一种抗菌多肽化合物、合成方法及其应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112625106A(43)申请公布日2021.04.09(21)申请号202110043279.1C07K1/04(2006.01)(22)申请日2021.01.13A61K38/17(2006.01)A61P31/04(2006.01)(71)申请人兰州大学地址730000甘肃省兰州市天水南路222号申请人兰州大学淮安高新技术研究院(72)发明人张邦治　李晓　张剑锋　白路涛　高飞云　李昊　刘欢　曾庆芳　曹亦欣　李静　(74)专利代理机构南京常青藤知识产权代理有限公司32286代理人金迪(51)Int.Cl.C07K14/435(2006.01)C07K1/20(2006.01)C07K1/06(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图4页(54)发明名称一种抗菌多肽化合物、合成方法及其应用(57)摘要本发明属于药物化学领域，具体涉及一种基于抗菌肽polybia‑MPI的Sar修饰的高稳定性抗菌多肽化合物，本发明提供了一种基于抗菌肽polybia‑MPI的Sar修饰的稳定性高、抗菌活性好、毒性低的抗菌多肽化合物[Sar2]‑MPI，其合成方法以及该抗菌多肽在制备抗菌药物中的应用，本发明通过更为系统的扫描和筛选方法，在更接近生理环境下，找到多肽序列中影响体内稳定性的关键位点，同时对替换后的类似物进行了稳定性、体内体外抗菌活性、毒副作用的筛选和作用机制研究，以获得稳定性和抗菌活性提高而毒性降低的新型抗菌药物。CN112625106ACN112625106A权　利　要　求　书1/2页1.一种基于抗菌肽polybia‑MPI的Sar修饰的的抗菌多肽化合物，其结构如下：Ile‑Sar‑Trp‑Lys‑Lys‑Leu‑Lue‑Asp‑Ala‑Ala‑Lys‑Gln‑Ile‑Lue‑NH2。2.一种抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、树酯预处理：称取MBHA树脂(取代值0.43mmol/g)0.3mmol加入合成仪中，加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干，用DMF洗涤，减压抽干，然后挑取少量树脂置于试管进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常；S2、脱Fmoc保护：在氩气保护条件下，在合成仪的树脂中加入20％体积比的哌啶的DMF溶液10mL，搅拌3‑5min后减压抽干，重复2次；用10mL的DMF洗涤，减压抽干后茚检，当树脂颜色为蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱除完全；S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc‑氨基酸(Fmoc‑AA)、1‑羟基苯并三氮唑(HOBt)、O‑苯并三氮唑‑N,N,N’,N’‑四甲基脲‑六氟磷酸脂(HBTU)，加入少量DMF完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺(DIEA)充分混匀得到活化氨基酸，将活化氨基酸立即加入到步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，在氩气保护条件下搅拌进行缩合反应；反应结束后减压滤去反应液，用10mL的DMF洗涤减压抽干后茚检，如树脂显淡黄色透亮表明缩合反应完全；S4、肽链的延长：不断重复步骤S2和步骤S3，对同一制品按照序列由羧基末端向氨基末端的顺序，依次加入相应的Fmoc‑AA进行缩合，直至制品中所有氨基酸连接完毕；S5、将S4得到的制品按照步骤S2脱去肽链N‑末端最后一个氨基酸的Fmoc保护基后，用DMF洗涤4次，每次3min，减压抽干后茚检；S6、多肽的裂解：将S5得到的制品依次用DCM和甲醇交替洗涤树脂3次，每次3min；密封合成仪，真空抽干2小时以上至树脂完全干燥；加入10mL裂解试剂，室温反应3h，期间每隔20min搅拌1min；反应完后收集裂解试剂，另外用5mL的TFA洗涤两次，每次5min；合并裂解试剂与滤液，用旋转蒸发仪减压除去裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡进行沉淀，静置后除去上清；沉淀用水充分溶解后用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，经冷冻干燥后得到白色固体粉末状粗肽；S7、粗肽的纯化：粗肽选用Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱，以20％的乙酸溶液为流动相进行脱盐，用核酸蛋白紫外 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 仪在254nm监测并收集主峰，经冷冻干燥后用于进一步高效液相色谱纯化，选用Waters XBridge BEH130 Prep C18反相柱(10μm，19×250mm)，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系按照20％‑80％/60min梯度洗脱，在220mm处收集主峰，冷冻干燥后可得到纯的白色固体粉末即为多肽化合物。