张参制药工程14221010772DiscoveryofaNovelSmallMoleculeInhibitorTargetingtheFrataxin/UbiquitinInteractionviaStructure-BasedVirtualScreeningandBioassays一个抑制共济蛋白泛素化的新型小分子抑制剂的发现——基于结构的虚拟筛选和生物测定一、研究背景：1、有关弗里德赖希共济失调症（FRDA）弗利特里希氏共济失调症是一种常染色体隐性遗传的神经变性紊乱，由一种控制铁元素稳态的线粒体共济蛋白的部分还原引起。弗利特里希氏共济失调症是美国和欧洲最常见的遗传性共济失调症，其发病率估计在1:30000到1:50000之间。这种神经疾病的主要特征是影响中枢和周围神经，导致神经节的初等感觉神经元死亡并并伴有一系列神经学症状。虽然发病时间高度不统一，还会因为不明原因的部分延迟，这些在出生时和幼儿期表现正常的患者大部分通常在20岁左右出现这类症状。弗利特里希氏共济失调症的主要病因是人体失调症基因的第一个内含子的GAA异常复制膨胀，抑制了转录，导致大量酶缺失（也包括共济蛋白），线粒体功能紊乱，以及氧化性功能损伤。目前仍然没有能延缓病情的药物治疗。2、有关共济蛋白（Frataxin）共济蛋白在细胞核中编码，在细胞质中合成，并作为先导多肽（共济蛋白1-210）被转移全线粒体基质，被蛋白酶修饰成中间体（共济蛋白41-210），最终形成成熟形式（共济蛋白81-210）。目前认为共济蛋白在线粒体基质中被加工成成熟体，没有发现其在线粒体内的其他后加工程序。最近，人们在人类干细胞的几种细胞类型的细胞质中发现了大量成熟共济蛋白，它参与了多种生物功能。这里我们报道了一种。二、提出问题最近很多研究发现说明了共济蛋白先导物和成熟体聚集体通过泛素-蛋白酶体通路系统（UPS）的直接调控作用。因此，找到促进共济蛋白稳定的小分子抑制剂成为需要并有潜在的治疗价值，具体来说，便是设法找到能阻止共济蛋白泛素化、降解并能提高细胞内共济蛋白聚集体含量的小分子化合物。三、解决问题（研究思路）1、使用HADDOCK（high-ambiguity-drivendocking）软件创建共济蛋白/泛素相互作用的计算机模型（一种广泛使用的研究结构生物学的蛋白-蛋白相互偶联的软件）。使用国家癌症研究机构（NCI）的公开数据，通过基于多级结构的虚拟筛选，推测共济蛋白与泛素的结合域。2、通过基于结构的虚拟筛选和基于细胞的检测，我们发现了一种新型的小分子（化合物（土）-11），其右旋体可以有效地防止frataxin泛素化和退化。3、合成及拆分化合物（土）-11。四、结果1、证实共济蛋白的稳定性是受泛素-蛋白酶体通路系统（UPS）的控制（研究模型为人肺退行性癌细胞（CALU-6细胞））。以蛋白酶体抑制剂硼替佐米作为参照物质，应用SDS-PEGE电泳和Western-bloting免疫印迹技术发现了一种可以显著提高共济蛋白前提含量的物质一一MG132。具体实验过程和图示结果参见原文。2、利用HADDOCK软件生动创建共济蛋白和泛素作用的计算机模型，体现其具体作用位点，如泛素的羧基端残基G76和共济蛋白氨基端残基K147的相互作用。具体操作及结果见原文。图一、共济蛋白和泛素的结合模型3、为了阻止共济蛋白和泛素的结合，需要筛选出能够靶向于共济蛋白-泛素体系的小分子抑制剂。利用国家癌症研究机构（NCI）的公开数据库（规模约26万)进行虚拟筛选。具体
方案
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和操作见原文，
流程
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图如下:NCIDatabase>26007165375NCILead-likecompoundsRemovenonlead-likecompounds(FILTER)Generatetautomers/ProtonationStates(LIGPREP)90653structuresHigh-throughputDocking(GlideHTVS)GlideHTVS:5%4532compoundsDocking(GlideSP)GlideSP:5%226compoundsAutoDockDockingExperimentallyTested图二、利用NCI进行虚拟筛选的流程最终得到13个有效化合物，对这些化合物利用Calu-6细胞进行进一步筛选(具体方法及步骤见原文)，最终得到在阻止共济蛋白泛素化上最有效的化合物(±)-6-((2,3-dimethoxyphenyl)(4-morpholinyl)-methyl)-1,3-benzodioxol-5-ol即化合物(±)-11。是消旋体。13N$C137976图三、13个有效的小分子化合物的结构式及其编号4、对化合物（±）-11的合成及拆分，并分别检测异构体在CALU-6细胞模型中对共济蛋白含量增加的作用。最后发现化合物11的右旋体为有效化合物。图四、化合物11的合成图五、化合物11的拆分4、利用计算机软件构建化合物11的右旋体作用于共济蛋白/泛素结合体的模型图，具体过程见原文，如下（黄色部分为化合物11的右旋体）：图六、合物11的右旋体作用于共济蛋白/泛素结合体的模型图五、总结简而言之，本实验的研究思路便是在已知病因（靶点）的基础上利用基于化合物库的虚拟筛选和细胞检测找寻出抑制病因的小分子抑制剂，此为主思路，在此之外，利用合适的计算机软件构建蛋白分子间的作用机制模型以及对小分子化合物的合成及拆分（运用到药物合成的知识和技术），试验中用到了细胞检测技术、电泳技术、免疫印迹技术等。给我最大的感受是科研中思路（出发点）探明之后，要善于利用计算机，此处体现在化合物数据库、软件的应用等方面。
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