单位及实验室名称
项 目
编号：
日期：
版本：
丙型肝炎病毒核酸HCV-RNA扩增荧光定量检测标准操作程序
1.目的：明确丙肝病毒核酸定量检测的操作
规程
煤矿测量规程下载煤矿测量规程下载配电网检修规程下载地籍调查规程pdf稳定性研究规程下载
，指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测。
2.适用范围：
2.1适用于进行丙肝病毒核酸定量检测的检验人员。
2.2适合仪器：LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪
2.3方法原理：采用PCR方法结合荧光探针的扩增技术
2.4样品要求：血清
3.
职责
岗位职责下载项目部各岗位职责下载项目部各岗位职责下载建筑公司岗位职责下载社工督导职责.docx
：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
4.试剂来源：深圳凯杰公司HCV RNA荧光PCR检测试剂盒。
5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒
6.标准操作：
6.1 试剂准备（在试剂准备区操作）
6.1.1将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻，完全融解后混匀。
6.1.2根据当次实验标本量，取出相应试剂（1管=28ul反应液+2ul Enzyme Mix）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为n (n=标本数+1管阴性对照+1管阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品)（定性检测无需做阳性参控品）， 取PCR反应管转移至样本制备区。
6.2.实验前准备步骤：
6.2.1所需试剂置室温平衡，裂解液和洗液1如出絮状沉淀，37℃温浴至沉淀完全消失。
6.2.2在洗液1中加入16ml无水乙醇，做好标记,室温保存,使用前摇匀。
6.2.3在洗液2中加入23ml无水乙醇，做好标记,室温保存,使用前摇匀。
6.2.4将310ul的洗脱液加入含有310ug的Carrier RNA中,充分混匀,分装,-20℃储存.不要反复冻融3次.
6.2.5裂解液工作液的制备
混合后2-8℃稳定保存48小时,裂解液工作液必须每次实验前新鲜配制
ASJYK-LAB-C-P-46 第2页，共4页
裂解液工作液制备
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
人份数
裂解液用量(ml)
Carrier RNA混合液用量(ul)
HCV内对照用量(ul)
人份数
裂解液用量(ml)
Carrier RNA混合液用量(ul)
HCV内对照用量(ul)
1
0.22
6.2
6.6
13
2.86
80.1
85.8
2
0.44
12.3
13.2
14
3.08
86.3
92.4
3
0.66
18.5
19.8
15
3.30
92.4
99
4
0.88
24.6
26.4
16
3.52
98.6
105.6
5
1.10
30.8
33
17
3.74
104.7
112.2
6
1.32
37.0
39.6
18
3.96
110.9
118.8
7
1.54
43.1
46.2
19
4.18
117.0
125.4
8
1.76
49.3
52.8
20
4.40
123.2
132
9
1.98
55.4
59.4
21
4.62
129.4
138.6
10
2.20
61.6
66
22
4.84
135.5
145.2
11
2.42
67.8
72.6
23
5.06
141.7
151.8
12
2.64
73.9
79.2
24
5.28
147.8
158.4
6.2.6将1.4ml蛋白酶溶解液加入蛋白酶冻干粉试剂瓶中,混匀至完全溶解,避免有泡沫,2-8℃保存.
6.3样本制备及加样（在标本制备区操作）
6.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管（n=样本数 ＋ 1管阴性对照+1管强阳性对照＋ 1管临界阳性对照），做好标记。
6.2.2分别加入25ul蛋白酶溶液.
6.2.3分别加入待测样本,阴性对照,强阳性对照,临界阳性对照各200ul
6.2.4加200ul新鲜配制的裂解液工作液盖上盖子,振荡15秒,混匀(不可把蛋白酶溶液加入到裂解液中 ).
6.2.5 56℃温浴15min,瞬时离心,去除盖上液滴.
6.2.6加入250ul无水乙醇,盖上盖子,振荡15s,室温静置5min. ,瞬时离心,去除盖上液滴.(室温超过25℃,无水乙醇要预冷.)
6.2.7将n个纯化柱放入收集管中,将6.2.7的液体移入到纯化柱中,盖上盖子,6000g离心1min,倒掉废液.
6.2.8打开纯化柱的盖子,加入500ul洗液1, 6000g离心1min,倒掉废液.
6.2.9打开纯化柱的盖子,加入500ul洗液2, 6000g离心1min,倒掉废液.
6.2.10打开纯化柱的盖子,加入500ul无水乙醇, 6000g离心1min,倒掉废液.将纯化柱放入新的收集管中.
6.2.11 20000g高速离心3min,除去乙醇.
ASJYK-LAB-C-P-46 第3页，共4页
6.2.12将纯化柱放入干净的1.5ml离心管中,开盖,56℃温浴3min,以除去残留液体.
6.2.13将纯化柱放入另一个干净1.5ml离心管中,加入60ul洗脱液(加到膜中央).盖上盖子,室温静置5min.20000g离心1min收集滤出液.4℃保存备用.应在2h内用于PCR扩增,或-70℃保存一个月
6.2.14取20ul的6.2.13的RNA溶液及定量标准品,加入PCR反应管中.
6.3 PCR扩增（在扩增区操作）
6.3.1打开稳压器电源，再打开计算机电源。
6.3.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。
6.3.3将循环条件设定为
循环条件设置：
50°C：30 分钟；95°C：15 分钟；
95°C：15 秒， 50°C：45秒, 72°C：15秒；荧光信号收集设在50°C。
45 个循环。反应体系为50 μ
6.3.4仪器检测通道选择
Roche LC480(96 well)：选择FAM检测通道；HBV内对照（IC）选择VIC检测通道。在50℃时荧光信号收集方式设为“SINGLE”。
6.3.5检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
6.3.6将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中设定好样孔位置。
6.3.7按仪器操作规程开始循环。
6.3.8扩增结束后取出PCR反应管，关闭扩增仪电源，反应管直接放入焚烧垃圾桶内。
6.3.9分析数据，在Analysis Notes窗口中注明检测基线值、试剂批号、阳参批号等相关信息，进行结果分析。
6.3.10关闭计算机。
6.4 结果判断：
6.4.1 1个阴性对照的值应0IU/ml，1个强阳性对照的值在5×105-1.0×107IU/ml，1个临界阳性对照的值在1×103-1.0×105IU/ml.
6.4.2 HCV阴性对照,临界阳性对照的内对照Ct≤33，否则视为无效。
6.4.3 4个阳性参控品的基因拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标，作标准曲线，标准曲线的拟合度R应大于等于0.98，否则应视为
ASJYK-LAB-C-P-46 第4页，共4页
实验无效。
定量结果分析：上述两项质控标准均满足时，可对样品进行定量分析。分析数据时，根据标准曲线自动计算未知标本的相应基因拷贝浓度。若发现有标本Ct值小于15，须将其剔除此次结果分析，该标本稀释后再测直至其Ct值大于15。
6.5
报告
软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载
6.5.1 定量结果判断
检测样本中HCV-RNA≥1×103IU/ml（copies/ml）且≤5×107IU/ml时，按实际检测结果报告；检测样本中HCV-RNA<1×103IU/ml（copies/ml）时，均报告“≤1×103IU/ml”。 检测样本中HCV-RNA>5×107IU/ml（copies/ml）时，均报告>5×107IU/ml”。
6.5.2报告的签发依据检测结果报告程序。
7.支持性文件：
7.1 《丙型肝炎病毒核酸扩增荧光检测试剂盒》说明书（深圳凯杰股份有限公司）
7.2 检测结果报告程序。
7.3 LightCycler480型核酸扩增荧光检测仪说明书
8.此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。
浙公网安备 33021202002483