使得整个柱头的乳突细胞萎缩。这种萎缩是由于已授粉的柱头的细胞的渗透性增大并脱水所致。花粉一粘到柱头上就立刻从花粉中渗出某种液体；同时在花粉粒表面产生瘤状膨起而改变形状。其后，在30-60秒内花粉又恢复到原来的球形。随之，花粉伸入乳突细胞开始萌发。　　2花粉管的细胞学结构花粉管实际上是一种有多个核的单细胞结构。以麝香百合花粉管的电子显微镜像结构为例。在不进行生长的部分，即尖端稍后的基部细胞质中含有丰富的线粒体、高尔基小体、小泡体、脂质体以及囊状结构。与此形成对照，在进行生长的尖端只有囊状结构，而没有其他小体。细胞化学研究证明，花粉管尖端富含DNA、蛋白质、碳水化合物（Rosen，1964）。Sassen观察了矮牵牛花粉粒和花粉管的细微结构。发现在被称为生殖核的外周具有真正的细胞壁。它是由两层构成的，内层含有纤维素微丝，外层含有某种耐酸的物质。生殖核周围的细胞质中含有各种细胞器。这种细胞质与营养核周围的细胞质被某种结构分离出来。营养核是分叶状的，被具有孔穴的核膜包围着。高尔基器产生囊状结构，聚集在花粉管的尖端（加藤幸雄和佐志诚，1987）。　　3助细胞在花粉管伸长过程中的作用花粉管必须伸长才能进入胚囊，花粉管进入胚囊的方法有多种。1.从卵细胞与一个助细胞之间进入。2.从胚囊壁和一个助细胞之间进入。3.直接进入一个助细胞等。在某些种植物中，花粉管进入两个助细胞中的一个，在这一助细胞中释入出精核。用电子显微镜也确证了这种观察（Schulz等，1968）。助细胞对于精核的进入是极为重要的。棉花中，一个助细胞在花粉管到达胚囊之前就开始退化。细胞器膜和液泡发生变化，细胞发生退化。在花粉管的顶端与助细胞的细胞质接触之前，花粉管不会开裂。从其细胞质的结构来看，认为花粉管的内含物需要在压力之下方能注入。受精前，各个助细胞的核及细胞质是正常的。但是一旦受精，其中一个助细胞的核及细胞质便发生变性，花粉管进入这一变性的助细胞之中。精核的释放不是在花粉管的尖端，而是在稍稍靠后的部位，管壁破裂而释放出精核。在这一瞬间，助细胞发生变化。助细胞的细胞壁消失，液泡缩小（Jensen，1968）。然后，花粉管将其中的营养核、两个精子和淀粉释放到助细胞中，被释放出的精子立即移动到已退化的助细胞的合点端。此后，精核进入卵细胞和中央细胞的细胞质，于是形成合子和胚乳核。已退化的营养核和助细胞核，在受精后仍残留在助细胞内。　　已知在花粉中有这样的情况，即在不分裂的细胞中也发生DNA的合成与运转。花粉管核不分裂，但是具有合成DNA的能力。其次是已知在花粉管这样迅速生长的细胞中，伴随着它的生长，形成大量酶类。为此必须进行大量的遗传物质复制（Stanley和Young，1962）。杂交授粉的场合，花粉管顶端是复杂而积极地摄入物质，这说明花粉管是异养的。在花药裂开后，当花粉管到达胚囊的尖端时，助细胞的代谢活性变得最高。Jensen（1965）用电子显微镜研究了棉花的助细胞，他发现助细胞的作用是从珠心吸收物质，并且可以贮藏和转运出去。根据这种作用，认为它供给卵、胚和胚乳以物质，另外，它可能与花粉管在胚囊中的生物合成也有关。　　4钙离子在花粉管伸长中的作用萌发的花粉进入柱头是靠向水性（hydrotropism）进行的。而此后的伸长，有人认为是靠向电性（electrotropism）。其根据是，在柱头和子房之间可以观察到电位差，并且观察到电场可以决定花粉管伸长的方向。业已查明，越是靠近子房越与这种特性有关（Welk，1965）。与这种向电性有关的是热不稳定的水溶性物质，特称其为向化性物质。向化性物质广泛地、组成性分布于植物各组织中。在受精的时候花粉管朝向胚珠的向化性是重要的，钙离子对此起重要作用。据认为，除了钙离子是向化性因子外，钾离子、多肽、胺和糖等可能都是与向化性有关的物质。一般来说可以认为从柱头到胚珠存在一个钙离子的浓度梯度（Jona，1967）。　　Kwack（1967）以文殊兰（Crinumasiaticum）为材料用45Ca研究了钙离子是在细胞的哪一部位起作用从而影响到花粉管生长的。发现在花粉管壁的果胶质中，钙离子的结合最为显著。因而壁的强度增加，渗透性被调节，而大部分阻抑剂的作用都与渗透压有关系。大多数情况由于渗透性减小而促进了花粉管的伸长。如有钙离子存在，其促进效果可以提高一倍以上。而且，钙离子可以使花粉免受各种化学物质及物理处理之害。另外，钙的影响可因阳离子特别是镁、钾和钠离子的存在而加强。根据45Ca放射自显影、果胶酶消化和甲硫氨酸处理等查明，钙离子是与花粉管壁的果胶质物质结合着的。同时，他研究了钙离子对46种园艺植物花粉生长的影响（1965），发现钙离子促进每种植物的花粉萌发和花粉管伸长。在没有钙离子的情况下，需要镁离子。在蔗糖促进花粉管生长的场合，对钙离子的 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最为显著。可以推想，在花粉管生长时，钙离子和各种水溶性无机及有机物质的相互作用发生在生长着的花粉管壁中。