利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子慢病毒载体

利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子慢病毒载体 利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α 基因启动子慢病毒载体 中国组织 工程研 究 第 16 卷 第 27 期 2012?07?01 出 版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research July 1, 2012 Vol.16, No.27 ? 利 用多 位点Gateway技 术构建 小鼠 平 滑肌 肌动 蛋 白α基因 启动 子 慢病 毒 载体* 1 2 2 3 1 袁晓峰 ,项 鹏 ,李伟 强 ,胡晓俊 ,彭朝 权 Construction of lentivector containing alpha-smooth muscle actin promoter by multisite Gateway technology 1 2 2 3 1 Yuan Xiao-feng , Xiang Peng , Li Wei-qiang , Hu Xiao-jun , Peng Chao-quan 文章亮点: 1 Department of 利用多位点 Gateway 技术构建慢病毒载体 pLVpuro/α-SMA-hrGFP , 由启动 子 平滑肌肌 动蛋 白 α 控制绿色荧 光蛋白 Cardiology, 3 基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 。实验 认为,利 用平滑 肌肌动蛋白 α 基 因启动子 携带的 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因 载体从 胚胎干细 胞诱导 分化后筛 选得到 的 Department of Radiology, Third 细胞具有 细胞来 源方便, 细胞数 量充足, 周期短 等特点。 这也为 体外研究 血管病 变发生、 发展过 程提供了 重要的 实 Affiliated Hospital of 验手段。 Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Abstract Guangdong Province,2 China; Center for BACKGROUND: Alpha-smooth muscle actin gene is one of several genes expressed in smooth muscle cells and has Stem Cell Biology and Tissue been recognized as the marker for smooth muscle cell phenotype transformationEngineering, Sun Yat-sen University, OBJECTIVE: To construct a recombinant pLVpuro/αSMA-hrGFP lentiviral vector by multisite Gateway technologyGuangzhou 510080, Guangdong Province, METHODS: Primers containing attB sites were designed and used to amplify the alpha-smooth muscle actin αSMA China promoter fragment by PCR from the plasmid containing the mouse αSMA promoter sequence SMP8-Cre. By the BP recombination reaction, the attB flanked PCR product containing αSMA promoter sequence was cloned to an Yuan Xiao-feng ?, Studying for master’s attP-containing pDONR P4P1r donor vector to create an entry clone, pUp-αSMA. Finally, pUp-αSMA and pDown-hrGFP degree, Resident were shuttled into the destination vector pDEST-puromycin by LR recombination reaction to generate physician, Department of pLVpuro/αSMA-hrGFP. The expression vector was confirmed by PCR and gene sequencing. Then this expression vector Cardiology, Third was transferred into