第6章原生质体培养与诱变

原生质体培养与诱变主要内容原生质体的培养原生质体分离纯化原生质体鉴定与活力测定原生质体培养与植株再生原生质体变异自发突变原生质体诱变原生质体(protoplast)：指除去细胞壁裸露的球形细胞，又称原生质球。一、植物原生质体的特点1、无细胞壁障碍：原生质体能摄取DNA，质粒、病毒、细菌、细胞器等外源物质，是植物细胞 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 进行遗传操作、基因转移的良好 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ；2、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力；一、植物原生质体的特点3、原生质体适合进行融合形成杂种细胞，能克服不同种细胞间的不亲和障碍，培育新品种形成杂种细胞。原生质体用途二、原生质体的制备1、用于分离原生质体的材料可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。2、原生质体的分离材料预处理用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体，才能获得高产量。2、原生质体的分离1）、酶解法2）、机械法2、原生质体的分离酶解法1960年，英国诺丁汉大学的科金(Cocking)第一次采用酶解的方法从番茄幼苗根尖中成功地大量制备出原生质体。从而建立了酶解法大量获得原生质体的新方法。2、原生质体的分离酶解分离法：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。常用酶包括:琼脂酶、果胶酶、纤维素酶等，需要根据不同的细胞来源选择合适的酶。2、原生质体的分离酶解法优缺点条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的活力。2、原生质体的分离酶解制备原生质体过程（1）取材消毒（2）酶解制备（3）原生质体收集A、酶溶剂及其渗透压酶的种类、酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制、PH値。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。B、酶解时间：酶浓度及温度酶解考虑因素：2、原生质体的分离1892年首先用于藻类分离原生质体机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。2、原生质体的分离机械分离法优缺点优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。3、原生质体的纯化：3、原生质体纯化原生质体酶解结束后，首先要将原生质体与细胞碎片及酶液分离，然后洗涤后再进行培养，如果用于细胞融合还需要进一步纯化。具体的纯化方法有以下几种:（1）过滤一离心法（2）漂浮法（3）沉降法和漂浮法结合3、原生质体纯化(一)过滤一离心法多采用40-100μm的网筛过滤除去未消化的细胞、细胞团、碎片，溶剂内低速离心使原生质体沉于离心管底部；细胞碎片留在上清液中，反复3-4次，收集得到原生质体。优缺点：比较简单但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎3、原生质体纯化(二)原生质体比重较小，能在具有一定渗透压的溶液(如25%的蔗糖溶液）漂浮，然后用吸管收集。飘浮法Protoplast3、原生质体纯化漂浮法优缺点优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。所用药品简单，成本低。缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。3、原生质体纯化(三）沉降法和漂浮法结合将原生质体酶解液低速离心，倾去上清液，将沉降得到的原生质体重新悬浮于纯化液中(含21%的蔗糖)中离心，吸取 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层的原生质体。再将原生质体重新悬浮于洗涤液中，离心，收集沉于底部的原生质体。根据需要，重复两次以上操作，获得纯度高的原生质体。4、原生质体鉴定原生质体鉴定经分离、纯化后的原生质体需要进行鉴定,以检验所获得的原生质体是否是真正的原生质体。鉴定方法主要有下面两种方法(针对有无细胞壁)：（1）低渗爆破法（2）荧光染色法4、原生质体鉴定（一）低渗爆破法把原生质体放人低渗透压溶液中，在显微镜下观察原生质体从低渗溶液中吸水胀破的过程。如果是真正的原生质体，因为没有细胞壁，胀破后留下的残迹应该是无形的。如果原生质体还带有部分细胞壁，则原生质体胀破后留下的残迹仍保持半圈形的细胞壁。4、原生质体鉴定（二）荧光染色法将原生质体放入离心管中，加入0.01%荧光增白剂（配在0.3mol/L甘露醇中）染色5-10min，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光显微镜下用366nm波长的紫外光照时，细胞壁将发黄绿色荧光。有黄绿色荧光表示细胞壁没有完全去除。5、原生质体活力测定原生质体活力测定形态识别：形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。5、原生质体活力测定荧光显微镜识别(FDA法)(一)染色法（1）荧光素双醋酸盐(FDA)法:FDA本来没有荧光，当其进人细胞后被降分解为具有荧光的极性物，不能透过质膜，而是留在细胞内发出荧光。能发荧光的是具有活性的原生质体，不发出荧光的为死亡的原生质体。0.01%5、原生质体活力测定(2)酚藏花红染料法:取一滴原生质体悬液放在载玻片上，加一滴0.1%酚藏花红溶液，具有活性的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即染成红色。0.1%5、原生质体活力测定(3)伊文思兰(Evan’sblue）染色法有活力的细胞不吸收染料(浓度为0.25%)为无色，而没有活力的吸收染料显示兰色.5、原生质体活力测定（二)胞质环流法在显徽镜下观察原生质体是否存在胞质环流来判断原生质体的活力。有胞质环流的是有活力的。（三)渗透压变化将原生质体放人较低渗透压的溶液中，体积会膨胀；放进高渗透压的溶液中，体积会缩小。这样的原生质体是有活力的原生质体，而体积不变的是已经死亡的原生质体。5、原生质体活力测定(四)氧电极法有活力的原生质体在光照下会进行光合作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来判定原生质体是否具有活力。