杀虫药剂抗性机制——乔传令

杀虫剂抗性及其进化机制乔传令中国科学院动物研究所虫鼠害综合治理研究国家重点实验室报告提纲报告提纲••杀虫药剂抗性简介杀虫药剂抗性简介••杀虫药剂抗性机制综述杀虫药剂抗性机制综述••抗性监测抗性监测••将来的方向将来的方向一、杀虫药剂抗性简介一、杀虫药剂抗性简介什么什么叫抗性？叫抗性？••害虫对某中杀虫药剂的抗药害虫对某中杀虫药剂的抗药力较原来正常情况下有明显力较原来正常情况下有明显增加的现象，其特点是这种增加的现象，其特点是这种由使用药剂而增大的抗药力，由使用药剂而增大的抗药力，是可以遗传的。是可以遗传的。杀虫药剂抗性、杀虫药剂抗性、耐受性•抗性、昆虫和其他的节肢动物均可以通过遗传的或/和其他的渠道对化学合成的杀虫药剂，生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 的杀虫药剂获得的抗性;•杀虫药剂的耐受性是一自然的趋势、是由于发育阶段、营养和条件引起的。杀虫药剂抗性的历史杀虫药剂抗性的历史•在DDT生产应用的1年以后就发现了家蝇对DDT的抗性;•至今已经发现至少至少有540多种节肢动物对一种药剂或杀螨剂产生抗药性(Clark&Yamaguchi,2002);•美国1年应用的杀虫药剂~$40million，由于抗药性减产>$1billion（十亿）(InsecticideResistanceActionCommittee,2001).昆虫的抗药性昆虫的抗药性WalsmsenMatin2003,Nature.???杀虫药剂抗性杀虫药剂抗性抗性的产生引对以下的害虫均产生了一系列的防治方面的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 杀虫药剂抗性机制杀虫药剂抗性机制•代谢抗性:代谢作用的增强•多功能氧化酶（p450)•酯酶(马拉硫磷特异性的羧酸酯酶和磷酸三酯酶)•谷胱甘肽-S-转移酶•DDT酶?二、杀虫药剂抗性机制二、杀虫药剂抗性机制昆虫抗性主要机理昆虫抗性主要机理•• 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 皮穿透速率降低：涉及各类杀虫剂；表皮穿透速率降低：涉及各类杀虫剂；••代谢增强：多功能氧化酶（代谢增强：多功能氧化酶（MFOMFO）；）；水解水解酶；谷光苷肽转移酶（酶；谷光苷肽转移酶（GSTGST）；）；脱氯化氢酶脱氯化氢酶（（DDTaseDDTase）；）；••击倒抗性击倒抗性((knockdownknockdownresistance,resistance,kdrkdr))••靶标部位敏感度降低：乙酰胆碱酯酶靶标部位敏感度降低：乙酰胆碱酯酶（（AchEAchE）；）；神经敏感度降低（神经敏感度降低（NaNa++通道）；通道）；神经前突触敏感度降低（神经前突触敏感度降低（GABAGABA）。）。家蝇(Mscadomestica)野生种群kdr基因频率的测定：—kdr基因频率和拟除虫菊酯抗性的相关性拟除虫菊酯抗性拟除虫菊酯抗性••增加对拟除虫菊酯的代谢：增加对拟除虫菊酯的代谢：P450P450、、CaEsCaEs、、GSTsGSTs••击倒抗性击倒抗性((knockdownknockdownresistance,resistance,kdrkdr))由于昆虫神经系统对拟除虫菊由于昆虫神经系统对拟除虫菊酯类药物敏感性降低引起的，代谢酯类药物敏感性降低引起的，代谢性增效剂不能对其抗性产生抑制作性增效剂不能对其抗性产生抑制作用用para同源钠离子通道与抗性突变Kdr:Vssc1L1014FSuper-kdr:Vssc1L1014F,M918TCutoffRF=10andRF=25家蝇野生种群家蝇野生种群StrainPYR:pbo(1:5)BRM:pbo(1:5)381b342594i244662g1436790b2587791a2544LDLD793a4950797a91550798a65抗性倍数抗性倍数799a45800a2998801a53802a1240806a68807a612等位基因特异性型kdr突变(L1014FPCR)基因分3'280bp(kdrallele)kdr2ATTCTAentkdr3kdr4450bp280bp200bpkdr1kdr/kdr200bp(wildtype450allele)bpcontrolfragmkdr/susAkdr/kdr5'sus/suskdr/kdrBkdr/kdrMarkerStrainN观测数观测数观测数Kdr基H.W.kdr/kdrkdr/sussus/sus因频率χ2WHO2000200.00381b35494230.5617.9594i2541224180.503.93662g4939910.890.30*790b5451300.970.04*791a5451300.970.04*793a51162