the C2C12 cell line, and the gene expression was confirmed by immunofluorescent stainingAffiliated Hospital of Sun Yat-sen RESULTS AND CONCLUSION: The pLVpuro/αSMA-hrGFP expression vector was successfully constructed with the University, right αSMA promoter fragment confirmed by sequencing. The activity of αSMA promoter was verified by cell transfection Guangzhou 510630, Guangdong Province, and immunofluorescent staining. The recombinant pLVpuro/αSMA-hrGFP lentivector was successfully constructed. And Chinait offers an important tool to monitor the differentiation process from embryonic stem cells to vascular smooth muscle cells, yuanxf1983@ and for cell tracing and gene function studies. 163Corresponding Yuan XF, Xiang P, Li WQ, Hu XJ, Peng CQ. Construction of lentivector containing alpha-smooth muscle actin promoter author: Peng Chao-quan, M.D., by multisite Gateway technology.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;1627: 5087-5091 Professor, Master’s ////0>. ////. supervisor,Department of Cardiology, Third Affiliated Hospital of 摘要 Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, 背景:平 滑肌肌 动蛋白 α 基因 是 相对局限 于在血 管平滑肌 细胞中 表达的少 数几个 基因之一 ,公认 是血管平 滑肌 细 胞 Guangdong Province, 表型转化 的标志 。 Chinapengcq123456@163. 目的:利用多位 点 Gateway 技 术构建慢 病毒载 体 pLVpuro/ 平 滑肌肌 动 蛋白 α 控制绿色 荧光蛋 白基因的 表达。 com 方法: 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 合 成 含有 attB 位点 的小鼠平 滑肌肌 动蛋白 α 基因启 动子引物 , 构建 pUp- 平滑肌 肌 动蛋白 α;通过 LR 反 Supported by: The Science and 应将 pUp- 平滑肌 肌 动蛋 白 α 和 pDown- 绿色荧光 蛋白 含 att 位点的绿 色 荧光蛋 白入门 克隆 连接 到目 的载体 Technology pDEST-puromycin,得到 pLVpuro/ 平滑肌肌 动 蛋白 α-绿色 荧 光蛋白表 达载体 ; 经 PCR 和测序鉴定 , 将载体质粒 瞬 Development Program of 时转染 C2C12 细胞系, 并且用 免疫荧光 染色检 测基因的 表达。 Guangdong Province, No结果与结 论: 成 功构建 pLVpuro/ 平滑肌肌动 蛋 白 α-绿色荧 光 蛋白报告 基因载 体, 测序结 果表 明启动子 序列正 确; 细 2011B031800125* 胞转染实 验以及 免疫荧光 检测证 实构建的 报告基 因载体可 以反映 平滑肌肌 动蛋 白 α 基因的表达 情况。 doi:10.3969/j.issn 2095-4344.2012.27028 关键词: 平滑肌 肌动蛋白 α;多位点 Gateway 技术;慢 病毒; 绿色荧光 蛋白; 干细胞Received: 2012-02-21 Accepted: 2012-04-29 袁晓峰, 项 鹏, 李伟强, 胡 晓俊 , 彭朝权. 利用 多位点 Gateway 技术构建小鼠 平滑肌肌 动蛋 白 α 基因启动子 慢病毒载体[J]. 中国组 织工程研 究,2012,1627:5087-5091 ////. ////. ISSN 2095-4344 CN 21-1581/RCODEN: ZLKHAH 5087 万方数据 //. 袁晓峰, 等. 