猪链球菌病及其防治综述

猪链球菌病及其防治综述摘要：猪链球菌广泛存在于自然界，可引起猪链球菌病，该病以发烧、败血症、脑膜炎、肺炎、关节炎等为主要特征；猪链球菌病是一种重要传染病，共有35种血清型，其中猪链球菌2型，致病性强，传播迅速，猪病死率高。该病同时可通过破损皮肤如伤口或擦伤传染给人，也可通过呼吸道感染人，严重感染时可引起人的死亡。本文综述猪链球菌病原学特征及其毒力因子以分析其致病性和免疫防治的分子基础。关键词：猪链球菌；毒力因子；免疫防治猪链球菌病(Swinestreptococosis)是由链球菌属中致病性链球菌所致的一种传染病。链球菌的抗原构造比较复杂，有核蛋白抗原(P抗原)，无群型的特异性；C抗原，具有群特异性； 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面抗原，具有型特异性。兰氏(Lancefield)血清学分类法，将链球菌分成A、B、C、D等20个血清群。根据细菌的荚膜多糖抗原(CPS)特性的不同，D群又可分为35个血清型，即l型～34型和1/2型(同时含有l型和2型抗原的菌株)目前，以2型链球菌病影响最严重，危害最大。猪链球菌病是一种重要的人畜共患病，可以通过伤口、消化道等途径传染给人，引起人类脑膜炎、败血症等，导致严重疾患，甚至死亡。1　猪链球菌病原学特征1883年，Fehleisen分离出链状细菌，根据溶血现象把链球菌分为α、β、γ链球菌，α-溶血链球菌多为条件致病菌，β-溶血链球菌致病力强，γ-溶血链球菌一般不致病。兰氏(Lancefield)分群法，根据抗原结构分群，共有20个群(从A-V)，数百个血清型。感染人类主要是A群、B群和肺炎链球菌。感染猪的链球菌主要是多种不同群的链球菌(D，L，R，S，T，U和V群等)。根据菌体荚膜抗原特性的不同，可以分成35个血清型(1型～34型及1/2型)及相当数量难以定型的菌株[1]。猪链球菌菌落小，灰白透明，稍黏，菌体直径1μm～2μm，多单个或双个存在，呈卵圆形，在液体培养基中才呈长链，链越长致病性越强。大多数链球菌在幼龄培养物中可见到荚膜，不形成芽孢，多数无鞭毛。本菌为革兰氏阳性，需氧或兼性厌氧菌，α或β溶血，一般起先为α溶血，延时培养变为β溶血，或者菌落周围不见溶血，刮去菌落可见α或β溶血。猪链球菌2型在绵羊血平板呈α溶血，马血平板为β溶血。呈浅灰色或半透明的小菌落，生化反应相对活泼，能发酵乳糖、蔗糖、海藻糖、七叶苷、棉子糖，不发酵甘露糖、阿拉伯糖等[2]。链球菌在不利的环境中存在的时间是极其短暂的，但猪链球菌荚膜2型在水中60℃可以存活10min，50℃为2h，0℃时灰尘中细菌可存活30d，在粪便中可以存活90d，在腐尸中存活42d(4℃)，为鸟、野鼠、小白鼠或犬的间接传播提供了重要的传染来源。在污染猪舍的清洗过程中，常用的消毒药和清洁剂在1min内即可杀死猪链球菌2型。污物和有机质中的存在会影响化学消毒药对细菌的杀灭作用，所以应采用在猪舍内先清洗后消毒的策略[3]。2　猪链球菌病流行病学特征链球菌种类多，属条件致病菌，在自然界和猪群中广泛分布，常存在于健康的哺乳动物和人体内。猪、野猪、马属动物、牛、羊、狗、猫、鸟类、兔、水貂和鱼等对猪链球菌均有易感性。对猪则不分年龄，品种和性别均易感，但大多数在3周龄～12周龄的仔猪暴发流行，尤其在断奶及混群时易出现发病高峰。其传播方式主要通过口或呼吸道传播，也可垂直传播(有些新生仔猪可在分娩时感染)。猪链球菌定植在猪的上呼吸道(尤其是鼻腔和扁桃体)、生殖道和消化道，4周龄～6月龄的猪扁桃体带菌率为32%～50%。