870.590.91*797a54302130.750.07*798a531029140.460.54*799a54736110.466.27800a5453100.990.00*801a531422170.471.48*802a5451300.970.04*806a53292130.750.10*807a54202590.600.06*各家蝇种群中拟除虫菊酯击倒抗性kdr等位基因和sus等位基因及其Hardy-Weinberg遗传平衡方差检测(P=0.05;χ2=3.84)Kdr等位基因频率和特定农药浓度下家蝇存活率的相关性(160ngPYR:pbo(1:5)或320ngBRM:pbo(1:5))100PYR:pboBRM:pboPYR:pbor=0.9275BRM:pbor=0.94，5025Frequencyofsurvivors(%)00.000.200.400.600.801.00FrequencyofkdrHuangJ.2004,JouralofEconomicEntomology.97(3):1036-41.结论结论•设计了一种简便可行的检测突变等位基因的方法－PASA；•Kdr基因频率与家蝇死亡率成反比；•发现敏感种群中存在的高频率kdr杂合子优势；•划定高抗性家蝇种群中kdr基因频率的范围在0.89和0.90之间；•对于评估拟除虫菊酯抗性有指导意义。家蝇(Muscadomestica)乙酰胆碱酯酶基因多态性与杀虫药剂抗性乙酰胆碱酯酶变构杀虫药剂抗性••果蝇、家蝇、橄榄蝇等只有果蝇、家蝇、橄榄蝇等只有aceace--22，在，在其抗性突变较温和，因此需要较多突其抗性突变较温和，因此需要较多突变参与才能形成抗性变参与才能形成抗性；；••在蚊虫，蜘蛛螨等昆虫中发现了两种在蚊虫，蜘蛛螨等昆虫中发现了两种AChEAChE基因基因((aceace--1,1,aceace--22))，此时，此时ace2ace2并并系同源基因系同源基因aceace--11的表达产物在抗性中的表达产物在抗性中起作用，且单一突变即可形成有效抗起作用，且单一突变即可形成有效抗性。性。家蝇AChE抗性相关突变NumberinginAChEofTorpedocalifornicaReferenceStrain83151227290328CH2G/AF/Y(Walshetal.,2001)690abG/VFY49RG/ACT,YBOLI/MG/AF/Y(Kozakietal.,2001a;YBOLV/LG/VKozakietal.,2001b)D3,KashI/MV/LG/AF/Y(Huangetal.,1997)strain82180262327365NumberinginMatureAChEofMuscadomesticaHuangJ.2006,PestManagementScience.62(8):738-45.待测家蝇品系•WHO、BPM:敏感•39m2b:杀虫畏抗性，杀虫畏选择•49r2b：乐果抗性，乐果选择•381zb：多抗品系，乐果和氯菊酯选择•571ab：有机磷抗性，拟除虫菊酯敏感,杀螟硫磷筛选•594vb：甲基吡啶磷筛选•690ab：灭多威抗性，灭多威筛选•698ab：DDT抗性，DDT筛选在30nMAza,20µMMyl和70mMDim抑制后,各品系AChE的残留活性StrainnAzamethiphosMethomylOmethoate%activityremaining(±STD)WHO12510.5±5.515.3±4.311.4±4.8BPM6310.6±4.816.2±4.211.9±5.139m2b12225.0±13.328.1±12.537.2±21.249r2b6321.5±6.822.7±5.942.5±8.0381zb6328.2±4.228.5±3.755.3±4.5571ab626.7±2.834.5±17.628.9±4.5594vb636.7±19.8*43.4±25.426.9±25.0*690ab1143.2±1.163.0±5.235.8±6.5698ab6211.0±3.614.7±3.411.9±3.4HuangJ.2006,PestManagementScience.62(8):738-45.