在花柱中，花粉管从中心部位的花柱腔吸取各种物质而伸长，它是依靠花柱组织的营养进行的，在花柱中，由于生长持续时间长，因此从消耗花粉粒内的物质的自养转换更替为吸收花柱吸取营养物质。为了保持细胞壁的强度（完整性），在培养基中加入钙离子是必要的。在没有钙离子的情况下，碳水化合物会从花粉中渗透出来。当有钙离子存在时就基本没有这种渗透。　　5其它影响花粉管伸长的因素花粉管尖端的伸长受使细胞壁变软的酶的影响。VanderPluijin和Linskens（1966）了解到花粉管（矮牵牛花柱内花粉管的细微结构）是在花柱的输导组织中层的致密的基层内生长的。由于酶的溶解作用，在正对着花粉的尖端形成一管状通路，因而花粉管才能顺利地在花柱内伸长。当在试管内花粉萌发的初期加入b-1、3-葡聚糖酶时，花粉管伸长增加。蛋白质分解酶抑制花粉管的生长和萌发。这些结果表明，纤维素酶和果胶酶对花粉管壁的伸长是重要的。　　6花粉管通道法国内外研究概况在国内，最早见诸报道的利用花粉管通道法直接导入外源DNA的技术是由周光宇等人建立并发展起来的，并且在棉花、小麦和水稻中都得到了变异子代（段晓岚和陈善葆，1985；黄骏麟等，1981；曾君祉等，1993）。1979年，周光宇发表了“远缘杂交的分子基础——DNA片段杂交的一个论证”。他认为，从分子水平上看，虽然就整个染色体基因组而言，亲缘关系较远的生物间的染色体和染色体外DNA的结构愈不亲合，则愈互相排斥，但从局部DNA片段来看，两种植物的部分结构却可能保持一定的亲合性。因而，当远缘DNA片段在母本DNA复制过程中有可能被重组，而使子代出现变异。这种参与杂交的DNA片段可能带有可亲合远缘物种的结构基因、调控基因、甚至是断裂的无意义的DNA片段。后两种DNA片段如果整合到母本基因组中，将同样可能影响母本基因表达而变异。根据这种看法，周光宇等曾提出常规远缘杂交中存在着DNA片段杂交的假设。并认为从分子水平来看，能取得成功的远缘杂交的大多数是DNA片段的杂交，即染色体水平以下的遗传分子的杂交。用3H标记的棉花大分子DNA进行了花粉管通道的验证。棉花自花受粉24小时后，将外源3H-DNA从顶部注入子房。从3H-DNA自显影，清楚地看到DNA经由珠孔进入开放的珠心到达胚囊。30分钟后即观察到胚囊中3H-DNA显影，2-4小时之间，80%以上的胚囊中均有外源DNA进入。在花粉管中没有找到3H-DNA，说明DNA不是进入花粉管后再进入胚囊，而是经过花粉管所经过的通道进入胚囊的（龚蓁蓁等，1988）。　　经过许多学者尝试后的结果，花粉管通道法实施的最佳时机集中在植物传粉受精后的一段时间，这是有其根据的。一方面，早期胚细胞不具有正常细胞壁，因此易于DNA转化；另一方面，受精后的细胞DNA复制活跃，易于DNA整合。早期的花粉管通道法所用的外源DNA是种间或属间带有目的基因的供体总DNA片段，以后有学者将以质粒为载体带有目的基因片段的重组DNA分子配以一定的浓度和纯度来转化受体的种质细胞，并得到目的性状得到表达的变异的后代（谢道昕等，1991）。在国外，直接运用同样方法最早见诸报导的是Hess，经过多年的努力，他利用花粉萌发时吸收种内或种间DNA技术，将外源DNA导入矮牵牛中，获得来自外源DNA的花色变异子代。运用Hess的技术。Dewet等1983年培育出玉米抗大小叶斑病品种。Ohta（1985）在美国科学院院报上报道合用玉米种间外源总DNA片段和玉米花粉混合受粉，在当代得到高频率的胚乳基因的转移。　　直接建立在这种方法之上并可视为对其进一步发展的方法是inplanta转化方法（Feldmann和Marks，1987）。到今天，运用inplanta转化方法在拟南芥（Arabidopsisthaliana）中利用T-DNA插入产生大规模突变群体已经得到十分成功的应用（Krysan等，1999；Speulman等，1999）。相对于前者，inplanta转化方法最大的创新之处是借助农杯菌Ti质粒这一天然转化系统而非裸露DNA来转化植物的种质系统。Feldmann（1987）首次报道成功运用这种方法将外源DNA片段转移到受体基因组中并可稳在T2和T3代稳定遗传。具体做法是将外源基因片段与卸甲载体整合在一起,拟南芥种子萌发期间，将农杆菌菌液与拟南芥种子浸泡在一起。Chang（1990）发展了另一种inplanta转化方法，拟南芥花期，将拟南芥花序从根部剪去，然后用农杆菌菌液感染创伤部位。Bethtold等（1993）尝试了另一种转化方法，同样是在拟南芥开花期将整个植株浸泡在一定浓度的农杆菌菌液中，采用真空渗透（Vacuuminfiltrafion）的方法达到转化目的。以后，Clough（1998）对这种方法作了修改，在农杆菌菌液中加入表面活性剂和蔗糖等有利于农杆菌转化的保湿性物质，即使不用真空渗透的方法，而直接将植物的地上部分浸到农杆菌菌液中也可达到同等转化频率。到今天，对拟南芥植物运用这种直接的转化方法，在选择最合适的转化时机、最佳的转化部位、最优化的转化条件等方面已经到达相当成熟的地步。