双峰驼诱导排卵活性蛋白氨基酸组成的分析

双峰驼诱导排卵活性蛋白氨基酸组成的分析 双峰驼诱导排卵活性蛋白氨基酸组成的分 析 中国农业科学1997,30(4).— 83 — ~ 一 87 ScientiaAgriculturaSinica.一 双峰驼诱导排卵活性蛋白氨基酸 组成的分析 潘光陈志李冬刘湘涛赵启祖谢庆阁/一——— 业科学院兰州兽医研究所,兰州73?46) 中闸化所 <(中国科学院兰州化学物理研究所) 提要应用氨基酸自动分析仪测试了公驼精清及其活性组分剥试结果表明,诱导排卵组 分是一种生物活性蛋白质,它富含2O种氨基酸I特别是3斡碱性氨基酸(赖氨酸,精氨酸,组氨 醴)含量达18.1,明显高于其他活性组分为测定读活性组分的蛋白质序列,应用数理统计方 涪计算了该组分多肽分子中的氨基酸残基数以及它的部分氨基酸序列. 关蕾词双峰诱导摊卵因子}活性蛋白I氨基酸组成 60年代陈北亨等在研究双峰驼繁殖生理中发现,母驼是诱导排卵型动物,但机械刺激 不能诱发母驼排卵,而人工输精似乎引起了排卵以后的研究证明,双峰驼确是精液诱导 排卵型动物,公驼精清或精液只要进入母驼生殖道,便能诱发排卵,由此推测出公驼精清内 存在诱导母驼排卵的活性物质.将公驼精清给发情母驼肌肉注射后4b,母驼外周血浆可 出现LH排卵峰值,与自然交配后母驼的内分泌学变化一致;但用胰酶处理后的精清,则诱 导排卵活性消失,由此认为公驼精清内的诱导排卵因子可能是一种蛋白质.近期用分子排 阻液相色谱法校正了公驼精清内活性蛋白组分的分子量是1.9×104道尔顿(D),现已用生 物化学方法提纯,并保存了它的生物学活性",.为确定公驼精清内诱导排卵活性蛋白的氨 基酸序列,笔者首次测试了精清内几个活性蛋白组分的氨基酸成分并加以分析. 1材料与方法 1.1材料 ,由甘肃省民勤县养驼户提供.采用牛假阴道人工采取公驼精液.成年继康公驼3峰 手 摇离心机沉淀,在当地自然环境冻存21d,装冰瓶送回实验室,在10"C,2500r/rain离心 0.5h,取上清镜检无精子,于一2O?冰箱冻存备用. 公驼精清经活化的DEAE一纤维素柱(1cm×50cm),依次用0.01,0.03,0.06,0.09, 0.12,0.3mol/LPBS(pH6.8)洗脱,在A280nm处分部收集,脱盐,真空冻干,后回归本动物 确定,共3个活性组分0. 日立835—5O高速氨基酸分析仪和数据处理器,记录仪;水合茚三酮(德国产910801), 收蒋日期1996—05—20 *国家自然科学基金资助项目. 中国农业科学3O卷 辛酸(日本和光纯药株式会社,03O一06350),硫二甘醇和柠檬酸二钠等(国产分析纯). 1.2方法 (1)用氨基酸自动分析仪测试",固定相为磺酸型强酸阳离子交换树脂,流动相为柠檬 酸盐缓冲液,柱内径2.6ram,茚三酮试液流速18ml/h,工作时间72min,每次进样0.5ml. (2)大分子量蛋白质分子中所含各种氨基酸的分子数的计算.算出被测各氨基酸成分重 量加和值(ENGRAM),代入如下公式内计算:分子量+(分子量?l10—1)×18得出经验 值,两式相除的商便为实际上分析柱测量该因子的摩尔数,从而可求出该组分的残基数. 小分子量蛋白质分子中含各种氨基酸的分子数的计算,可先求出测量值的当量值,从其 中找出数值最小的一个为基数,并与其它比较所得的商值即为残基数.2结果与分析 公驼精清及3个活性组分经氨基酸自动分析仪测出的各种氨基酸含量见表1. 表1公驼精清爰其3个活性组分氯基酸含量(出峰顺序,mg/rn1) Table1Anal~isotaminoacidscomponentsoftheseminalplasmaandthreebiologicalactivetr actionsin theBactriancamel(Peaksappearinginorder) 下同The?ea3below 根据测试结果,笔者试对公驼精清及3个活性组分的氨基酸含量,残基数及可能存在的 活性序列进行了计算或估计. 