病猪和病死猪是主要的传染源，亚临床健康的带菌猪可排出病菌成为传染源，对青年猪的感染起重要的作用。病原的携带率和疾病的发病没有明显的相关性[4]。猪链球菌病的流行无明显季节性，一年四季均可发生，但7月～10月份易出现大面积流行。从外地引入带菌猪，混群、免疫接种、高温高湿、气候变化、圈舍卫生条件差等应激因子使动物的抵抗力降低时，均可诱发猪链球菌病。昆虫媒介在疾病的传播中起重要作用，通过在猪场间的飞行传播病原菌。在猪链球菌众多血清型中，2型是猪的最主要病原，致病性最强。从表征健康的猪体扁桃体内分离的所有猪链球菌中，2型多达50.6%，同时其对人的致病性也最强[5]。3 猪链球菌的毒力因子毒力因子(virulentfactor)是指构成细菌毒力的物质。目前，普遍认为猪链球菌的毒力因子主要有溶菌酶释放蛋白、胞外因子、荚膜多糖、溶血素、黏附素和IgG结合蛋白等其他致病因子。3.1溶菌酶释放蛋白(muramidase-releasedprotein,MRP)和胞外因子(extracellularfactor,EF)MRP又称为M蛋白，存在于细胞表面，其结构中有一个类似于A群链球菌M蛋白基因的锚式序列，可能通过与纤连蛋白结合而与毒力相关。将纯化的MRP溶液和该细胞共孵育，发现MRP可诱导细胞发生2种典型的形态学变化：一是诱导细胞融合形成多核巨细胞，随后巨细胞发生凋亡；二是诱导单个细胞凋亡。由此证明MRP可单独作为2型猪链球菌的毒力因子。EF为细胞外蛋白，研究发现，MRPEF-表现型的菌株虽缺乏EF，却存在另外一种在抗原性上与EF类似的EF3，EF3在N端的氨基酸与强毒株的EF几乎一致，但在C端两者有着明显的区别，EF3包含76个氨基酸的若干个重复区，可能通过结合到特定配体上而使菌株毒力降低。因此，EF蛋白中缺乏这种氨基酸的重复区可能与毒力有关。MRP和EF被认为是猪链球菌的两种最重要的毒力因子。Vecht等分析了180株荷兰的2型猪链球菌分离株，发现分离自病猪的菌株含有两种蛋白：分子量为136kD的MRP存在于细胞表面，分子量为110kD的EF存在于培养液中。从病猪体内分离的菌株有80%为MRPEF表现型，而从健康猪的体内分离到的菌株仅有2%为该型。Baums等分析猪链球菌的毒力因子，结果显示表现型为MRPEF的菌株有较强的致病力[4]。3.2 荚膜多糖(capsularpolysaccharide,CPS)　Windsor提出荚膜多糖决定了2型猪链球菌的侵袭力，它能保护该菌在非免疫动物体内不被免疫系统的各种吞噬细胞吞噬，2型猪链球菌的荚膜多糖主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N2-乙酰半乳糖胺和唾液酸等5个单糖组成，由位于基因组3846～4541bp之间的一段长696bp基因序列编码的。Wibawan等认为荚膜的存在降低了猪链球菌被吞噬的程度。通过将缺失了荚膜多糖的突变株与野生株进行攻毒比较，发现荚膜多糖的缺失可明显提高菌株的疏水性及被小鼠巨噬细胞和猪单核细胞吞噬的可能性，突变株更容易从血液循环中被清除，不能引起小鼠和猪发病。由此可见荚膜多糖是2型猪链球菌一个重要的致病因子，其作用途径可能是影响菌体粘附到上皮细胞与巨噬细胞上的活性。3.3 溶血素(suilysin,SLY)　猪链球菌溶血素属巯基活化的溶细胞素家族(TACY)，以单拷贝存在。分为两种类型：对氧敏感的链球菌溶血素O(SLO)和对氧稳定的链球菌溶血素S(SLS)。通过对不同来源的1933株2型猪链球菌的研究发现，溶血素基因的核苷酸序列同源性在99.6%以上，而且这一序列不仅在链球菌中是保守的，而且在整个溶血素家族中都是保守的。