利用 多位点 Gateway 技 术构建小 鼠平滑 肌 肌动蛋白 α 基因 启 动子慢病 毒载体 中山大学附属第 1 司;胎牛血清, 购于Hyclone 公司;引物合 成及 三医院,心内科, 3 放射科,广东省 0 引言 测序,购于上海英骏生物技术公司;小鼠抗 平 广州市 510630; 2 中山大学干细胞 滑肌肌动 蛋白α 单克 隆抗体 ,美国Sigma 公司。 与组织工程研究 中心,广东省广州 组织工程的发展为临床解决组织移植物短 方法: 市 510080 袁晓峰?,男, 缺问题提 供了 很好的方 法。20 世纪80 年 代已在 克隆 基因 两 侧引入 attB 重组位点 : 根据 1980 年生,安徽 [1-2] 省淮南市人,汉 体外成 功构建了组织工程化血管 ,而90年代 Gateway 克 隆技术的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 设计attB 序 列 引物, 族,中山大学附属 第三医院在读硕 末应用成熟平滑肌细胞构建组织工程血管并修 用于扩增带 有attB 序列 接头的全长 平 滑肌肌动 士,医师,主要从 [3] 事干细胞心血管 复血管缺损已获成功 。血管 毛细血管除外 的 蛋白α 基因启 动子。 分化和转基因研 究。 主要 细 胞成 分 包括维持管壁张力和弹性的平滑 引物设计: yuanxf1983@ 163 肌细胞以及维持管内血流通畅的血管内皮细 attB1-α-SMA-F: 5’-GGG GAC AAC TTT GTA TAG[1] 通讯作者:彭朝 胞 。 对于组织工程血 管, 首要应解 决种 子细胞 AAA AGT TGA GCC GTG GGA GCG TGA GT-3’ 权,博士,教授, attB2-α-SMA-R: 5’-GGG GAC TGC TTT TTT GTA硕士生导师,中山 来 源及 数量。胚 胎干 细胞以无 限增 殖能力和 全 大学附属第三医 CAA ACT TGA GAC AGC GAG CGA GAA GC-3’ 院心内科,广东省能 性等 优点,成 为组 织工程种 子细 胞的重要 潜 广州市 510630 pengcq123456@ [5] 在来源 。平 滑肌肌 动蛋 白α 是细 胞内6 种肌动 以含有测序正确 的 平滑肌肌动蛋白α基因启 163 蛋 白亚 类之一, 在所 有真核细 胞中 的表达都 高 动 子的质 粒为模 板,采 用LA Taq DNA聚合 酶, 中图分类号:R394.2 文献标识码:B [6] 度保守 。 平滑肌肌动 蛋白α 基因 是相对 局限于 利用attB- 平滑 肌 肌 动蛋白α 上下 游引物 进行 文章编号:2095-4344 201227-05087-05在血管平滑 肌细胞中表 达的少数几 个基因之 PCR 反 应, 在 平滑肌肌 动蛋 白α 基 因启动 子的上 收稿日期: 2012-02-21 [7] 修回日期: 2012-04-29 一, 公认是 血 管平滑肌 细胞 表型转化 的标 志 。 下游加入一 部分的attB 序列,反应条 件如下: 20120221017/D?S 因 此,本 实验通 过多位 点Gateway 技术构 建了 94 ?预变性2 min ;94 ? 变性15 s ,60 ? 退火携带小鼠 平 滑肌肌动蛋 白α 基因启动子和报告 30 s ,68 ? 延伸3 min,共30 个 循环;68 ?延 基 因的 慢病毒载 体, 可以为干 细胞 向血管平 滑 伸7 min ,4 ? 终止反 应。PCR 反 应结束 后用琼 肌 细胞 分化的监 控、 平滑肌细 胞的 富集、体 内 脂糖凝胶电泳检测反应产 物,然后纯化回收溶 外示踪和 平滑 肌肌动蛋 白α 基因功能的研究提 于TE 中。 供了很好 的研 究工具。 BP 反应: BP 反 应体系 中包 括 PCR 产物 50~100 ng 、pDONR P4P1r 载体2 μL、5×BP TM TM 1 材料和方法 Clonase 反 应缓冲液4 μL 、BP Clonase 酶 混合物4 μL ,补充TE缓冲液pH 8.0 至20 μL 。 设计:细 病毒 载体构建 实验 。 反应体系 置25 ? 温育16 h 后加入2 μL蛋白酶K 时间及地点: 于2010-08/2011-12 在 中山 溶液,37 ?温育10 min以终止BP反应。 大学干细 胞中 心完成。 BP 反 应产 物的 转化及 阳性 克 隆的鉴 定: 将BP 材料: 小鼠C2C12 细胞系和含有 平滑 肌肌 反应产物 转化 大肠杆菌 菌株Stbl3 , 挑取 克隆摇 动 蛋白α 基因启 动子的质粒SMP8-Cre 广 州医 菌然 后提取质粒。 用M13 正反向 引物进行测 序 [8] 学院徐军教 授惠赠 , 为本实验室保 存,其他 PCR 反 应, 纯 化反应产 物, 测定核苷 酸序 列, 以 各种试剂 均为 国产分析 纯产 品。 进一步确 定阳 性克隆。 主要试剂及仪器:入门载体pDONR P4P1r 、 LR 反应:LR 反 应 的目 的在于 将 已经 重组进 目的载体pDEST-puromycin 、BP clonaseTM 、 入门载体的 启动子和报 告基因pUp- 平滑肌肌 TM LR clonase 、脂质体 转染 试剂Lipofectamine 动 蛋 白 α 和 pDown-hrGFP 再 克 隆 到 表 达 TM 2000 和OPTI-MEM ,购 于美国Invitrogen 公 pDEST-puromycin , 以产 生表达克 隆。