2.1公驼精清及3个活性组分的氨基酸含量 公驼精清内的氨基酸总含量的76.06mg/ml,3个活性组分L,L咕,L3的氨基酸含量 依 次为10.74mg/ml,l_575mg/ml,1.986mg/m1.精清与L中含量最高的氨基酸为天门冬氨 4期潘光武等:双峰驼诱导排卵活性蛋白氨基酸组成的分析 酸,最低者为蛋氨酸,这与一些生物体液及其他分泌物测得的基础值相近.诱导排卵的活性 组分L与无诱导作用的活性组分相比较发现含量最高的是谷氨酸,最低者是蛋氨酸,但 Lz组分中3种碱性氨基酸(组氨酸,赖氨酸,精氨酸)占全量的百分比为18.1,而组分 中3种氨基酸的含量仅占14.2,两者相差3.9.对于8种非极性氨基酸,4种极性氨基 酸,带电侧链极性氨基酸及氨的含量百分比,k与L:很接近,说明L2与L岫之间的氨基酸含 量差别主要是3种碱性氨基酸,与文献5报道一致. 2.2诱导排卵组分的氨基酸残基数(计算见表2) 表2诱导排卵因子蛋白组分暮基酸残基数(个/分子) Table2Residuesnumberoftheovulatinn-inducingfactorinthebiologicalactiveproteinfract ions(No. of amifroacid/molecule) 方法AspThrSetG1uGlyAlaVaIMet?eLeuTyrPheLysHisArgProCys 方法115141416168l01810271058153 Formula1 方法212111113137816826856113 Formula2? "方法1:计算值为162十氨基酸,分子量19442D方法2,计算值为131氨基酸,分子量为15720D Re~idueanumberestimatedbyf0rI?l11a1&re162aminoacidsresidueswhicha19442Dinmolecularweight. Residuesnumbere~timatedby/ormule2are131aminoacidsresidueswhichare15720Dinm olecularweight 2.3公驼糟清诱导因子活性组分氯基酸序列 生物活性蛋白质中氨基酸顺序的预测,尚无可供参考的方法.因此笔者试以氨基酸测定 中的出峰顺序为横坐标,以氨基酸含量为纵坐标,按适当比例缩可比曲线(图),作直观分 析,并未找到可循的规律与变化.如将横坐标的顺序按可诱导母驼排卵的生殖激素中的促黄 体素释放激素(LHRH)位序和伲黄体素(LH)部分序列加以排列,再绘制含量曲线(图),加 以比较则可看出,能够诱导母驼排卵的L2组分,从脯氨酸到甘氨酸之间的4个位序表现为 曲线平滑,其斜率基本向零趋近,与另外两个组分的曲线明显不同.脯氨酸,精氨酸,甘氨酸 以及精氨酸间位序排列是否与生物活性有关,有待测定该因子的多肽序列后加以证实. 3讨论 3.1氨基酸组成的测试是蛋白质化学的重要内容,也是测定多肽序列前的重要组成部分. 本次试验使用的日立一835—50_高速氨基酸分析仪是以离子交换色谱法为基础研制的自动分 析仪,因此渊出的数据基本是可靠的.但也因仪器原件老化,外界电信号的干扰,电压变化以 及试剂不纯,树脂内可能有污染等原因,使每次测得的数据总有些变异,然而对双峰驼诱导 排卵因子活性组分的测试结果证明,该活性因子是一种蛋白质. 3.2本文用2种方法计算了双峰驼诱导排卵因子活性组分,其多肽分子中所含各种氨基酸 的分子数即残基数有差别,从计算结果可以看出,两种方法有31个氨基酸残基之 差.由于该 D,而大分子量的蛋白质中的各种氨基酸分布往往很不均匀,因子分子量近19k加之样品有 限,未测色氨酸的含量,因此计算值与实际值误差可能会超过15(允许误差1O%以内),但 对研究该因子的结构仍有一定意义. 