体外研究表明,溶血素增强了2型猪链球菌对上皮细胞的侵袭和裂解细胞的能力。通过对溶血素的基因突变株的研究表明，不产生溶血素的突变株溶血活性丧失，无细胞毒性，对小鼠无毒力，而且对猪的致病力也较轻微。因此，溶血素被认为是一种主要的毒力因子[6]。3.4 黏附素(adhesin)　猪链球菌的黏附素主要有2种。第1种分子量为18kD,是一种能被猪链球菌识别的三己糖基酰基鞘氨醇的双糖序列，负责猪链球菌血凝特性的结合特异性，存在所有的菌株中。第2种分子量为39kD，与白蛋白有结合活力。进一步研究发现,当给小鼠注射时,发现该蛋白量增加，猪链球菌菌株的毒力也增加。3.5 其他致病因子　这些致病因子主要包括44kD蛋白、IgG结合蛋白、纤连蛋白(Fibronectin,Fn)、血纤蛋白原(Fibrinogen,Fgn)的结合蛋白(FBPS)、谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase,GDH)和RevS基因[7]。Gottschalk等鉴定了2型猪链球菌的一种44kD的胞壁蛋白，缺乏这种蛋白的突变株对猪和小鼠丧失了致病力，而野生株具有很强的毒力。IgG结合蛋白属于热休克蛋白家族，能非特异性地结合猪、牛、羊等动物及人的IgGFc端，从而影响抗体的活性。纤连蛋白是一种二聚体糖蛋白，以可溶形式存在于血浆、体液或以纤维状存在于细胞外基质(ECM)，介导细胞与细胞外基质的相互作用，可与细胞表面Fn受体结合，在细胞黏附、迁移、生长、分化和活化过程中起重要作用。与野生株相比较，如果用缺乏FBPS的突变株感染猪时仅表现为弱毒力，说明FBPS可能是2型猪链球菌的一个毒力因子。谷氨酸脱氢酶是新近发现的一个与猪链球菌毒力相关的因子，属于GDH蛋白家族。RevS基因是一个孤立的反应调节因子，缺失了RevS基因的突变株在感染猪的器官中定居能力较野生株弱，表明RevS基因在细菌的发病机制中可能起重要作用。毒力因子是细菌致病的基础，细菌致病机理的研究一般从其毒力因子着手。通常认为，链球菌通过其表面的黏附因子黏附在上呼吸道黏膜表面，经过内化，进入血液循环系统，通过荚膜、IgG结合蛋白等逃避机体的免疫，从而引起败血症。随着基因组学和蛋白质组学研究的不断深入，该菌更多的毒力基因和毒力因子将被发现，这将为阐明该菌的致病机理及新型疫苗的开发十分必要。4 检测技术4.1血清学检测血清学检测需要细菌纯培养和各种特异血清。其方法较多，常用的有玻片凝集试验、琼脂扩散试验、SPA凝集试验、乳胶凝集试验、毛细管沉淀试验、酶联免疫吸附试验、免疫印迹分析等[8]。常用的有①玻片凝集试验针对猪链球菌2型的鉴定先用兰氏分群试剂盒进行分群再用猪链球菌134分型血清进行分型。试验应设阴、阳性及生理盐水对照。②协同凝集试验先将血清和金黄色葡萄球菌A蛋白混匀再与待测菌体混合进行凝集试验形成大颗粒凝集的为阳性。③免疫印迹分析提取待测菌株的荚膜多糖凝胶电泳分离转移到硝酸纤维素膜上用特异性抗体杂交最后酶联显色产生特征性条带的为阳性。④酶联免疫吸附试验ELISA 用荚膜多糖作抗原的ELISA鉴定猪链球菌，应使用可靠、快捷和特异性高的两种单克隆抗体的双抗体夹心法。4.2分子生物学检测PCR检测方法快速、准确、简便。猪链球菌2型CPS共有CPS2Z、CPS2J等14个开放阅读框，其中CPS2J除与1/2型有较高的同源性外，与其他33个血清型的序列同源性都很低，是目前国内外利用PCR技术鉴别诊断猪链球菌2型的主要基因组。我国学者就猪链球菌2型的快速诊断方法做过大量研究主要是根据菌株的不同毒力基因建立了多种PCR检测方法。