3.根据权利要求2所述的一种抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于：步骤S1中加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌30min。4.根据权利要求2所述的一种抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于：步骤S3中在氩气保护条件下搅拌1h进行缩合反应。5.根据权利要求2所述的一种抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于：步骤S1、步骤S2和步骤S3中用DMF洗涤4次，每次2min。6.根据权利要求2所述的一种抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于：步骤S5中的裂解试剂组分比为Tis:TFA:H2O＝25:95:2.5。7.根据权利要求2所述的一种抗菌多肽化合物的合成方法，其特征在于：步骤S7中用含2CN112625106A权　利　要　求　书2/2页0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系按照20％‑80％/60min梯度洗脱的流速为8mL/min，冷冻干燥后可得到纯度95％以上的白色固体粉末的收率为60％。8.权利要求1所述的多肽化合物在制备抗菌药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗菌药物中的菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。10.一种抗菌药物，其特征在于，包括如权利要求1所述的抗菌多肽化合物。3CN112625106A说　明　书1/10页一种抗菌多肽化合物、合成方法及其应用技术领域[0001]本发明属于药物化学领域，具体涉及一种基于抗菌肽polybia‑MPI的Sar修饰的高稳定性抗菌多肽化合物，该抗菌多肽的合成方法以及其在制备抗菌药物中的应用。背景技术[0002]抗生素的发现有效的控制了感染类疾病，并大幅度降低了手术等医疗过程的风险。然而随着抗生素的误用和滥用，细菌耐药性已成为威胁人类健康的全球性问题，而抗生素新药研发停滞不前，近年来几乎没有新的抗生素类药物上市，当越来越多的“超级细菌”不断出现时，人们面临着无药可用的境地，因此发展新型不易引起耐药的抗生素类药物是极为迫切的任务。[0003]抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)又称为宿主防御肽(Host Defense Peptides， HSPs)，是生物进化过程中保留下来的抵抗病原体感染的第一道防线，广泛存在于昆虫、两栖动物、哺乳动物、植物甚至细菌中，除了具有抗菌作用外，还有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节等作用。原核生物和真核生物细胞膜最主要的区别在于脂质的组成和排列，哺乳动物细胞膜外层脂质为电中性的两性磷脂(卵磷脂和鞘磷脂)，而细菌质膜因含有大量带负电荷的磷脂(如磷脂酰甘油等)而整体处于带负电的极化状态。大多数抗菌肽通过扰乱质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，导致膜去极化形成离子通道或瞬时小孔，细菌不能保持正常的渗透压而死亡。不同于靶点专一的传统抗生素，抗菌肽可作用于细胞膜在内的多个靶点，使细菌很难在短时间内改变细胞膜的性质，因此抗菌肽对耐药菌有效且不易引起耐药，是目前非常吸引人的抗生素研究热点。抗菌肽虽然有诸多优点，但天然含量低、基因工程表达难度大、分离纯化成本高，并且许多抗菌肽还会引起一定程度的溶血等毒副作用。虽然目前已有Magainin、Mellittin等部分抗菌肽家族已用于临床抗感染研究，但是因为体内系统毒性、稳定性差等诸多问题，迄今还没有可用于临床的抗菌肽药物。因此选择有潜力的天然抗菌肽分子，通过化学方法进行结构修饰，提高体内稳定性并降低毒副作用，是发现新型抗生素的有效途径。[0004]多肽分子的稳定性修饰中，常用策略包括多肽序列N端和C端修饰、非天然氨基酸替换、脂肪酸引入、环化及聚乙二醇化等。体内的蛋白酶能识别由天然氨基酸构成的多肽并降解，然而无法有效识别非天然氨基酸，因而D型氨基酸在内的非天然氨基酸替换，常用于提高多肽分子的体内稳定性。如人防御素家族多肽LL‑37的片段EFK‑17中引入D型氨基酸后稳定性提高了10％；蜂毒抗菌肽Protonectin全部用相应D型氨基酸替换后，对人血浆中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的稳定性都有明显提高。但是D型氨基酸会改变替换位点的手性结构并影响多肽主链空间走向，特别对于双亲性α‑螺旋阳离子抗菌肽，部分位点的手性结构变化会破坏α‑螺旋结构并引起活性丧失。如用D型Lys替换polybia‑CP中的L型Lys后体内稳定性有所提高，但是α‑螺旋结构被破坏而失去了抗菌活性。类肽(Peptoid)是近年来引起研究者注意的肽模拟物之一，其特点是将原本位于Cα上的氨基酸侧链基团移到了氨基N上。作为一种主链结构非常接近肽链的模拟物，类肽能够有效抵抗酶解作用，能消除替换位点4CN112625106A说　明　书2/10页的手性而柔化空间构象，已用于抑制剂的设计、细胞穿膜肽、药物载体和抗菌肽的研究。