2021年版卫生部统一标准大肠埃希菌检验方法

序言本 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 替换GB/T4789.38-《食品卫生微生物学检验大肠杆菌计数》。本标准和GB/T4789.38-相比，关键改变以下：——修改了标准汉字名称；——修改了培养基和试剂；——将“第二法大肠杆菌VRB-MUG平板计数法”改为“大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）”；——删除了“第三法大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法”；——修改了附录A。GB4789.38-1食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数1范围本标准要求了食品中大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）计数 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。本标准适适用于食品中大肠埃希氏菌计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适适用于贝类产品。2术语和定义2.1大肠埃希氏菌Escherichiacoli大肠杆菌广泛存在于人和温血动物肠道中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为＋＋－－或－＋－－革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品卫生情况，推断食品中肠道致病菌污染可能性。2.2最可能数基于泊松分布一个间接计数方法，简称为MPN。3设备和材料除微生物试验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料以下：a）恒温培养箱：36℃±1℃；b）冰箱：2℃～5℃；c）恒温水浴箱：44.5℃±0.2℃；d）天平：感量为0.1g；c）均质器；d）振荡器；e）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；f）无菌锥形瓶：容量500mL；g）无菌培养皿：直径90mm；h）pH计或pH比色管或精密pH试纸；i）菌落计数器；j）紫外灯：波长360nm～366nm，功率≤6W。4培养基和试剂4.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：见附录A中A.1。4.2EC肉汤（E.colibroth）：见附录A中A.2。4.3蛋白胨水：见附录A中A.3。GB4789.38-24.4缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]：见附录A中A.4。4.5西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A中A.5。4.6磷酸盐缓冲液：见附录A中A.6。4.7伊红美蓝（EMB）琼脂：见附录A中A.7。4.8营养琼脂斜面：见附录A中A.8。4.9结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：见附录A中A.9。4.10结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂（VRBA-MUG）：见附录A中A.10。4.11革兰氏染色液：见附录A中A.11。4.12Kovacs靛基质试剂：见附录A中A.12。4.13无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.13。4.14无菌1mol/LHCl：见附录A中A.14。GB4789.38-35大肠埃希氏菌MPN计数（第一法）5.1检验程序大肠埃希氏菌MPN计数检验程序见图1。图1大肠埃希氏菌MPN计数法检验程序不产气36℃±1℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃48h±2h44.5℃±0.2℃48h±2h检样25g（mL）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择适宜3个连续稀释度样品匀液，接种LST肉汤管产气EC肉汤不产气产气EMB平板划线可疑菌落移种营养琼脂斜面或平板IMViC生化试验，革兰氏染色阴性管阳性管查MPN 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 汇报GB4789.38-45.2操作步骤5.2.1样品稀释5.2.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10样品匀液。5.2.1.2液体样品：以无菌吸管吸收25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量无菌玻璃珠）中，充足混匀，制成1:10样品匀液。5.2.1.3样品匀液pH值应在6.5～7.5之间，必需时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调整。5.2.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸收1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100样品匀液。5.2.1.5依据对样品污染情况估量，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完成，全过程不得超出15min。5.2.2初发酵试验每个样品，选择3个适宜连续稀释度样品匀液（液体样品能够选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超出1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察小倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养48h±2h。产气者进行复发酵试验。如全部LST肉汤管均未产气，即可汇报大肠埃希氏菌MPN结果。5.2.3复发酵试验用接种环从产气LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于已提前预温至45℃EC肉汤管中，放入带盖44.5℃±0.2℃水浴箱内。水浴水面应高于肉汤培养基液面，培养24h±2h，检验小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48h±2h。统计在24h和48h内产气EC肉汤管数。如全部EC肉汤管均未产气，即可汇报大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。5.2.4伊红美蓝平板分离培养轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36℃±1℃培养18h～24h。观察平板上有没有具黑色中心有光泽或无光泽经典菌落。5.2.5营养琼脂斜面或平板培养从每个平板上挑5个经典菌落，如无经典菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上，36℃±1℃，培养18h～24h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。5.2.6判定取培养物进行靛基质试验、MR-VP试验和柠檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌和非大肠埃希氏菌生化判别见表1。GB4789.38-5表1大肠埃希氏菌和非大肠埃希氏菌生化判别靛基质（I）甲基红（MR）VP试验（VP）柠檬酸盐（C）判定（型别）＋－＋＋－－－－经典大肠埃希氏菌非经典大肠埃希氏菌＋－＋＋－－＋＋经典中间型非经典中间型－＋－－＋＋＋＋经典产气肠杆菌非经典产气肠杆菌注1：如出现表1以外生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必需时做反复试验。注2：生化试验也能够选择生化判定试剂盒或全自动微生物生化判定系统等方法，根据产品说明书进行操作。5.3大肠埃希氏菌MPN计数汇报大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC生化试验为＋＋――或－＋－－。只要有1个菌落判定为大肠埃希氏菌，其所代表LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附录B），汇报每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。6大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）6.1检验程序大肠埃希氏菌平板计数法检验程序见图2。图2大肠埃希氏菌平板计数法检验程序6.2操作步骤6.2.1样品稀释按5.2.1进行。6.2.2平板计数检样25g（ml）样品+225ml稀释液，均质选择2个～3个适宜连续稀释度样品匀液，接种VRBA-MUG平板10倍系列稀释紫外灯照射，计数发荧光菌落汇报结果36℃±1℃18h～24hGB4789.38-66.2.2.1选择2个～3个适宜连续稀释度样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。同时取1mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。6.2.2.2将10mL～15mL冷至45℃±0.5℃结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基和样品匀液充足混匀。待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36℃±1℃培养18h～24h。6.3平板菌落数选择选择菌落数在10CFU～100CFU之间平板，暗室中360nm～366nm波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光菌落。检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如ATCC13048）做阳性和阴性对照。6.4大肠埃希氏菌平板计数汇报两个平板上发荧光菌落数平均数乘以稀释倍数，汇报每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g(mL)表示。若全部稀释度（包含液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数汇报。__