但由于猪链球菌2型存在不同的菌株其所携带的毒力因子也不尽相同因此已经建立的PCR检测方法可能对猪链球菌2型有漏检。其他分子生物学鉴定方法包括多位点酶电泳法、脉冲场凝胶电泳法、限制性片段长度多态性分析、随机扩增核酸片段多态性分析以及原位分子杂交法等这些鉴定方法更适于流行病学分析与研究[9]。多重PCR可用于猪链球菌毒力相关因子cps2、mrp、epf、sly的基因检测,特异性和敏感性好，为该病快速诊断和分子流行病学调查提供了新的技术手段。多重荧光PCR具有快速、特异性强、灵敏度高和稳定性好的优点，适合于大批量样品的检验和动物防疫监督部门的疫情监测。4.3基因芯片技术　基因芯片是近年来广泛应用于基因序列分析、基因突变检测、基因组文库分析以及病原诊断等领域的一项技术。该技术通过将大量核酸探针以微列阵固定于支持物上，当荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子结合后，可通过检测荧光信号强度来分析获得待检样本的基因信息，因而可实现高通量、多靶基因的检测和分析。随着大量病原微生物基因组序列测定的完成，基因芯片在致病微生物快速侦检中得到广泛的应用。建立的芯片体系作为一种检测SS的种、致病血清型和毒力因子的新方法，具有较好的特异性和敏感性，对于高通量鉴定猪链球菌菌种及其毒力有重要价值[4]。5 治疗当急性病例爆发，每天对猪群都应进行多次监测，检查是否有平衡和站立困难的猪的出现。病猪应转移到隔离区，如果可能的话，应转移出此厂房，给予注射治疗。最佳的卫生学和补水方法是通过给水和饲喂稀食直到它们能独立吃食和饮水，这样能帮助减少死亡率。未感染的猪饲料中加入抗生素以防感染。对病猪的治疗主要依靠消炎药，抗生素和最后补水。抗生素的应用可保护其它动物的安全。β－内酰胺类药物能快速在血浆中达到高浓度，能很好的扩散到细胞间隙，广谱抗菌，对链球菌有较好的抗菌作用。从实际考虑，治疗可能应从饮水开始（阿莫西林），也可以在食物中加入抗生素。但在食物中添加药物，不容易实施，因为剂量要求控制的更加准确。治疗应持续至少5天以上。对于个体，头孢塞夫类药物看起来有比较好的功效。病猪可以恢复健康，如果抗生素通过。有可靠的诊断方法，正在急性发病的猪厂，有必要根据抗生素主要是阿莫有西林的合理使用制定预防计划[10]。6预防免疫接种是预防猪链球菌病的重要环节，直到现在，抵御链球菌感染的疫苗仍以自家苗为主，且结果不一。疫苗免疫失败的原因可能有：保护性抗原的降解；加热或灭活过程中抗原性的丧失；荚膜菌免疫活性差；产生与毒力因子无关的抗原的抗体[11]。目前我国研制成功的猪链球菌病疫苗主要有猪链球菌多价灭活苗、氢氧化铝甲醛苗、弱毒冻干苗，疫苗的研究工作一直在不断进行中[12]。陆承平等[4]将马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型MRP基因融合片段的重组质粒转化大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导，表达了相对分子质量为60ku左右的融合蛋白，经纯化的融合蛋白，制备成马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和猪链球菌2型HA9801株制备的二联灭活苗为免疫原，3周后以5LD50的ATCC35246和HA9801强毒株进行攻击。结果全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达90%。