[0005]2005年Bibiana M.Souza等从巴西黄蜂(polybia paulista)的毒液中分离出阳离子抗菌肽polybia‑MPI，研究表明polybia‑MPI具有广谱的抗菌活性，且对耐药菌有效；可选择性抑制真菌的生长，并以剂量依赖的方式抑制生物膜的形成；具有较好的抗肿瘤活性，且能在低剂量下杀死多药耐药肿瘤细胞，而对正常细胞表现出较低的毒性；研究表明polybia‑MPI通过膜裂解机制发挥抗菌和抗肿瘤作用。虽然polybia‑MPI能作用于多种病原体，表现出了很好的应用前景，但是polybia‑MPI很容易被蛋白酶水解而导致体内稳定性差，限制了在治疗中的进一步应用。近年来针对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白酶的特定水解位点，选择相应的D型氨基酸或完全用D型氨基酸替换等方法来提高 polybia‑MPI的酶解稳定性，已经取得了一定的进展。Yanyan Zhao等用D‑Lys替换 polybia‑MPI序列中的Lys，得到类似物D‑Lys‑MPI虽然血浆稳定性有所提高，但是因为替换位点构型改变影响多肽分子空间构象而伴随着抗菌活性的显著下降，另外通过全D 型氨基酸替换得到的类似物D‑MPI在保留了抗菌活性的同时血浆稳定性有所提高，但是D型氨基酸的成本远高于L型氨基酸，在很大程度上增加了多肽的修饰成本。BeijunLiu等对polybia‑MPI进行分子内环化来提高稳定性，但是得到的类似物或者抗菌活性下降，或者表现出较高的溶血副作用。另外血浆中的蛋白酶组成和作用非常复杂，包括纤溶酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、外切蛋白酶、基质金属蛋白酶多个家族，仅用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等个别特定的蛋白酶来研究多肽分子的体内稳定性还存在不足，需要针对体内的真实环境发展更为系统性的研究方法。[0006]因此，我们使用了所有类肽氨基酸中结构最为简单、成本较低且的N‑甲基甘氨酸 (肌氨酸，Sarcosine，Sar)对抗菌肽中的氨基酸逐个扫描和替换，分析替换后类似物的血浆稳定性，通过这种更为系统的扫描和筛选方法，在更接近生理环境下，找到多肽序列中影响体内稳定性的关键位点。我们应用这种策略对polybia‑MPI进行了逐个扫描和替换，同时对替换后的类似物进行了稳定性、体内体外抗菌活性、毒副作用的筛选和作用机制研究，以获得稳定性和抗菌活性提高而毒性降低的新型抗菌药物。发明内容[0007]本发明的目的是利用类肽氨基酸不易被体内的蛋白酶识别、可有效提高多肽分子体内稳定性的特点，提供了一种利用侧链结构最简单、成本较低、且能柔化替换位点空间构象的Sar对抗菌肽逐个位点扫描，系统性研究影响抗菌肽体内稳定性关键位点的方法，[0008]本发明的另一个目的是通过这种更为系统的扫描和筛选方法提供了一种基于抗菌肽polybia‑MPI的Sar修饰的稳定性高、抗菌活性好、毒性低的抗菌多肽化合物 [Sar2]‑MPI，以及该抗菌多肽在制备抗菌药物中的应用，其合成方法包括以下步骤：[0009]S1、树酯预处理：称取MBHA树脂(取代值0.43mmol/g)0.3mmol加入合成仪中，加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干，用DMF洗涤，减压抽干，然后挑取少量树脂置于试管进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常；[0010]S2、脱Fmoc保护：氩气保护条件下，在合成仪的树脂中加入20％体积比的哌啶的 DMF溶液10mL，搅拌3‑5min后减压抽干，重复2次；用10mL的DMF洗涤，减压抽干后茚检，当树脂颜色为蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱除完全；5CN112625106A说　明　书3/10页[0011]S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc‑氨基酸(Fmoc‑AA)、1‑羟基苯并三氮唑 (HOBt)、O‑苯并三氮唑‑N,N,N’,N’‑四甲基脲‑六氟磷酸脂(HBTU)，加入少量DMF 完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺(DIEA)充分混匀得到活化氨基酸，将活化氨基酸立即加入到步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，在氩气保护条件下搅拌进行缩合反应；反应结束后减压滤去反应液，用10mL的DMF洗涤减压抽干后茚检，如树脂显淡黄色透亮表明缩合反应完全；[0012]S4、肽链的延长：不断重复步骤S2和步骤S3，对同一制品按照[Sar2]‑MPI的序列由羧基末端向氨基末端的顺序，依次加入相应的Fmoc‑AA进行缩合，直至制品中所有氨基酸连接完毕；[0013]S5、将S4得到的制品按照步骤S2脱去肽链N‑末端最后一个氨基酸的Fmoc保护基后，用DMF洗涤4次，每次3min，减压抽干后茚检；[0014]S6、多肽的裂解：将S5得到的制品依次用DCM和甲醇交替洗涤树脂3次，每次3 