LR反应 司;PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、质 体系中包括 入门克隆100~300 ng 、pDEST- TM 粒 小量 提取试剂 盒及 无内毒素 质粒 小量提取 试 puromycin载体75 ng 、5×LR Clonase 反应 缓 TM 剂盒,购于Qiangen 公司;PCR 试剂以及高保 冲 液4 μL 、LR Clonase 酶混合物4 μL,补充 真LA TaqDNA 聚合酶, 购 于日本TaKaRa公司; TE缓冲液pH 8.0 至20 μL。反应体 系 置25 ? 大肠杆菌Stbl3 感受态细胞 ,购于北京 天根公 温育16 h 后 加入2 μL蛋白酶K溶液,37 ?温育 P.O. Box 1200, Shenyang//. 5088 万方数据 //. 袁晓峰, 等. 利用 多位点 Gateway 技 术构建小 鼠平滑 肌 肌动蛋白 α基因 启 动子慢病 毒载体 TM 10 min以终止LR反应。 2.2 BP反应构建启动子入门克隆 BP clonase 酶可 LR 反应产物的转化及阳性克 隆的鉴定: 将LR 反应产物 以在含有attB位 点的PCR产物和pDONR P4P1r载体的特 转化大肠杆 菌菌株Stbl3 ,提取质粒 。对重组质 粒进行 定 位点同时 发生 切割作用 ,将pDONR P4P1r 载体上的 PCR 和 酶切和 测序鉴定 ,以 确定阳性 克隆 。 ccdB位点切下,替换成平滑肌肌动蛋白α基因的启动子片 细胞培养:C2C12 小鼠 肌 卫星细胞 细 胞是由C3H 小 段, 构建含有卡那霉素抗性位点的入门克隆。 将BP反应产 鼠骨骼肌 卫星 细胞永生 化而 来的细胞 株, 细胞形态 和特 物转化大肠杆菌菌株Stbl3后,用卡那霉素进行初步筛选。 [9] 性均一, 可 无 限传代培 养 。 C2C12 细胞 用体积分 数10% 长出克隆后提取质粒, 先用PCR方法鉴定可见插入片段的 胎 牛血 清的DMEM 培养 液培 养, 在37 ? 、饱 和湿 度及 大小正确,结果如图2。并且pDONR P4P1r载体上含有 体积 分数5%CO 的细 胞养 箱内 传代 培养 ,实 验时 取对 M13测序引物结合位点, 所 以可以使用M13正反向测序引 2 数生长期 细胞 。 物完成测序PCR反应。测序结果表明,平滑肌肌动蛋白α 平滑肌肌动蛋白α-hrGFP 表达克隆的鉴定:瞬时细胞转 基因启动子已经被重组到pDONR P4P1r载体中。 染所用质 粒用 无内毒素 质粒 提取试剂 盒提 取。 转染 程序 1 2 3 45 TM 参照Lipofectamine 2000 说明书。转染 前1 d ,将 5 3.7 kb 3 kb C2C12 细 胞以5×10 / 孔 的密度接种 于6 孔板内。 每孔 TM 4 μg质粒,10 μL Lipofectamine 2000 转染细 胞, 同 1: DNA marker; 2-5: PCR product of entry clone 时 设未转染 对照 组。4~6 h 后 更换含胎 牛血 清的DMEM Figure 2 Agarose electrophoresis of PCR product of entry clone 培养基继 续培 养。图2 入门克 隆 pUp-α-SMA 的凝 胶电泳图 主要观察 指标 : ?通过 电泳 结果和测 序结 果判断平 滑肌肌动蛋白α 基因启动子慢病毒载体是否构建成功。 2.3 LR反应构建表达克隆 LR 克隆 酶可以在入 门克 ?通过C2C12 细胞后荧 光显 微镜观察, 判 断平滑肌 肌动 隆和 表达载体pDEST-puromycin 的特定位 点同时发 生 蛋白α 基因启 动子慢病 毒载 体是否能够表达。 切割作用,将入门克隆上的 平滑肌肌动蛋白α 基因启动 子,以及绿 色荧光蛋白 基因片段和 表达载体pDEST- 2 结果 puromycin 的ccdB 基因切下,同时发生置换,将平滑肌 肌动 蛋白α 基因启 动子 以及 绿色 荧光 蛋白 基因 片段 转移 2.1 平滑肌肌动蛋白α基因的PCR扩增和克隆基因两 到表达载体pDEST-puromycin 上, 这样就 构建 了含 有嘌 侧引入attB重组位点 GatewayTM 克隆技术 要求在克 呤 霉素选 择标 记以及 平滑 肌肌动 蛋白α 启动 子调控 的 隆基因的上下游两端加入特定的attB序列接头,这样才 pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-hrGFP报告 基因 载体, 将 获得 能保证含有attB 接头的 平滑肌肌动蛋 白α 启动子的PCR 的 表达载体 转化Stbl3,对 转化 子进行PCR检 测,电 泳结 产物克隆到含 有attP 的pDONR P4P1r 载 体上以 产生入 果,见图3,菌液扩增出与目的片段大小相一致的特异条 门克隆。利用 设计PCR 引物,以含有 平 滑肌肌动蛋白α 带,证明平滑肌肌动蛋白α基因启动子 以及绿色荧光 蛋白 基因启动 子的 质粒DNA为模板, 得到3 700 bp 左右的 含 片 段已经 成功连 接到表 达载体pDEST-puromycin中。 