各家蝇品系AChE突变HouseflyNHousefly82180N230180262262262262327365327583365586597StrainStrainWHO2WHO2I/MBPM3BPM3I/MT/MA/DA/TL/V39m2b4G/A39m2b4I/MG/AL/V49r2b449rI/M2b4G/AG/A381zb4a381zI/Mb4aT/MG/VG/VF/YG/AF/YG/AA/T571ab4I/MV/LG/AF/Y571ab4V/LG/AF/Y594vb4bI/MT/MG/VF/YG/AA/T594vb4bG/VF/YG/A690ab*cI/MG/VF/Y690ab*cG/VF/Y698ab1I/MT/M698ab1a:2G365A/G365A,1G365/G365A,1G262/G262V,F327/F327Y,G365/G365Ab:2G262/G262V,F327/F327Y,1G262V,F327Y,1G365Ac：Walshetal2001结论••有些品系抗性表型与有些品系抗性表型与AChEAChE不敏感性并不敏感性并不相关（不相关（如，如，R2R2表型表型571ab571ab，，594vb594vb），说明），说明AChEAChE不敏感性只是抗不敏感性只是抗性机理之一；性机理之一；••家蝇家蝇AChEAChE不敏感性可分为不敏感性可分为33类，类，S,S,R1,R1,R2;R2;••AChEAChE不敏感性与突变类型高度相关不敏感性与突变类型高度相关,,如如R1R1与与G365G365，，R2R2与与G262/F327;G262/F327;••G365G365与与G262/F327G262/F327的重组率低的重组率低(1/26)(1/26)；；••为抗性治理，合理用药提供依据。为抗性治理，合理用药提供依据。中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国尖音库蚊对有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性及抗性基因的分布与进化PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平媒介蚊虫与传染病Culex库蚊属filariasis,Japaneseencephalitis,WestNilevirusAedes伊蚊属dengue,denguehemorrhagicfeverAnopheles按蚊属malariaPartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国主要的媒介蚊虫Culexpipienscomplex尖音库蚊复组分布、抗性调查最广Anophelessinensi中华按蚊Culextritaeniorhynchus三带喙库蚊Anophelesminimus微小按蚊Anophelesanthropophagus嗜人按蚊Aedesalbopictus白纹伊蚊Aedesaegypti埃及伊蚊PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫抗药性调查Resistancemonitoronvectormosquitoessince1990▲C.pipiens■An.sinensi◆C.tritaeniorhynchus●An.minimus★An.anthropophagus◎Ae.albopictus☉Ae.aegyptiPartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国蚊虫的化学防治中国蚊虫的化学防治自1997，中国杀虫剂的年生产量超过3.9×108kg，年使用量约2.5×108kg。自上世纪自上世纪5050年代中期，在中国大量的年代中期，在中国大量的化学杀虫剂应用于蚊虫防治，致使蚊化学杀虫剂应用于蚊虫防治，致使蚊虫依次对有机氯、有机磷、拟除虫菊虫依次对有机氯、有机磷、拟除虫菊酯产生抗性。酯产生抗性。PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平抗性监测中国蚊虫抗性监测的抗性比率法PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫有机氯抗性中国媒介蚊虫有机氯抗性自上世纪50年代，有机氯作为第一类化学杀虫剂在中国使用。DDT尽管已停用多年，但蚊虫对1970年占杀虫剂市场的1983年停产80.1%DDT的抗predominatingintheinsecticide性仍然存在Theirproductionwasprohibitedsince1983BHCmarket,suchas80.1%in1970PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫对有机氯抗性Cui,etal.,InsecticideresistanceofvectormosquitoesinChina,PestManagementScience,2006,PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫对有机磷抗性中国媒介蚊虫对有机磷抗性有机磷杀虫剂在中国已有有机磷杀虫剂在中国已有3030多年的使用历史多年的使用历史现在生产的有机磷有20多个品种，年生产量在1×108kg以上以上敌敌畏敌百虫马拉硫磷倍硫磷杀螟松辛硫磷对硫磷PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫对有机磷抗性Cui,etal.,InsecticideresistanceofvectormosquitoesinChina,PestManagementScience,2006,PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫对氨基甲酸酯抗性中国媒介蚊虫对氨基甲酸酯抗性••氨基甲酸酯类杀虫剂在中国的使用大约始氨基甲酸酯类杀虫剂在中国的使用大约始于于19801980年，年产量约年，年产量约55××10106kgkg。。