min；密封合成仪，真空抽干2小时以上至树脂完全干燥；加入10mL裂解试剂，室温反应3h，期间每隔20min搅拌1min；反应完后收集裂解试剂，另外用5mL的TFA 洗涤两次，每次5min；合并裂解试剂与滤液，用旋转蒸发仪减压除去裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡进行沉淀，静置后除去上清；沉淀用水充分溶解后用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，经冷冻干燥后得到白色固体粉末状粗肽；[0015]S7、粗肽的纯化：粗肽选用Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱，以20％的乙酸溶液为流动相进行脱盐，用核酸蛋白紫外检测仪在254nm监测并收集主峰，经冷冻干燥后用于进一步高效液相色谱纯化，选用Waters XBridge BEH130 Prep C18反相柱(10μm， 19×250mm)，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系按照20％‑80％/60min梯度洗脱，在 220mm处收集主峰，冷冻干燥后可得到纯的白色固体粉末即为多肽化合物[Sar2]‑MPI。[0016]优选的，步骤S1中加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌30min。[0017]优选的，步骤S3中在氩气保护条件下搅拌1h进行缩合反应。[0018]优选的，步骤S1、步骤S2和步骤S3中用DMF洗涤4次，每次2min。[0019]优选的，步骤S5中的裂解试剂组分比为Tis:TFA:H2O＝25:95:2.5。[0020]本发明提供了一种以[Sar2]‑MPI为活性成分在制备抗菌药物中的应用。[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明使用了所有类肽氨基酸中结构最为简单、成本较低且的N‑甲基甘氨酸(肌氨酸，Sarcosine，Sar)对抗菌肽中的氨基酸逐个扫描和替换，分析替换后类似物的血浆稳定性，通过这种更为系统的扫描和筛选方法，在更接近生理环境下，找到多肽序列中影响体内稳定性的关键位点。我们应用这种策略对polybia‑MPI进行了逐个扫描和替换，同时对替换后的类似物进行了稳定性、体内体外抗菌活性、毒副作用的筛选和作用机制研究，以获得稳定性和抗菌活性提高而毒性降低的新型抗菌药物。附图说明[0022]图1为polybia‑MPI的Sar扫描类似物的血浆稳定性图；[0023]图2为[Sar2]‑MPI的血浆稳定性图；[0024]图3为[Sar2]‑MPI对小鼠血红细胞的体外溶血活性图；6CN112625106A说　明　书4/10页[0025]图4为[Sar2]‑MPI对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7的细胞毒性图；[0026]图5为[Sar2]‑MPI的体内抗菌活性图；[0027]图6为[Sar2]‑MPI作用后E.coli 25922经PI染色后的激光共聚焦图；[0028]图7为SEM观察[Sar2]‑MPI作用后E.coli 25922的形态学变化图；[0029]图8为[Sar2]‑MPI对E.coli 25922的诱导耐药作用图。具体实施方式[0030]下面将对本发明实施例中的技术 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有创造性成果的前提下获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0031]Sar逐个位点扫描polybia‑MPI类似物的合成[0032]本发明中Sar逐个位点扫描的抗菌肽polybia‑MPI类似物的合成，首先设计化合物，然后在MBHA树脂上，通过经典的Fmoc保护策略的固相多肽合成方法采用逐个接长法合成，其具体合成步骤如下：[0033]S1、树脂预处理：称取MBHA树脂(取代值0.43mmol/g)0.3mmol加入合成仪中，加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌30min，使树脂充分溶胀后减压抽干。用 DMF洗涤4次，每次2min，减压抽干，然后挑取少量树脂置于试管进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常。[0034]S2、脱Fmoc保护：氩气保护条件下，在合成仪中加入20％体积比的哌啶的DMF 溶液10mL，搅拌3min后减压抽干，重复2次。用10mL的DMF洗涤4次，每次2min，减压抽干后茚检，当树脂颜色为蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱除完全。[0035]S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc‑氨基酸(Fmoc‑AA)、1‑羟基苯并三氮唑 (HOBt)、O‑苯并三氮唑‑N,N,N’,N’‑四甲基脲‑六氟磷酸脂(HBTU)，加入少量DMF 完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺(DIEA)充分混匀得到活化氨基酸，将活化氨基酸立即加入到步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，在氩气保护条件下搅拌进行缩合反应；反应结束后减压滤去反应液，用10mL的DMF洗涤减压抽干后茚检，如树脂显淡黄色透亮表明缩合反应完全。