有attB 序列的 平滑肌肌动蛋白α 基因启动 子PCR 产 物,αSMA αSMA+hrGFP hrGFP 见图1 ,与GenBank 中报道 的长度一致,且PCR 产物量 1 2 3 41 满足回收 纯化 要求。1 2 3 45 1: DNA marker; 2: PCR product of alpha-smooth muscle actin αSMAgen e promoter in expression clone 3.7 kb; 3: PCR product of αSMA 3.7 kb 3 kb gene promoter and hrGFP gene in expression clone 4.4 kb; 4: PCR product of hrGFP gene in expression clone 0.7 kb 1: DNA marker; 2-5: PCR product of αSMA promoter flanked with attB Figure 3 Agarose electrophoresis of PCR product of sequence expression clone 图 3 表达克隆 的凝胶电 泳图 Figure 1 Agarose electrophoresis of PCR product of alpha-smooth muscle actin α SMA promoter flanked with attB sequence 图1 含有 B 序列的 α-SMA 基因 启动子 PCR 产 物 的凝胶电2.4 pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-hrGFP表达载体的测试泳图转染C2C12细胞后72 h 后在荧光显微镜下能观察细胞表 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/RCODEN: ZLKHAH 5089 万方数据 //. 袁晓峰, 等. 利用 多位点 Gateway 技 术构建小 鼠平滑 肌 肌动蛋白 α 基因 启 动子慢病 毒载体 达绿色荧光, 见图4, 并且可以观察到绿色荧光与用 平滑 肌肌动蛋白α单克隆抗体标记的红色荧光能重合, 见图5 , 3 讨论 显示 平滑肌肌动蛋白α 基因启动子携带的绿色荧光蛋白可以正常表达,而未转染载体质粒的对照组则没有观察 目 前体 外用酶 消化 法或者 组织 块贴壁 法从 血管 平 到绿色荧光的表达。 将pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-hrGFP 滑肌 组织内获得 原代细胞的 成功率不高 ,并且所需的 [10-11] 表达载体质粒 转不表达 平滑 肌肌动蛋白α 的人293FT 细 细 胞周期较长 。胚胎 干细胞是一 种能够在体 外长 胞 后,并未观 察到绿色荧 光的表达。 证实了构建 的 期增 殖并具有多 向分化潜能 的细胞,国 内外对胚胎干 pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-hrGFP表达载体的特异性。 细胞 的研究已经 成为热点, 有可能为新 的细胞替代疗 [12-13] 法提供无限的细胞来源 。实验构建携带平滑 肌特 异启 动子和报告 基因的载体 并导入胚胎 干细胞后,将 有利 于特异性地 对胚胎干细 胞向血管平 滑肌细胞分化 这一 过程监控, 以及为血管 组织 工程提 供高纯度的血 管平 滑肌细胞提 供实验基础 。血管平滑 肌细胞也是构 成血 管壁的主要 成分,通过 研究胚胎干 细胞来源的人 血管 平滑肌细胞 的生物学特 点和发育 机 制,可以为探 a: At 72 h after infected with b: At 72 h after infected with讨血 管病变的发 病机制和防 治方法提供 了一个稳定的 pLVpuro/α-SMA-hrGFP, cells with pLVpuro/α-SMA-hrGFP, C2C12 green fluorescence could be cells with green fluorescence实验 平台。因此 ,本实验利 用多位点Gateway 技术构 seen under fluorescence could be seen under microscope fluorescent/phase contrast建慢病毒载体pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-hrGFP,由启 microscope arrows动子 平滑肌肌动蛋白α控制绿色荧光蛋白基因的表达。 Figure 4 Phase contrast and fluorescence microscope observation of C2C12 cells transfected with慢病毒载体是一种高效的干细胞转染工具, 以HIV-1 为 recombinant plasmid pLVpuro/α-SMA-hrGFP ×400 图4 重组质 粒 pLVpuro/α-SMA-hrGFP 转 染 C2C12 细胞后 相 基础 构建的慢病 毒载体具有 容纳外源性 目的基因的片 差显微镜 和荧光 显微镜观 察×400段大, 可感染非分裂期细胞, 可在体内长期稳定整合, [14-15] 较 少发生基因沉默现象等诸多优点 。 