近年来，由于抗生素的滥用，如在动物饲料中长期添加抗生素用于促进生长及预防和治疗疾病，发生疾病后未经兽医诊断就盲目大量使用多种抗生素等，不仅使治疗成本提高，耽误了有效治疗的最佳时机，而且产生了大量耐药菌，抗生素也失去应有的作用，疾病难以控制；其次猪链球菌的耐药率较高，而敏感率又普遍偏低，不同地区分离株耐药性也不一致，表现出多重耐药性；再就是链球菌的血清型较多，其间的交叉免疫保护作用也不确定，再加上猪链球菌具有较强的地域性，即使同一地区的不同菌株也有明显的差异，因而彻底根除本病难度较大。随着科技发展，分子生物学技术的不断进步，应用分子生物学技术，开发基因工程疫苗已成为新型动物疫苗研制的主流。如，荚膜多糖（CPS）已经证实是SS2的重要毒力因子，缺乏CPS等位基因的突变株进入实验动物猪和大鼠体内很快会被循环清除，对实验动物无毒性。其可能的作用途径是影响菌体粘附到上皮细胞与巨噬细胞上的活性。利用特异性荚膜多糖抗原基因检测猪链球菌2型的PCR方法的建立和完善有利于临床疑似病例的早期诊断和鉴别诊断。深入研究猪链球菌特别是猪链球菌2型的病原学特性，在人和动物之间传播的机制，以及该病在不同地域的流行病学特性，加快致病基因的发现，将为该病的分子诊断技术，新型疫苗和有效药物的研制提供理论依据，从而有利于猪链球菌病的预防和治疗。参考文献：[1]王花茹，王长军，唐家琪.致病性猪链球菌主要毒力因子基因多重PCR检测[J].中华流行病学杂志，2005，26(9):640～644.[2]郑峰，王长军，曾海攀，等.猪链球菌基因芯片检测方法的研究[J].中国人兽共患病学报，2008，24(1):38～41.[3]陈博文，罗宝正，陈竞帆，等.多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用[J].中国兽医学报，2007，27(3):75～89.[4]王花茹，王长军，陆承平，等.致病性猪链球菌主要毒力因子基因多重PCR检测[J].中华流行病学杂志，2005，26(9):102～105.[5]何孔旺，倪艳秀，王继春，等.猪链球菌分子流行病学[J].中国人畜共患病杂志，2002，18(5):45～47.[6]曾巧英，陆承平.猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡[J].微生物学报，2003，43(3):407～412.[7]徐敏，蔡雪辉，王淑杰，等.猪链球菌2型毒力因子研究进展[J].动物医学进展，2009，(2).65～70.[8]AstridG,HermaB,RobinV.Contributionoffibronectin-bindingproteintopathogenesisofStreptococcussuisserotype2[J].InfectImm,2002,70(3):1319～1325.[9]DeGA,BuysH,VanAL,etal.ResponseregulatorimportantinpathogenesisofStreptoooccussuisserotype2[J].MicrobPathog,2001,33(4):185～193.[10]王华，赵云玲，王君玮，等.猪链球菌病流行病学及其疫苗研究现状[J].动物医学进展，2006,9:27~31.[11]MarceloGottschalk,DVMPhD.猪链球菌感染的预防和控制最新研究进展[J].VetMi-crobiol,2000,76:259～272.[12]孙长贵.人猪链球菌2型感染及实验室诊断研究进展[C].2006年浙江省检验医学学术年会论文汇编.2006,10:326~341.