[0036]S4、肽链的延长：不断重复步骤S2、S3，对同一制品按照多肽序列由羧基末端向氨基末端的顺序，依次加入相应的Fmoc‑AA进行缩合，直至制品中所有氨基酸连接完毕。[0037]S5、将S4得到的制品按照步骤S2脱去肽链N‑末端最后一个氨基酸的Fmoc保护基后，用DMF洗涤4次，每次3min，减压抽干后茚检；[0038]S6、多肽从树脂上裂解：依次用DCM和甲醇交替洗涤树脂3次，每次3min。密封合成仪，真空抽干2小时以上至树脂完全干燥。加入10mL裂解试剂(Tis:TFA:H2O ＝25:95:2.5)，室温反应3h，期间每隔20min搅拌1min。反应完后收集裂解试剂，另外用5mL的TFA洗涤两次，每次5min。合并裂解试剂与滤液，用旋转蒸发仪减压除去裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡进行沉淀，静置后除去上清。沉淀用水充分溶解后用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，经冷冻干燥后得到白色固体粉末状粗肽类似物。[0039]S7、Sar逐个位点扫描polybia‑MPI类似物的纯化：粗肽选用Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱，以20％的乙酸溶液为流动相进行脱盐，用核酸蛋白紫外检测仪在254nm 监测并收集主峰，经冷冻干燥后用于进一步高效液相色谱纯化。选用Waters XBridgeBEH130 7CN112625106A说　明　书5/10页Prep C18反相柱(10μm，19×250mm)，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系按照20％‑80％/60min梯度洗脱，流速为8mL/min，在220mm处收集主峰，冷冻干燥后可得到纯的白色固体粉末即为Sar扫描的polybia‑MPI类似物。[0040]S8、Sar逐个位点扫描polybia‑MPI类似物的纯度分析与表征：选用Waters SunFireC18反相分析柱(10μm，4.6×250mm)，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系按照 10％‑90％/30min梯度洗脱，流速为1mL/min，计算多肽纯度并确定保留时间。另取少量纯化后的类似物用Bruker maXis 4G离子电喷雾质谱(ESI‑MS)进行表征。上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致，其理化特征见表1。[0041]表1 Sar逐个位点扫描polybia‑MPI类似物的序列与理化性质[0042][0043][0044]a：多肽的理论计算分子质量[0045]b：质谱表征多肽实际测得的分子质量[0046]Sar逐个位点扫描polybia‑MPI类似物的血浆稳定性分析[0047]实验方法：健康昆明系雌性小鼠，摘眼球取血，将血液收集至含100μL肝素钠溶液8CN112625106A说　明　书6/10页(2mg/mL)的1.5mL离心管中，4℃静置12h，3000rpm离心15min，吸取上清即为血浆。polybia‑MPI类似物用生理盐水配制成10mM溶液，按照285μL血浆+15μL polybia‑MPI类似物溶液的比例混匀(其中polybia‑MPI类似物含量为5％)。混合后分别在0min、30min、60min、120min、180min、240min时间点分别取样40μL，立即加入等体积冰乙腈终止反应，13000×g离心15min，吸取上清进行HPLC分析。HPLC 所用反相分析柱为Waters SunFire C18(5μm，4.6×250mm)，洗脱体系为5％‑95％乙腈 /水/0.1％三氟乙酸洗脱30min，流速为1mL/min。根据polybia‑MPI类似物的分析谱图和含量计算酶解率，计算公式如下：[0048]酶解率＝1‑(各时间点峰面积/0min峰面积)×100％[0049]实验结果：稳定性分析结果如图1所示，[Sar1]‑MPI、[Sar2]‑MPI、[Sar3]‑MPI、 [Sar11]‑MPI、[Sar12]‑MPI、[Sar13]‑MPI的稳定性相比polybia‑MPI明显提高，可以初步推测polybia‑MPI体内的主要蛋白酶敏感位点可能是其1位、2位、3位、11位、12位和 13位。[0050]抗菌多肽化合物的合成，即抗菌多肽[Sar2]‑MPI的合成[0051]S1、树脂预处理：称取MBHA树脂(取代值0.43mmol/g)0.3mmol加入合成仪中，加入10mL重蒸无水二氯甲烷(DCM)搅拌30min，使树脂充分溶胀后减压抽干。用 DMF洗涤4次，每次2min，减压抽干，然后挑取少量树脂置于试管进行茚检，茚检颜色无改变表明树脂正常。[0052]S2、脱Fmoc保护：氩气保护条件下，在合成仪中加入20％体积比的哌啶的DMF 溶液10mL，搅拌3min后减压抽干，重复2次。用10mL的DMF洗涤4次，每次2min，减压抽干后茚检，当树脂颜色为蓝紫色，表明Fmoc保护基已脱除完全。