考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量1、实验目的掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。学习分光光度计的原理及使用方法。2、实验原理3、实验步骤试剂试管编号01234567标准蛋白质溶液/ml0.000.020.040.060.080.1样品0.1样品0.1相当于蛋白质含量/微克0.0020406080100未知未知蒸馏水/ml0.10.080.060.040.02000考马斯亮蓝染液/ml333333331、打开分光光度计,预热30min。2、取8支洁净的干燥试管,按上表进行编号,0~5号用于标准曲线的绘制,6号、7号用于样品溶液的测定。3、取微量注射器,用蒸馏水清洗3次,再用标准蛋白质溶液润洗2次。按上表在0~5号试管中加入标准蛋白质溶液,然后用蒸馏水洗3次,再按上表在0~5号试管中加入相应含量的蒸馏水。4、微量注射器用样品润洗2次,抽取100微克的样品加入到6号试管,再抽取100微克加到7号试管。用蒸馏水清洗微量注射器。5、取5ml的移液管,用蒸馏水清洗3次,用考马斯亮蓝染液润洗2次。在0~7号试管中各加入3.0ml的考马斯亮蓝染液。振荡试管,混合均匀。6、待其充分反应(约2分钟)后,用分光光度计分别测它的吸光值。7、用0~5号的数据。以蛋白质浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。8、由样品液的吸光值查标准曲线求出蛋白质含量。4、实验结果与
分析
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试管编号01234567A59500.3830.6030.8711.0931.1890.8760.836样品溶液吸光值=(0.876+0.836)/2=0.856查标准曲线得样品液的蛋白质含量为66.0微克分析:考马斯亮蓝G-250能与蛋白质结合,染液与蛋白质结合后引起染料最大吸收峰的改变,从464nm变为595nm,光吸收值增加。同时蛋白质——染料复合物具有高的消光系数,大大提高了蛋白质测定的灵敏度,最低检出量为1微克蛋白质。染料与蛋白质结合迅速约2min,结合物的颜色在1h内保持稳定。一些阳离子如K+,Na+,Mg2+以及(NH4)2SO4,乙醇等物质不干扰测定,而大量的去污剂如T-ritonX-100,SDS等则严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。优点:染色法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高。缺点:每次测量都得重新绘制标准曲线。注意事项:1、每次测量吸收值都应用0号试管中的溶液去校准,以免后面的结果偏差过大。2、0号试管起空白对照的作用,消除一定的系统误差。3、6、7号实验的关键,它们之间的吸收值应非常接近,误差保持在10%的范围内。如果误差超过这个范围,则实验宣告失败。(注:文档可能无法思考全面,请浏览后下载,供参考。可复制、编制,期待你的好评与关注!)