抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μlPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性＝[(Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml,1.6ml，加入PBS的体积)；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4)123ml和B母液(NaH2PO4)877ml混匀即为1000mlPBS(0.2M，pH6.0)；（2）反应混合液配制（以60个样为准）：取200mlPBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：取3ml反应液并加入30μl酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。2、过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4)457.5ml和B母液(NaH2PO4)292.5ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。（2）反应液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。四、超氧阴离子自由基（O2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）1、试剂的配制（1）1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；（2）17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；（3）7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。2、O2.-含量的测定（1）样品液提取方法同SOD测定；（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5mlPBS（0.05M，pH7.8），1ml1mM盐酸羟胺溶液后摇匀。（3）在25℃下保温1小时；（4）依次先加入1ml17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml7mMα-萘胺，混合后快速摇匀；（5）在25℃下保温20min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；（6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值（测定）；（7）O2.-含量的计算：由测得的OD530，查NO2- 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线得到[NO2-]；根据羟胺与O2.-的反应式：NH2OH＋2O2.-＋H+NO2-＋H2O2＋H2O计算[O2.-]，即[NO2-]×2=[O2.-]；再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得O2.-产生速率（以nmolmin-1mg-1蛋白表示，也可以nmolmin-1g-1鲜重表示）。O2.-产生速率=（C×V）/（t×W）（nmolmin-1g-1鲜重）C为标准曲线上查得的浓度(umol/L)；V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t为反应时间(60min)；W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)参考文献：王爱国，罗广华．植物生理学通讯，1990，（6）：55～57五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA：100g三氯乙酸→1L0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸→500ml10%TCA（避光）2、测定 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 :0.2样品+1.6ml10%TCA研磨→12000g离心10min→上清1.5ml+1.50.67%TBA→沸水煮30min→冷却，离心→上清OD450，OD532，OD6003、计算组织中MDA含量：MDA浓度C(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量(umol/gFW)=C×V/W式中V为提取液体积(1.6ml)，W为样品鲜重(0.2g)。六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；（3）再放入恒温水浴锅中在100℃沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；（4）用 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（%）=R1/R2×100%还可以计算植株伤害程度：伤害率=（处理电导率—对照电导率）/（煮沸电导率—对照电导率）×100%七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100mg考马斯亮蓝，溶于50ml90％乙醇中，加入100ml85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1Ｌ。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mgBSA加水溶解后定容至100ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100ml（也可取10mgBSA定容至100ml即为100μg/ml标准BSA溶液）。2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20μl提取液（酶液）加入80μl，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液（即稀释成0.1ml提取液），再加入2.9ml考马斯亮蓝溶液，反应2min后测OD595（以100μl缓冲液加2.9ml考马斯亮蓝为对照调零）。（2）蛋白质含量计算：可溶性蛋白质含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)C为标准曲线查得的蛋白质含量（μg）；VT为提取液总体积（稀释后的体积ml）；VS为测定时所用提取液体积（ml，20μl）；W为样品鲜重（g）。