••有十几个品种，用于蚊虫防治的主要有残有十几个品种，用于蚊虫防治的主要有残杀威和巴沙。杀威和巴沙。••媒介蚊虫中只有尖音库蚊对残杀威和巴沙媒介蚊虫中只有尖音库蚊对残杀威和巴沙的抗性监测有报道，在的抗性监测有报道，在88个省的大部分地个省的大部分地区该蚊种都是敏感的。区该蚊种都是敏感的。PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫对拟除虫菊酯抗性拟除虫菊酯类杀虫剂在近十几年大量、广泛的应用，施用面积占农药总施用面积的三分之一以上。常用于农业和公共卫生的有氯氰菊酯溴氰菊酯胺氰菊酯二氯苯醚菊酯cypermethrindeltamethrintetramethrinpermethrin甲醚菊酯丙烯菊酯氟氯氰菊酯methothrinallethrimcyhalothrin中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平中国媒介蚊虫对拟除虫菊酯抗性中国媒介蚊虫对拟除虫菊酯抗性Cui,etal.,PestManagementScience,2006,PartI中国媒介蚊虫的化学防治及抗性水平小结•中国媒介蚊虫已经对有机氯、有机磷和拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性，但仍对氨基甲酸酯类敏感。•中国的广东、湖北、山东、江西、河北、河南、江苏、云南省媒介蚊虫抗性问题比较严重。PartPartIIII中国尖音库蚊对有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性及其抗性基因的分布与进化ResearchBackgroundC.p.pipiens尖音C.p.quinquefasciatus致倦（南方）CulexpipienscomplexC.p.pallens淡色（北方）C.p.molestus骚扰Vector:WuchereriabancroftiWestNilevirusPartIIPartII蚊虫种群的抗药性水平蚊虫种群的抗药性水平2003－2004：OP>Carbamate海南、广西、广DDVP>parathion>东、湖北、浙江、chlorpyrifos>propoxur>BPMC河南、山东、辽宁south>north8省12地和北京采集27个种群27populationsofC.pipienswerecollectedin12regionsof8provincesbetween2003and2004.PartII抗性机制代谢抗性非特异性酯酶的扩增MetabolismresistanceAmplificationofcarboxylesterase靶标抗性乙酰胆碱酯酶不敏感TargetresistanceAcetylcholinesteraseinsensitivity酯酶A2与抗性•首先在坦桑尼亚发现酯酶A2/B2,后来发现发酯酶A2/B2广泛分布于亚，非，欧，美等各大洲的多个国家（Vaughanetal.,1995)。•酯酶A2和B2基因位于同一扩增区域内，在扩增的DNA分子上反向排列，中间被一段长2.2KB的片段隔开（Rookeretal.,1996）•酯酶A2和酯酶B2通过紧密连接1:1出现，酯酶A2比酯酶B2约多出3倍(Karunnaratneetal.,1994)酯酶抗性等位基因的地理分布PartIIRaymondetal.2001,GeneticaPartII酯酶抗性等位基因的分布及频率它它其其们们进进●B1化的的化●A2－B2会会进进●A8－B8带带化化来来●A9－B9机机新新●B10制制的的●A11-B11是是抗抗●B6什什性性●B7么么风风？？险险吗吗Cuietal.,2007,PestManagementScience,63,453-458？？