Gateway技术 是基于λ噬菌体位点特异重组系统,可简单的概括为由 [16-18] BP 和LR 两个 反应 构成 。BP 反应是 利用一个attB DNA 片段或 表达克隆和一个attP 供体载体之间的重组 反应,产生 一个入门克 隆和带有ccdB 致死基因的副产 品。LR 反 应是 一个attL 入门 克隆 和一 个attR 目的 载体之 间的重组 反应 , 最后 产生带 有ccdB致死基因的副 产品和 a: Expression of alpha-smooth b: After infected with mu scle actin αSMA; arrow in the pLVpuro/α-SMA-hrGFP, green 需要的含 有目 的基因的 表达 载体。Gateway 技术不再 需 cytoplasm was identified by fluorescence could be seen要使用限 制性 内切酶和 连接 酶, 可克 隆一 个或多个 基因 immunofluorescence staining red under fluorescent microscope 进入到Gateway 改造过的 各 种表达载 体, 当基因在 目的 表达载体 之间 快速简便 的穿 梭时, 可 以保 证正确的 方向 和阅读框 。 抗 性基因允 许通 过抗生素 的选 择获得纯 化的 转导了载 体质 粒的细胞 群 , 相对于其 他的 纯化方法例如 机械法、 流式 分选的方 法 , 具有方 便、 省时、 高 效、 对 细胞损伤 小等 的优点。 它整 合了各种 载体 的技术平 台, 克服了传 统的 酶切和连 接方 法构建载 体的 种种缺陷 , 能 c: 4',6-diamidino-2-phenylindole- d: Immunostaining assay stained nuclei arrow showed that GFP positive cells够将基因高 效地克隆到 一个或多个 与Gateway 克隆技 arrow were αSMA positive 术兼容的 载体 系统中。 因此 , 与其表 达载 体构建方 法相 Figure 5 Fluorescence microscope observation of C2C12 cells transfected with recombinant plasmid比,Gateway 克隆技术 具有 明显的优 势。 反应快速 而简 pLVpuro/α-SMA-hrGFP ×400 图 5 重组质粒 pLVpuro/αSMA-hrGFP 转染 C2C12 细胞后 荧 单, 且克隆 效 率高。 实验 利 用Gateway 技 术, 快速高 效光显微镜 观察 ×400地构建了 人平 滑肌肌动 蛋 白α基因启动子携带的报告基 P.O. Box 1200, Shenyang//. 5090 万方数据 //. 袁晓峰, 等. 利用 多位点 Gateway 技 术构建小 鼠平滑 肌 肌动蛋白 α基因 启 动子慢病 毒载体 [8] Yang LL, Wu Z, Cheng X, et al. Junshi Yixue Kexueyuan 因载体 ,为 深入研 究人 平 滑肌肌 动蛋白α 基 因转录表 达 Yuankan. 2005;294219-222的调控机 制提 供基础。 杨蕾蕾,吴 壮,程萱,等.平滑肌 细胞特 异表达Cre 重组 酶 转基因小 鼠的建立[J].军 事 医学科学 院院刊,2005,294219-222本 实验 选取了 绿色 荧光蛋 白构 建入载 体质 粒中 。 [9] Chen YL, Zhou GQ, Deng YB, et al. Zhongshan Daxue 绿色荧光蛋白表达人源化的绿色荧光,与EGFP相比 , XuebaoYixue Kexueban. 2008;291:10-15绿色 荧光蛋白荧 光强度强, 表 达稳定, 毒性较低,目 陈永乐,周 光前,邓 宇斌,等. C2C12 成肌细胞 体外诱 导分化为 肌 管的实验[J]. 中 山大学学 报 医 学 科学版,2008, 291:10-15前已 成为 哺乳动 物细胞相关 研究的最佳 选择。因此, [10] Ray JL, Leach R, Herbert JM, et al. Isolation of vascular 通过Gateway 技术 ,实验还可 以方便的构 建不同的抗 smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 2001;234:185-188性基 因、报告基 因和启动子 慢病毒载体 ,尤其 是携带 [11] Feng RQ, Du LY, Guo ZQ. In vitro cultivation and 组织 特异启动子 的载体质粒 ,为细胞基 因功能、胚胎 differentiation of fetal liver stem cells from mice. 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