[0053]S3、缩合反应：各称取0.9mmol的Fmoc‑氨基酸(Fmoc‑AA)、1‑羟基苯并三氮唑 (HOBt)、O‑苯并三氮唑‑N,N,N’,N’‑四甲基脲‑六氟磷酸脂(HBTU)，加入少量DMF 完全溶解，再加入1.8mmol的二异丙基乙基胺(DIEA)充分混匀得到活化氨基酸，将活化氨基酸立即加入到步骤S2得到的含有已脱保护树脂的合成仪中，在氩气保护条件下搅拌进行缩合反应；反应结束后减压滤去反应液，用10mL的DMF洗涤减压抽干后茚检，如树脂显淡黄色透亮表明缩合反应完全。[0054]S4、肽链的延长：重复步骤S2和S3，对同一制品按照[Sar2]‑MPI的序列由羧基末端向氨基末端的顺序，依次加入相应的Fmoc‑AA进行缩合，直至制品中所有氨基酸连接完毕。[0055]S5、将S4得到的制品按照步骤S2脱去肽链N‑末端最后一个氨基酸的Fmoc保护基后，用DMF洗涤4次，每次3min，减压抽干后茚检；[0056]S6、多肽的裂解：依次用DCM和甲醇交替洗涤树脂3次，每次3min。密封合成仪，真空抽干2小时以上至树脂完全干燥。加入10mL裂解试剂(Tis:TFA:H2O＝25: 95:2.5)，室温反应3h，期间每隔20min搅拌1min。反应完后收集裂解试剂，另外用5mL的TFA洗涤两次，每次5min。合并裂解试剂与滤液，用旋转蒸发仪减压除去裂解试剂及TFA，加入预先冷却的乙醚并用力振荡进行沉淀，静置后除去上清。沉淀用水充分溶解后用分液漏斗萃取除去乙醚，收集水相，经冷冻干燥后得到白色固体粉末状 [Sar2]‑MPI粗肽。[0057]S7、[Sar2]‑MPI的纯化：[Sar2]‑MPI粗肽选用Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱，以 20％的乙酸溶液为流动相进行脱盐，用核酸蛋白紫外检测仪在254nm监测并收集主峰，经冷冻干燥后用于进一步高效液相色谱纯化。选用Waters XBridge BEH130 Prep C18反相柱(10μm，19×250mm)，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系按照20％‑80％/60min 梯度洗脱，流速为8mL/min，在220mm处收集主峰，冷冻干燥后可得到纯的白色固体粉末即为[Sar2]‑9CN112625106A说　明　书7/10页MPI，纯度95％以上，收率为60％。[0058]S8、[Sar2]‑MPI的纯度分析与表征：选用Waters SunFire C18反相分析柱(10μm， 4.6×250mm)，用含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系按照10％‑90％/30min梯度洗脱，流速为1mL/min，计算[Sar2]‑MPI的纯度并确定保留时间。另取少量纯化后的[Sar2]‑MPI 用Bruker maXis 4G离子电喷雾质谱(ESI‑MS)进行表征。上述方法制备的[Sar2]‑MPI 的经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致，其理化特征见表1.[0059]对上述抗菌多肽化合物即[Sar2]‑MPI的血浆稳定性进行分析[0060]实验方法：健康昆明系雌性小鼠，摘眼球取血，将血液收集至含100μL肝素钠溶液(2mg/mL)的1.5mL离心管中，4℃静置12h，3000rpm离心15min，吸取上清即为血浆。[Sar2]‑MPI用生理盐水配制成10mM溶液，按照285μL血浆+15μL[Sar2]‑MPI 溶液的比例混匀(其中[Sar2]‑MPI含量为5％)。混合后分别在0min、30min、60min、 120min、180min、240min时间点分别取样40μL，立即加入等体积冰乙腈终止反应， 13000×g离心15min，吸取上清进行HPLC分析。HPLC所用反相分析柱为Waters SunFire C18(5μm，4.6×250mm)，洗脱体系为5％‑95％乙腈/水/0.1％三氟乙酸洗脱30min，流速为1mL/min。根据[Sar2]‑MPI的分析谱图和含量计算酶解率，计算公式如下：[0061]酶解率＝1‑(各时间点峰面积/0min峰面积)×100％[0062]实施结果：稳定性分析结果如图2，可以看出[Sar2]‑MPI的稳定性相比polybia‑MPI 有了显著提高。[0063]对上述抗菌多肽化合物即[Sar2]‑MPI的盐稳定性进行分析[0064]人体内存在大量无机盐离子，会不同程度影响抗菌肽的抗菌活性，为了检测 [Sar2]‑MPI在生理环境下是否能稳定的发挥抗菌作用，我们模拟体内环境检测了 [Sar2]‑MPI在不同盐离子环境下对E.coil(ATCC 25922)的抗菌活性，采用盐溶液为150 mMNaCl、4.5mM KCl、6μM NH4Cl、2mM CaCl2。[0065]实验方法：挑取细菌单克隆于已灭菌的3mLMH培养基中，37℃条件下，180rpm 摇床培养5‑6h至菌液浓度达到108‑109CFU/mL。将菌液用已灭菌MH培养基稀释至 1×106CFU/mL的工作菌液，同时根据二倍稀释法将[Sar2]‑MPI稀释至1‑128μmol/L浓度梯度。以MH肉汤为阴性对照，分别取不同浓度[Sar2]‑MPI溶液50μL加入96孔板中，然后加入50μL工作菌液和50μL盐溶液，每组设3个平行，混匀后置于37℃恒温培养箱孵育12‑14h，以肉眼可见的菌液完全澄清的孔对应的[Sar2]‑MPI浓度为MIC值。