扩增酯酶在中国的地理分布扩增酯酶在中国的地理分布Jin2A9B9A8B8B1A2B2A8B8A8B8B1Susceptible9A9B9A9BA9B9New1A2B2A2B2A9B9A9B9CComposite发现2个新的酯酶基因Twonovalgenesinthepopultions▲B1■A2-B2●A8-B8♦A9-B9☼New1◊New2□B6○B7PartIIPartII新的抗性酯酶及复合型New1(Kara2)New2(WU)compositetype(Kara3)PartII新抗性酯酶的定性、定量研究新抗性酯酶的定性、定量研究QualityQualityandandquantityquantityresearchresearchofofnewnewallelesallelesEstAEstBNew1DNA:2kbDNA:4kbcDNA:1.6kbA9NewNew2DNA:2kbDNA:2.1kbcDNA:1.6kbcDNA:1.6kbNewNewCompositeDNA:2kbDNA:2.1kb,?typeA9B9,?PartII新抗性酯酶的定性、定量研究新抗性酯酶的定性、定量研究QualityQualityandandquantityquantityresearchresearchofofnewnewallelesallelesRealTimeQuantitativePCRNew1:EstA基因未扩增New2:EstA基因扩增了36倍EstB基因扩增了2.5倍EstB基因扩增了19倍PartII酯酶基因扩增假说Est-3Est-2ABIA2-B2,A4-B4IIB1,B10IIIA11-B11I.EstA:EstB(1:1)II.仅EstB扩增III.EstA:EstB(2:1)Cuietal.,2007.InsectBiochemistryandMolecularBiology,37:1131-1137PartII酯酶等位基因同源性比较酯酶等位基因同源性比较SimilaritySimilaritybetweenbetweenesteraseesteraseallelesallelesPercentIdentityMatrix-createdbyClustalX(1.83)上半角是氨基酸序列比较，下半角是DNA序列比较PartII新抗性酯酶等位基因的抗性潜能新抗性酯酶等位基因的抗性潜能ResistanceResistancepotentialpotentialofofnewnewesteraseesteraseallelesallelesDDVPDDVPchlorpyrifoschlorpyrifosparathionparathion中、低抗性中、低抗性temephostemephosmoderateorlowfenthionfenthionresistancetrichlorfontrichlorfonphoximphoximmalathionmalathionPartII靶标抗性－不敏感的乙酰胆碱酯酶（靶标抗性－不敏感的乙酰胆碱酯酶（Ace.1Ace.1))TargetTargetresistance:resistance:insensitiveinsensitiveAChE1AChE150454035302520151050RRRSSSClu776-1Clu776-2Clu776-3Clu776-4Clu776-5Clu776-6Clu776-7Clu776-8Clu776-9Clu776-10Clu776-11Clu776-12Clu776-13Clu776-14Clu776-15Clu776-16Clu776-17Clu776-18Clu776-19Clu776-20Clu776-21Clu776-22Clu776-23Clu776-24Clu776-25Clu776-26Clu776-27Clu776-28Clu776-29在调查的在调查的2727个种群中，只有一个种群存在不敏感的个种群中，只有一个种群存在不敏感的乙酰胆碱酯酶（广州），且频率很低。乙酰胆碱酯酶（广州），且频率很低。TheTheinsensitiveinsensitiveAChE1AChE1onlyonlyexistedexistedininoneoneofof2727populations.populations.PartII乙酰胆碱酯酶不敏感的原因乙酰胆碱酯酶不敏感的原因WhyWhythetheAChE1AChE1isisinsensitiveinsensitiveAmutationG119S(GGC→→AGC)AGC)happenedhappenedininace.1gene,whichisanindependentevolutionaryevent.PartII靶标抗性－乙酰胆碱酯酶不敏感zace.1基因发生G119S(GGC→AGC)突变z中国的这个突变是一个独立进化事件InsecticideLC50(95%CI)RR(95%CI)靶标突变的抗性潜能Strain(μg/L)chlorpyrifosSR8.41(8.09-8.79)122.9(96.5-156.6)S-LAB0.068(0.066-0.071)-malathionSR1576.8(1474.7-1674.0)63.5(50.3-80.2)S-LAB24.81(23.45-26.15)-避免使用fenitrothionSR261.54(245.69-277.38)35.3(16.2-76.8)S-LAB7.42(7.00-7.72)-parathionSR40.43(37.33-44.24)32.3(24.3-43.1)S-LAB1.25(1.17-1.35)-phoximSR54.35(42.71-83.50)15.3(12.0-19.5)S-LAB3.55(3.37-3.74)-temephosSR10.93(9.97-12.18)12.6(8.7-18.2)S-LAB0.87(0.83-0.90)-fenthionSR169.87(155.28-184.61)7.2(4.7-11.0)S-LAB23.64(22.31-25.52)-trichlorfonSR89.86(85.59-95.84)2.2(1.7-2.7)S-LAB41.11(39.55-42.64)-控制靶标抗性dichlorvosSR63.43(62.00-64.81)1.9(1.4-2.4)S-LAB34.10(32.59-35.41)-PartIIAChE13DmodelPartIIG119SG119S突变在蚊虫中的独立进化次数突变在蚊虫中的独立进化次数HowHowmanymanytimestimesthetheG119SG119Smutationmutationhashasappearedappearedininmosquitoes?mosquitoes?C.p.pipiensonceC.p.quinquefasciatustwiceAnophelesgambiaeonce冈比亚按蚊Anophelesalbimanusonce白足按蚊PartIIG119SG119S的抗性潜能的抗性潜能ResistanceResistancepotentialpotentialofofG119SG119SmutationmutationPartIIWhyWhythethetargettargetresistanceresistance(G119S)(G119S)appearsappearssosolatelateandandisislimitedlimitedininextensionextensionininChina?China?DDVPmalathiontrichlorfonmalathionchlorpyrifos启示启示fenitrothionparathionPartII小结小结••中国尖音库蚊酯酶抗性等位基因很中国尖音库蚊酯酶抗性等位基因很丰富，是目前世界上酯酶抗性状况丰富，是目前世界上酯酶抗性状况最复杂的地区最复杂的地区..••靶标抗性开始在中国出现，将会带靶标抗性开始在中国出现，将会带来严重的抗性问题。来严重的抗性问题。三、蚊虫抗药性进化机制三、蚊虫抗药性进化机制蚊虫可以通过蚊虫可以通过突变突变获得获得有机磷的抗性吗有机磷的抗性吗??研究背景昆虫抗药性的分子机制代谢抗性靶标抗性CarboxylesteraseAChEP450monooxygenasesGABAreceptorGlutathioneS-transferasesSodiumchannelRegulatoryFactorsα/β-hydrolasefoldsuperfamilycarboxyl/cholinesterasemultigenefamilycarboxylesterasescholinesterases（代谢抗性）（靶标抗性）羧酸酯酶水解原理羧酸酯酶水解原理•两步反应①底物分子的羰基碳与酶催化位点的Ser共价结合，失去醇侧链，形成酰基化酶中间产物；②水分子对酰基化酶进行亲核攻击，释放出酶和酸。•OPs对羧酸酯酶产生不可逆转的抑制，因为水解的第二步反应很慢或不发生。这是由于磷酸化和酰基化的空间构像不同，P=O是四面体，C=O是平面结构。羧酸酯酶介导的代谢抗性羧酸酯酶介导的代谢抗性•量的变化：geneamplificationup-regulation（C.pipienscomplex,C.tarsalis,Myzuspersicae)•质的变化：丧失羧酸酯酶的活性获得OPs水解酶的活性获得马拉硫磷羧酸酯酶(MCE)的活性（An.culicifacies,An.stephensi,An.Arabiensis,C.tarsalis）（Muscadomestica,Luciliacuprina,L.sericata）高等双翅目的羧酸酯酶高等双翅目的羧酸酯酶•野生型只具有羧酸酯酶的活性，突变型丧失了羧酸酯酶的活性，而获得OPs水解酶和马拉硫磷羧酸酯酶的活性。