《技能训练库》综合技能实训指导书
实训项目名称
细菌菌落总数的测定
学时
6学时
实训目的
1.掌握细菌菌落总数测定的程序
2.学会国标法测定菌落总数的方法和技能
一、定义
菌落总数: 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。
二、设备和材料
恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、均质器、1 mL和10 mL无菌吸管或微量移液器及吸头、250 mL无菌锥形瓶、90 mm无菌培养皿、pH 计或精密pH 试纸。
三、培养基和试剂（制法见附录A）
平板计数琼脂培养基、 磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水。
四、操作步骤
（一）样品的稀释
1. 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内， 8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。
2. 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
3. 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的 无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。
4. 按3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。
5. 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
6. 及时将 15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃ ±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
（二） 培养
1．待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃ ±1 ℃培养48 h±2 h。水产品30 ℃ ±1 ℃培养72 h±3 h。
2．如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ），凝固后翻转平板，按1 条件进行培养。
（三） 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，
记录
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稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
1．选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的 平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
2．其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
3．当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
五、 结果与报告
(一)菌落总数的计算方法
1．若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL ）样品中菌落总数结果。
2．若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按
公式
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（1）计算：
N = ∑C/(n1 +0.1n2 )d ………………………………… （1）
式中：
N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
示例： 稀释度 1:100 （第一稀释度） 1:1000 （第二稀释度）
菌落数（CFU） 232，244 33，35
N＝∑C/(n1+0.1n2)d
＝232+244+33+35/[2+(0.1×2)]×10-2＝544/0.022＝24727
上述数据修约后，表示为25000或2.5×104 。
3．若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4．若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5．若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1乘以最低稀释倍数计算。
6．若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300 CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（二） 菌落总数的报告
1．菌落数小于 100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
2．菌落数大于或等于 100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用 10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
3．若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
4．若空白对照上有菌落生长，则此次
检测
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结果无效。
5．称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。
附录A
A.1 平板计数琼脂（plate count agar，PCA ）培养基
A.1.1 成分
胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL
A.1.2 制法
将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH7.0±0.2。分装试管或锥形瓶，121℃高压灭菌15min。
A.2 磷酸盐缓冲液
A.2.1 成分
磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g、蒸馏水500mL
A.2.2 制法
贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
A.3 无菌生理盐水
A.3.1 成分
氯化钠8.5g、蒸馏水1000mL
A.3.2 制法
称取8.5g 氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
浙公网安备 33021202002483