[0066]实验结果：如表2所示，[Sar2]‑MPI的抗菌活性未受钠盐、钾盐和铵盐影响，且优于polybia‑MPI，说明[Sar2]‑MPI在模拟体内的盐离子环境下较为稳定。[0067]表2不同盐离子环境中[Sar2]‑MPI的抗菌活性[0068][0069]对上述抗菌多肽化合物即[Sar2]‑MPI的体外抗菌活性进行分析[0070]采用肉汤微量稀释法，通过检测药物对革兰氏阳性菌和革兰氏阳性菌的最小抑菌10CN112625106A说　明　书8/10页浓度(MIC)来评价抗菌活性。[0071]实验方法：挑取细菌单克隆于已灭菌的3mLMH肉汤培养基中，37℃条件下，180 rpm摇床培养5‑6h至菌液浓度达到108‑109CFU/mL。将菌液用已灭菌MH培养基稀释至1×106CFU/mL的工作菌液，同时根据二倍稀释法将[Sar2]‑MPI稀释至1‑128μmol/L 浓度梯度。以MH肉汤为阴性对照，分别取不同浓度[Sar2]‑MPI溶液100μL加入96孔板中(每组设3个平行)，然后加入100μL工作菌液，混匀后置于37℃恒温培养箱孵育12‑14h，以肉眼可见菌液无明显浑浊的孔对应的浓度为MIC值。[0072]实验结果：如表3所示，polybia‑MPI对所有测试菌株都表现出了一定的抑菌活性，而[Sar2]‑MPI无论是对革兰氏阴性菌如大肠杆菌(E.coliATCC 25922)、肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniaeATCC 700603)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa ATCC 27853)，还是对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis ATCC 23857)的抗菌活性有了非常显著的提高，表现出较为理想的抗菌活性。[0073]表3 polybia‑MPI和[Sar2]‑MPI的最小抑菌浓度(MIC)[0074][0075]对上述抗菌多肽化合物即[Sar2]‑MPI的溶血副作用进行分析[0076]抗菌肽常见的的毒副作用主要表现为溶血活性，因此通过测定[Sar2]‑MPI对小鼠血红细胞的的溶血率来评估其毒副作用。[0077]实验方法：摘眼球取血，收集健康昆明雌鼠血液至含有200μL肝素钠(2mg/mL) 溶液的离心管中，1000g离心10min，弃去血清后收集血红细胞。用PBS缓冲液轻洗血红细胞3遍，离心收集，并用PBS将其稀释为8％的血红细胞悬液，按照每孔100μL 加入96孔板。然后加入不同浓度(12.5‑200μM)的[Sar2]‑MPI溶液，同时分别以PBS 和0.1％的Triton X‑100作为阴性和阳性对照，恒温培养箱37℃孵育1h后，将96孔板在1200g离心10min，然后收集上清，用酶标仪读取450nm吸光值。实验独立重复三次以上，并采用以下公式计算溶血率：[0078]溶血率(％)＝(OD实验组–OD阴性对照)/(OD阳性对照–OD阴性对照)×100％[0079]实验结果：如图3所示，[Sar2]‑MPI在药物浓度达到200μM时，溶血率始终低于 10％，相比polybia‑MPI降低了6倍，表现出极低的毒副作用。[0080]对上述抗菌多肽化合物即[Sar2]‑MPI的细胞毒性进行分析[0081]已发现的许多抗菌肽虽然有很好的抗菌活性，但是对宿主细胞也存在着较高的毒性，为了评估[Sar2]‑MPI对哺乳动物细胞的毒性，通过MTT法测定了[Sar2]‑MPI作用后小鼠单核巨噬细胞(RAW 264.7)的存活率。[0082]实验方法：MTT法测定[Sar2]‑MPI作用后RAW 264.7细胞的存活率。具体步骤为：按照细胞密度为1×104个/孔将RAW 264.7细胞种植于96孔板中，37℃于5％CO2培养箱孵育6h，加入用DMEM配制的不同浓度(6.25‑100μM)的[Sar2]‑MPI溶液100μL，培养箱孵育1h，然后避光每孔加入10μL MTT，培养箱继续孵育4h。移除含MTT的培养液，加入150μL二甲基亚砜，充分振荡混匀，最后用酶标仪测定其在490nm和570 nm处的吸光值。实验独立重复三次11CN112625106A说　明　书9/10页以上，并用以下公式计算细胞存活率：[0083]存活率(％)＝OD实验组/OD对照组[0084]实验结果：如图4所示，RAW 264.7细胞存活率随polybia‑MPI浓度的升高逐渐下降，在100μM时仅为5.5％，而6.25‑50μM的[Sar2]‑MPI处理后，RAW 264.7细胞存活率均接近90％，在药物浓度达到100μM时，细胞存活率仍然是polybia‑MPI的5倍。说明[Sar2]‑MPI对正常细胞的毒性相比polybia‑MPI显著降低。[0085]对上述抗菌多肽化合物即[Sar2]‑MPI的体内抗菌活性进行分析[0086]通过建立小鼠腹腔感染模型来检测[Sar2]‑MPI的体内抗菌活性[0087]实验方法：6‑8周龄雌性昆明系小鼠，分给药组、阴性对照组和阳性对照组，每组 6只，适应性饲养一周左右至体重达到19‑21g。挑取E.coli(ATCC 25922)单克隆至盛有20mLMH培养基的三角瓶中，37℃恒温摇床180rpm振荡过夜，用生理盐水稀释至工作菌液浊度0.8×107CFU/g，小鼠腹腔注射100μL/只，感染1h后给药。用生理盐水配制浓度为5mg/kg的[Sar2]‑MPI和polybia‑MPI，以及浓度2.5mg/kg的硫酸卡那霉素作为阳性对照，小鼠腹腔注射100μL/只，并以生理盐水为阴性对照。