•LcαE7,LsαE7andMdαE7是αE7基因的产物•两个位点出现突变导致有机磷抗性：Gly137AspTrp251Leu(Ser)Newcombetal.,1997,PNASLuciliacuprinaE3酯酶•Gly137Asp:二乙氧基OPs55倍↗二甲氧基OPs33倍↗MCE↘•Trp251Leu:二乙氧基OPs10倍↗二甲氧基OPs30倍左右↗MCE↗Heidarietal.,2004,InsectBiochem.Mol.Biol.推测的分子机制推测的分子机制•Gly137位于氧离子洞，Trp251位于酰基结合口袋（与Torpidocalifornica的AChE相比）。•Gly137Asp改变了H2O的定向，有利于对磷酸化的Ser进行亲核攻击，而不利于酰基化的Ser。•Trp251Leu可以减少位阻，容纳体积大的底物，如马拉硫磷。Heidarietal.,2004,InsectBiochem.Mol.Biol.论证论证蝇类的α-酯酶与蚊类的羧酸酯酶是直系同源基因（Oakeshottetal.,1999）经过结构模拟（Swiss-model）在B1上能够找到与E3突变位点相对应的氨基酸残基E3：Gly137，Trp251B1：Gly110，Trp224假设－肯定的回答假设－肯定的回答实验设计酯酶B1基因体外定点突变原核表达，加His－tag目标蛋白纯化酯酶活性测定OP水解酶和MCE活性测定（β-乙酸萘酯）（气相色普）实验结果实验结果酯酶B1的空间结构及突变位点的确定B1与MdαE7、LcαE7的相似性为38％B1与电鳐的AChE的相似性为25％PartII酯酶基因突变88个昆虫羧酸酯酶(7个目31个种)271位点:86％tryptophan151位点:51％glycine,47％alanineTorpedocalifornica,RMSD=0.75ÅCulexpipiensEstB1结构模拟(Cuietal.,2007.FASEBJournal,21:3584-3591)突变位点在昆虫羧酸酯酶中的保守性88insectcarboxylesterases(spanning31speciesfrom7orders)224位点86％色氨酸51％甘氨酸110位点47％丙氨酸位点特异性突变位点特异性突变Gly110AspGly110Asp(GGC(GGC→→GAC)GAC)Trp224LeuTrp224Leu(TGG(TGG→→TTG)TTG)Trp224SerTrp224Ser(TGG(TGG→→TCG)TCG)G110DW224LW224SG110D-W224LG110D-W224S融合蛋白的原核表达及纯化M：蛋白Marker，从上到下依次为97.4、66.2、43.0、37.0KDa；a，b：B1粗、纯蛋白；c，d：G110D突变体粗、纯蛋白；e，f：W224S突变体粗、纯蛋白；g，h：W224L突变体粗、纯蛋白；i，j：G110D-W224S突变体粗、纯蛋白；k，l：G110D-W224L突变体粗、纯蛋白；n：pET28a空质粒粗蛋白。B1B1及其突变体对及其突变体对ββ--乙酸萘酯的降解乙酸萘酯的降解未突变的B1活性很好Vmax:9.9(±1.2)μmol/min/mgKm:26.3(±2.5)μMKcat:717(±18)min-1Kcat/Km:26.8(±1.9)μM-1min-1Lineweaver-Burk法计算B1降解β-B1的5个突变体都丧失NA的Vmax和Km值了降解β－NA的活性B1B1及其突变体对及其突变体对OPsOPs的降解的降解B1野生型久效磷（二甲氧基）（）G110D毒虫畏二乙氧基马拉硫磷W224S甲基1605（还原型）G110D-W224S用GC检测不到降解B1B1两种突变体降解两种突变体降解OPsOPs的动力学参数的动力学参数杀虫剂KmVmaxKcatKcat/Km突变体（μM）（μmol.mg-1.min-1）（min-1）（μM-1.min-1）久效磷W224L4.79±0.90.52±0.030.17±0.030.035±0.007G110D-W224L5.11±0.20.55±0.080.18±0.010.035±0.002毒虫畏W224L5.46±0.20.61±0.040.20±0.010.036±0.003G110D-W224L5.54±0.40.58±0.030.19±0.020.035±0.003马拉硫磷W224L6.06±0.80.68±0.060.22±0.050.036±0.001G110D-W224L6.39±0.90.71±0.040.23±0.020.035±0.004甲基-1605G110D-W224L5.48±1.10.56±0.090.18±0.060.033±0.004结论结论•突变位点110和224在昆虫羧酸酯酶中的保守性很高，尤其是224位点；•G110D和W224S尽管使尖音库蚊的羧酸酯酶丧失了原有的活性，但不能使其降解OPs；•W224L能使尖音库蚊的羧酸酯酶性质发生改变，获得有机磷水解酶活性和MCE活性，实现功能位的转移；•证实了提出的假设：尖音库蚊能够通过基因突变改变羧酸酯酶的性质而产生抗药性。