5、原生质体活力测定影响原生质体数量和活力的因素供试材料及预处理方法酶解条件酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度渗透压稳定剂质膜稳定剂分离条件离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。分离用具5、原生质体活力测定PH分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。如制备菜豆叶片原生质体时：低pH（<4.5），酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，被破坏的细胞较多;pH值偏高（7.0），酶活力差，原生质体分离速度慢，完整的原生质体数目较多。5、原生质体活力测定光照制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间内保持一定的温度，原生质体方能释放。脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质体一般是在黑暗条件下进行的。5、原生质体活力测定温度在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h5、原生质体活力测定渗透压稳定剂原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而破坏内部结构。5、原生质体活力测定常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，浓度约0.40M~0.80M。渗透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂。6、原生质体培养将纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中培养。原生质体的起始密度在104-106个细胞/ml。如果采用的是看护培养等特殊方法，密度可降低。刚刚从酶液分离出来的原生质体一般要用高渗透压的培养液，在一定时间内逐渐将高渗透压的培养液降低至正常渗透压的培养液。时间要根据不同的培养对象有所不同。6、原生质体培养培养基（1）渗透压常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。（2）无机盐（3）有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。（4）激素常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D（5）pH值6、原生质体培养原生质体培养方法液体浅层培养固体培养液体－固体双层培养琼脂糖珠培养6、原生质体培养6、原生质体培养（1）液体浅层培养法Kameyal(1972)采用此法使胡萝卜原生质体产生细胞团和胚状体。培养皿中注入3-4ml培养液，成一薄层——接种一定密度（2x105/ml）原生质体——每日轻摇2-3次，加强通气——原生质体细胞壁产生——分裂形成细胞团——转至固体培养基，分化成苗。6、原生质体培养液体浅层培养法优缺点优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。6、原生质体培养（2）双层培养法——液体-固体双层培养法培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。6、原生质体培养双层培养法——液体-固体双层培养法优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不易观察细胞的发育过程。6、原生质体培养（3）固体薄层培养法（平板培养）原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37C左右）等体积混合成0.7%，培养于培养皿中。6、原生质体培养固体薄层培养法优缺点优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。缺点：培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。6、原生质体培养琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。7、原生质体培养--植株再生原生质体培养的植株再生一般经过细胞壁再生、细胞分裂成细胞团、愈伤经原生质体培养的植物再生一般经过细胞壁再生、细胞分裂成细胞团、愈伤组织(或胚状体)、分化成芽和根、完整植株这几个过程。7、原生质体培养--植株再生完整细胞7、原生质体培养--植株再生（1）细胞壁再生原生质体在合适的培养基上培养后，首先其体积开始膨胀，叶绿体重新排列，在短时期内开始合成新的细胞壁，进而由球形变成椭圆形。7、原生质体培养--植株再生（2）细胞分裂一般在培养2-3d后细胞质增加，细胞器也开始增殖，RNA、蛋白质等的合成增加，不久便开始第一次分裂，不同植物的分裂时间不同，为了使原声质体再生的细胞能继续分裂下去，应该及时地更换培养液，以适应不断长大和增多的细胞对营养的需求。7、原生质体培养--植株再生（3）愈仿组织(或胚状体)细胞不断分裂形成小的细胞团，并进一步形成愈伤组织.有些植物由细系形成胚状体。（4）植株再生与植物组织培养再生植株类似，从原生质体出发的植物再生也经过器官发生和胚状体两条途径。具体参见3.1。三、原生质体变异原生质体的变异包括：（1）自发突变（2）原生质体诱变三、原生质体变异自发突变原生质体在离体培养条件下非常容易受到外界因素影响而发生自发的遗传性状改变主要表现：染色体数目和结构上的变异与基因突变导致由原生质体再生的植株在形态特征或性状上不同于母体杭株，包括生长习性、抗病性、发育特性等。三、原生质体变异自发突变的应用通过植物原生质体诱变可以获得大量的可供选择的变异群体，在很短时间内完成突变体的筛选。在培养的细胞中选择突变体有利于在分子水平研究突变机制。因此可以利用原生质体培养过程中自发变异进行植物遗传改良。三、原生质体变异原生质体诱变人工诱变剂对离体培养的原生质体进行处理，利用组织培养再生植株，从中筛选正突变体，可以得到遗传性状改良的植株。三、原生质体变异常用的人工诱变剂如下:（1）物理诱变剂:包括X射线、γ射线、β射线和中子等。按照突变频率大小一般顺序为中子>γ射线(或X射线)>β射线。近年来，激光、离子束、电子束、微波等诱变剂也开始在植物育种上应用。（2）化学诱变剂:主要有5-溴(氟)尿嘧啶、2-氨基蝶呤、亚硝基胍、甲基磺酸乙醋以及羟胺、亚硝酸等复习题1、为什么原生质体培养时一定要注意选择合适的渗透压？2、查阅文献，以一例说明原生质体诱变在植物育种中的应用。END