给药1h后眼球取血10μL，生理盐水稀释10倍后滴加到MH平板并涂布均匀，37℃恒温培养16‑18h。然后观察平板，数出菌落数，并记录结果。实验独立重复三次以上。[0088]实验结果：如图5所示，小鼠腹腔感染E.coli(ATCC25922)后，用阳性对照硫酸卡那霉素可以抑制约1个数量级的菌量，用polybia‑MPI能抑制0.5个数量级的菌量。而用[Sar2]‑MPI治疗能抑制约0.8个数量级的菌量，表明[Sar2]‑MPI在体内仍然有很好的抑制E.coli(ATCC 25922)的活性，明显优于polybia‑MPI。[0089]碘化丙啶(PI)摄取实验[0090]碘化丙啶(PI)在细胞膜受到损伤后，能够进入细胞并与DNA结合发出红色荧光，因此PI摄取实验可以检测[Sar2]‑MPI对细胞膜的破坏作用。[0091]实验方法：挑取E.coli(ATCC 25922)细菌单克隆于已灭菌的3mL MH肉汤培养基中，37℃条件下，180rpm摇床培养5‑6h至对数生长期。将菌液用已灭菌MH培养基稀释至2×108CFU/mL的工作菌液，1000×g离心10min后用已灭菌PBS清洗两次，然后用PBS重悬，并加入等体积的5MIC浓度的[Sar2]‑MPI，37℃恒温培养1.5h，避光条件下加入20μL PI(浓度100μg/mL)，室温染色10min，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。[0092]实验结果：如图6所示，[Sar2]‑MPI与E.coli(ATCC 25922)共孵育，短时间内都能引起细胞膜破裂，导致PI进入细胞内结合DNA而染色。说明抗菌多肽[Sar2]‑MPI具有细胞膜裂解能力，可以通过破坏细胞膜而导致细菌死亡。[0093]扫描电镜(SEM)观察[Sar2]‑MPI作用后细菌的形态学改变[0094]通过扫描电镜(SEM)可直接观察[Sar2]‑MPI作用后E.coil(ATCC 25922)的形态学变化以判断其作用机制。[0095]实验方法：挑取E.coli(ATCC 25922)细菌单克隆于已灭菌的5mL MH肉汤培养基中，37℃条件下，180rpm摇床振荡过夜培养至对数生长期。将菌液用已灭菌MH培养基稀释至2×108CFU/mL的工作菌液，1000×g离心10min后用已灭菌PBS清洗两次，然后用PBS重悬，并加入等体积的5MIC浓度的[Sar2]‑MPI，37℃恒温培养1.5h，10000 rpm离心5min后移除上清，加入1mL4％戊二醛固定。4℃静置12h后1000×g离心 10min，移除清液后用已灭菌PBS清12CN112625106A说　明　书10/10页洗两次。然后分别用20％、50％、80％、100％的乙醇进行梯度脱水，每个浓度脱水10min，脱水后均以1000×g离心10min。最后以少量 100％乙醇悬浮沉淀后，将混合物滴加到圆形载玻片上，待无水乙醇挥发后，置于超低温冷冻干燥机中干燥5h，然后扫描电镜观察并拍照。[0096]实验结果：如图7所示，[Sar2]‑MPI与E.coli(ATCC 25922)共孵育1.5h后，可以在扫描电镜下观察到受试菌株表面皱缩，杆状形态发生变化，并伴有膜结构的明显损伤，充分说明[Sar2]‑MPI是通过膜裂解机制发挥作用。[0097][Sar2]‑MPI的诱导耐药作用[0098]抗生素的长期应用是细菌多药耐药性产生的主要原因，因此是否容易引起耐药也是评价新型抗生素的重要指标之一。为了研究[Sar2]‑MPI是否会引起细菌产生耐药，以硫酸卡那霉素为阳性对照，对[Sar2]‑MPI进行了诱导耐药实验。[0099]实验方法：首先测试硫酸卡那霉素和[Sar2]‑MPI对E.coli(ATCC 25922)的MIC值，然后分别将[Sar2]‑MPI和硫酸卡那霉素1/2MIC浓度所对应的三个平行副孔中的菌液转移至1.5mL离心管中，吹打混匀后接种于盛有3mL新鲜MH液体培养基的试管中，37℃条件下180rpm振荡培养5‑6h至对数期，用于随后的MIC实验。以此连续重复20天，实验独立重复三次以上。[0100]实验结果：如图8所示，连续二十天诱导耐药实验后，阳性对照硫酸卡那霉素的 MIC值由最初的8μM上升到128μM，MIC值增加了16倍。而在同等条件下，[Sar2]‑MPI 的MIC值始终在4μM到8μM之间波动，说明[Sar2]‑MPI相比常规抗生素不易引起耐药性的产生。[0101]综上所述，本发明利用结构最简单的类肽氨基酸Sar对抗菌肽进行系统性的稳定性扫描，研究影响抗菌肽体内稳定性的关键位点。并用此方法筛选得到了一种基于抗菌肽 polybia‑MPI的高稳定性抗菌多肽化合物[Sar2]‑MPI，其对革兰氏阴性菌和阳性菌均有显著的抗菌活性，同时对正常细胞毒性和溶血副作用较低。[Sar2]‑MPI可以通过膜裂解机制发挥抗菌活性，且不易引起细菌产生耐药性，同时[Sar2]‑MPI在小鼠腹膜炎模型中表现出良好的体内抗菌活性，在制备新型抗菌药物中具有很好的应用价值。[0102]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。13CN112625106A说　明　书　附　图1/4页图1图214CN112625106A说　明　书　附　图2/4页图3图415CN112625106A说　明　书　附　图3/4页图5图616CN112625106A说　明　书　附　图4/4页图7图817