微生物实验报告：测定细菌生长曲线

测定细菌生长曲线 一、实验目的 1.了解细菌生长曲线特征,测定细菌繁殖的代时; 2.学习液体培养基的配制以及接种方法; 3.反复练习无菌操作技术; 4.了解不同细菌,不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同; 5.掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法; 二、实验原理 将一定量的菌种接种在液体培养基内,在一定的条件下培养,可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性,如以细菌活菌数的对数做纵坐标,以培养时间做横坐标,可绘成一条曲线,称为生长曲线。单细胞微生物发酵具有4个阶段,即调整期(迟滞期)、对数期(生长旺盛期)、平衡期(稳定期)、死亡期(衰亡期)。生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的的全过程动态。不同微生物有不同的生长曲线,同一种微生物在不同的培养条件下,其生长曲线也不一样。因此,测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。 测定微生物生长曲线的方法很多,有血细胞计数法,平板菌落计数法,称重法和比浊法。本实验才用比浊法,由于细胞悬液的浓度与混浊度成正比,因此,可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度。将所测得的光密度值(OD600)与对应的培养时间做图,即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意,由于光密度表示的是培养液中的总菌数,包括活菌和死菌,因此所测生长曲线的衰亡期不明显。 从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间,即代时,以G表示,其计算公式为: G=(t2-t1)/[(lgW1-lgW2)/lg2] 式中t2和t1为所取对数期两点的时间,W1和W2分别为对应时间测得的细胞含量或OD。 三、实验器材 大肠杆菌,枯草杆菌菌液及平板; 培养基(100mL/250mL三角瓶×10瓶/大组):牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基; 取液器(5000ul, 1000ul 各一支),无菌1000ul吸头若干,无菌5000ul吸头若干,比色皿10个及共用参比杯一个,培养箱3台,722s分光光度计; 四、实验步骤 1.活化菌种 将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中,37℃振荡培养18h,另外准备单菌落平板各1块; 2.接种 6人大组分为3个小组,按表1接种。 表1.各培养基接入菌种及培养条件 3.培养并测量 每培养一小时取样一次:取500ul培养液到2000ul蒸馏水中,以蒸馏水为对照,测OD600,固定参比杯,不要调动波长旋钮;固定一台分光光度计; 零小时也要测。全班同时取样,同时开始振荡, 取样期间时间不算。 培养开始时,测0号瓶pH。实验结束后,测1-9号瓶pH。 五、结果 1.OD600 OD600记录结果见表2。 表2. 发酵过程OD600测量值。划线结果表示明显错误,作图时弃去;绿色表示用于计算代时。 对各组数据做生长曲线图,可得图1。 图1.生长曲线。a~i图分别绘出1~9号培养瓶的OD600-发酵时间曲线,每幅图上 方小标题表示该图的培养条件。g~i组2.7和3.3小时数据明显错误,未绘入图。 2.pH 对照组初始pH=7.0, 用实验室的两种试纸:6.4~8.0,4.0~5.0,各实验组均未测出准确pH值。看来pH都处在5.0~6.4之间,精确值未知。 3.代时计算 根据表1中的红色数字对应的时间及OD600,我们用公式: G=(t1-t2)/[(lgW1-lgW2)/lg2] 来计算各瓶的代时。计算结果见表2。 表2.各发酵条件下的代时 理论上,大肠杆菌代时为37min,枯草杆菌代时为25min,我们的计算结果还与之相去甚远。原因主要是培养条件不行,不是连续发酵,没有营养补充,而且细菌生长时经常被我们“打扰”,不能一直保持高速生长状态。而且我们都是用原始数据点进行计算的,可能会 有较大偏差。可以利用软件对生长曲线进行拟合,得到平滑的S型曲线再计算。可惜我没有相关软件,只好凑活用Excel。 六、讨论 从上面的实验结果可以看出,不同菌种、不同温度、不同转速条件下,发酵的生长曲线和代时有很大差异。下面我们分别对这些影响因素进行讨论。 1.温度 我们选取培养瓶1号和6号、7号和8号分别做对比,在同一张图内做生长曲线(图 图2.温度对于生长曲线的影响。上图菌种为大肠杆菌,下图菌种为枯草杆 菌。除温度外,其余条件均一样。 由图可以看出,大肠杆菌在37℃条件下调整期较短,迅速进入对数期。在30℃条件下,调整期、对数期均有明显增长,稳定期到来较晚,且维持在一个较高的水平上。 可以认为37℃更利于大肠杆菌的生长,30℃条件下细菌需要更长的时间来适应温度。 但是比较代时发现,37℃的代时要长于30℃,这与生长曲线数据矛盾,可能是OD600测量中的微小误差积累起来所致,下面将讨论。 而在枯草杆菌中,37℃的调整期较短,代时也短于30℃。说明37℃更利于枯草杆菌生长。 2.转速 我们选取培养瓶1号和5号、7号和9号分别做对比,在同一张图内做生长曲线(图 3)。 不同转速下枯草杆菌的生长曲线 图3.转速对于生长曲线的影响。上图菌种为大肠杆菌,下图菌种为枯草杆 菌。