4期潘光武等:双峰驼诱导排卵活性蛋白氨基酸组成的分析87 分子量又很大,则可以考虑该因子是否还有可能包含其他功能的活性位序资料证明,生长 激素释放抑制素(SRIF)是含1个二硫键的单链14肽(SRIF一14)Guileman等用化学法合 成的SRIF一28则比SRIF一14活性高出1O倍H0bert等从安康鱼胰腺内分离出可转译SRIF 前体的mRNA,反转录为eDNA并测出SRIF前体的核酸序列及蛋白质序列,发现SRIF蛋 白序列的活性中心位于羧端第7,9位序间的苯丙氨酸和苏氨酸.SRIP的蛋白质分子量为 14kD,而其他多肽区段蕴藏并含有其他生物活性成分,且与研究ACTH和脑啡肽揭示的前 体分子POMC相一致双峰驼诱导排卵因子的研究中,我们认为有类似现象,故深入研究其 序列结构,将会揭示双蜂驼生殖生理方面更多的内涵与奥秘 参考文献 1陈北亨,等.骆驼的簧殖生理(I)骆驼的性活动.畜牧兽医.198O,n(2):65,75 2潘光武,等.取峰驼诱导捧卵因素的探讨.甘肃农业大学研究生论文集.1988:5,7 3潘光武,等.取峰驼糟清蛋白圈谱及其分子量的测定.中国兽医科技.1994,24 【7)t9,l2 4荆湘涛,等.取峰驼诱导排卵因子活性肚的分离.中国兽医科技.1995.,25(5),7,9 5幡光武,等.取峰驼诱导排卵因子的生物学活性测定.中国兽医科 技.1995,25(11)t23,26 6周正宇,等阿拉善荒摸草地类韧缎营养类型的研究.兰州:甘肃科技出版 杜,I989=55~62 7.PanGuangwu,eta1.Ovulatloninducingeffectofseminalp1a3mintheBae~iancame1.Proc.oI1stlot.Came1. Conf.1992t159,151. 8ManjunathPGonadalproteinandpept~lesandtheirbiologicalsigniIEeance.eds.Sdr‰ andAtkinsen.L?E. worldsci.40,51 9ChohHL.eta1.Gonadotrop]n— releasinpeptidefromhumanlollicularfluid:isolationeharactri~tionandchemical synthesis.proe.Nat1.Acad.Se1.U.s_A.1987,(85):960,972 AnalysisofAminoAcidOomponentsoftheOvulation— inducingBioactiveProteininSeminal PlasmaoftheBactrianCamel PanGuangwuChenZhitianLiDongLiuXiangtaoZhaoQizuXieQJngge (上zh棚,一RsearchInstitute,CAAS,Lan.zho~zsoo~6) LingFengxiangFanLimin (m^?InstituteofChemicalPhysics.CAS) AbstractTheseminalplasmaofthemaleBactrianCamel(SPBC)andbioactivefrac— tionsinSPBCwereassayedbyModel—HITAcHI835-50HighSpeedAminoAcidAnalyz— er.ResultsofanalysisconfirmedthattheOvulation—inducingfractioninSPBCisakindof biologicalactiveproteinwhichcontainstwentykindsofcommonaminoacids,especially theconcentrations18.iofthreealkalineaminoacids(Lys,Arg,His)aremuchhigher thanotherbioactivefractions.Forproteinsequencingofthebioactivefraction,aminoacid residuenumberandportialproteinsequencewerecalculatedbystatisties. KeywordsAminoacidanalysis'Ovulation—inducingfactor;Bioaetiveprotein;Bac— triancame1