除转速外,其余条件均一样。 从图3看出,转速对于调整期和对数期没有太大影响,但是高转速带来的高溶氧可以显著缩短大肠杆菌的代时。大肠杆菌是兼性厌氧,在高溶氧条件下生长较快,在低溶氧条件下也可生长,只是速度较慢而已。对于枯草杆菌,从生长曲线、代时上看都没有显著改变。但是枯草杆菌是需氧菌,理论上讲应该高转速有利生长。可能是因为振荡作用不足以使溶氧增加到影响枯草杆菌生长的阙值,或是低转速已经足够提供其快速生长所需氧气。 3.细菌种类 我们选取培养瓶1号和7号、5号和9号、6号和8号分别做对比,在同一张图内 温度、转速表于每幅图上方。 由图4可以看出,在各个培养条件下,枯草杆菌的调整期均明显长于大肠杆菌,而对数期也要长于大肠杆菌,代时较短。说明大肠杆菌能够很快地适应发酵环境,快速生长,而枯草杆菌调整能力较弱,但生长能力较强。 图5.大肠杆菌不同菌种状态的生长曲线对比。 培养条件为37℃,200rpm。 从图5可以明显看出,固体菌种的调整期约为5个小时,远长于液体菌种(约为1个小时),可能原因是固体菌种需要一定时间来分散到培养基中,以免局部过浓发生种内竞争。但是可能是因为固体菌种里菌数较多,生长起来速度非常快,其代时很短,而且对数期较长,如果继续发酵的话可能会达到很高的稳定期平台。 图6.大肠杆菌不同菌种数量的生长曲线对比。 培养条件为37℃,200rpm。 从图6的3条曲线可以看出,不同接种量对生长曲线没有什么影响,而代时也没有显著改变。唯一的不同是基础OD600值有所差别,接种量越大,初始OD600值也越大。可是理论上讲接种量越大,生长会越快。至于为什么不符合理论,可能是因为菌种活性的问题,尽管接种量大但活性没有相应的成正比提高。 6.OD600测量 按照要求,各组要使用固定的分光光度计和比色杯,连参比杯也不能换,这是为了减小系统误差而采取的措施。这点我们做的很好,但是在分光光度计的使用上犯了错误。在表2中可以看出有一些数据明显不符合生长曲线,在测量时很有可能是没有对准光路,用光栅去挡了光,而我们还以为是已经开始生长,没有在意。所以就继续实验下去,没有重新校正、测量。直到后来发现数据又降下去重新开始增长才发现当时的错误,可惜没办法补救了,只好把那几组数据作废。 除了光路的影响,还有取样的影响。虽然培养瓶在摇床中不断振荡,成分混合的比较均匀,但在取出后到取样前的一段时间里(约2min)还是有可能沉降造成测量误差的。所以吸之前也要用无菌枪头吹打均匀,测之前再吹打一次。另外,分光光度计本身是有一定精度范围的,0.05以内的偏差可以接受。所以如果众多数据均在±0.05 范围内波动,可以认为是相同的。但是如果用于计算代时的数据一个取+0.05,一个取-0.05,算出来的代时就会有很大偏差了。这也解释了为什么代时计算结果和预期有不符合的地方。 7.取样时间 取样时间要尽量短,让细菌有一个稳定地生长环境,才能得到短代时、高产量的结果。我们的取样开始时间和结束时间记录见表4。 表4.各取样时间及中断培养时间记录 由表中数据可见,我们的间断培养时间多为8~10分钟,这相对于1小时的发酵时间来说占了不小比例。较长时间处在不太适合生长的低温(室温约25度)、低溶氧(无振荡)环境中,这对快速生长中的细菌的影响无异于高速行驶中的汽车猛踩刹车。 细菌需要一段时间来重新进入快速生长状态。这大大增长了代时。 因此我们要全班有序、配合,最好能在5分钟内取完样,使中断时间尽可能的短。 推荐在即将取样前点燃酒精灯,在比色皿中预加稀释用的2ml水,拿出样品后一起解开皮筋,逐一取样。之后立即封口,放回培养箱,再去测OD600。 8.无菌操作 尽量避免杂菌污染。虽说相对于培养瓶中大量的实验菌来说,杂菌势孤力单,竞争起来毫无优势,但是培养时间较长,多少都会影响实验菌的生长,而且会消耗一部分培养基。每次取样时都要在酒精灯火焰旁操作,同时注意不要烧到封口膜和移液器及枪头。一旦封口膜被烧,没有灭过菌的替代品,此瓶即报废。希望以后做实验时可以多准备3~5张灭菌封口膜备用,要不然因为封口膜被烧而报废一组数据,觉得非常可惜。 七、思考题 1.为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况? 细胞悬液的浓度与混浊度成正比,因此,可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度,从而在一定程度上反应细菌的相对生长状况。 2.生长曲线中为什么会有稳定期和衰退期? 平衡期:当细胞繁殖的速度达到最高峰时,期细胞总量就不会再增加,是因为调整期、对数期糖类营养物质的消耗,代谢产物的积累以及培养基中pH值、氧化还原电势的改变,对细胞产生了很大的抑制性。这时,细胞总数将处于稳定状态,死亡细胞数和繁殖细胞数处于平衡状态。 死亡期:平衡期后如果继续培养,细胞总数不再稳定,死亡细胞数将逐渐增加,死亡速度超过繁殖速度,使进入死亡期。 3.什么条件下接种为宜?液体种子比固体种子有什么优越性? 从实验结果可知,在细菌的最适温度、溶氧条件下,接种适当数量的对数期液态种子最好。 液体种子相比于固体种子,调整期短很多,可以快速进入对数期,工业生产周期短,设备利用效率高。 4.根据实验结果,谈谈在工业上如何缩短发酵时间? 接种处于对数期的液体种子,接种前充分活化,接种量应尽可能多;把培养条件调整到最适合发酵用菌的条件,如温度、溶氧、pH;连续发酵,不断补充培养基,分离代谢产物。另外,工业生产一定要注意无菌操作。工业设备体积庞大,灭菌非常麻烦而且成本高、影响生产,使用抗生素的话成本过高,不利于市场。 八、参考文献 1.陈金春,陈国强,微生物学实验指导,清华大学出版社,2005; 2.诸葛健,工业微生物实验与研究技术,科学出版社,2007; 3.百度百科,