第二个假设第二个假设224224位点（可能还包括位点（可能还包括110110位位点）对整个昆虫羧酸酯酶实现点）对整个昆虫羧酸酯酶实现功能位的转移起着关键性的作功能位的转移起着关键性的作用用探讨酶家族的昆虫抗药性的功能进化实验 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 双翅目果蝇（β－酯酶）、美洲斑潜蝇鳞翅目斜纹夜蛾、小菜蛾同翅目棉蚜、褐飞虱鞘翅目铜绿金龟子、龟纹瓢虫半翅目盲蝽膜翅目蜜蜂、菜叶蜂直翅目飞蝗脉翅目中华草蛉PartIILepidopteraSpodopteralituraBombyxmoriHomopteraAphisgossypiiNilaparvatalugensColeopteraTriboliumcastaneumHarmoniaaxyridisHymenopteraDipteraApismelliferaCulexpipiensPartII野生型及突变型羧酸酯酶对不同底物的水解活性InsectEnzymeβ-naphthylacetateParaoxonChlorfenvinphosMalathionkcat/Km(SE)kcat/Km(SE)kcat/Km(SE)kcat(SE)A.gossypiiWT36.7(7.8)n.d.n.d.0.67(0.01)A151D37.5(6.4)0.16(0.02)0.17(0.01)0.73(0.02)W271Ln.d.0.18(0.01)0.18(0.01)0.57(0.004)A.melliferaWT53.9(4.6)n.d.n.d.1.0(0.04)A151Dn.d.0.20(0.01)0.20(0.02)0.40(0.01)W271L0.20(0.01)0.15(0.02)0.15(0.01)0.44(0.02)S.lituraWT119.6(19.4)n.d.n.d.12.4(0.6)G151D4.2(0.7)0.18(0.02)0.18(0.01)8.9(0.1)W271Ln.d.0.20(0.01)0.18(0.01)7.7(0.1)T.castaneumWT243.2(19.2)n.d.n.d.6.1(0.2)G151Dn.d.0.12(0.02)n.d.3.0(0.04)W271L0.34(0.02)0.20(0.01)0.17(0.01)3.3(0.1)B.moriWT93.5(16.2)n.d.n.d.n.d.G151Dn.d.n.d.0.19(0.02)0.23(0.005)W271Ln.d.0.21(0.01)0.27(0.04)0.32(0.01)H.axyridisWT0.57(0.2)n.d.n.d.n.d.G151Dn.d.n.d.n.d.n.d.W271Ln.d.0.21(0.01)0.28(0.02)0.48(0.01)C.pipiensWT26.8(3.2)-n.d.n.d.A151Dn.d.-n.d.n.d.W271Ln.d.-0.04(0.003)0.22(0.05)N.lugensWT0.39(0.1)n.d.n.d.n.d.G151D0.30(0.04)n.d.n.d.n.d.W271L0.18(0.1)n.d.n.d.0.65(0.01)PartII‹体外实验证明：通过基因突变导致羧酸体外实验证明：通过基因突变导致羧酸酯酶性质发生改变在昆虫中可能是一普遍酯酶性质发生改变在昆虫中可能是一普遍现象，推测这种抗性进化机制具有普遍现象，推测这种抗性进化机制具有普遍性。性。‹体内实验：转羧酸酯酶B1基因及其突变羧酸酯酶B1W271L果蝇，Gal4/UAS系统三、抗性的监测和检测三、抗性的监测和检测目的：•已证实防治失败是不是由于抗性的原因；•准确地测定和识别抗性基因型；•及早的提出抗性将要爆发问题预告；•确定抗性的发生的程度等级及其分布范围；•针对抗性类型及程度及时推荐有用的杀虫药剂；•及时测定田间有害昆虫的基因型的生物学特性；•从而提出更有效的综合治理的策略。四、四、将来的方向将来的方向••抗性机理的研究及其应用；抗性机理的研究及其应用；••高效的抗性监测的挑战和重要性高效的抗性监测的挑战和重要性;;••昆虫生物化学的分析以揭示酶学的变化昆虫生物化学的分析以揭示酶学的变化;;••分子诊断分析以检验测定点突变分子诊断分析以检验测定点突变;;••提出抗性综合治理策略提出抗性综合治理策略..将来的方向将来的方向•通过杀虫药剂靶标基因的功能鉴定以设计新型的杀虫药剂;•研究发现对抗性害虫具有高活性的杀虫药剂;•诱导靶标位点敏感性的点突变监测、鉴定；•抗性害虫代谢酶作用增强的机制研究；•开发研制更多的可用于抗性监测、诊断的工具;•提出有效的抗性综合治理的策略.感感谢谢多多年年来来感谢多年来感谢多年来国家科技部国家科技部国家基金委国家基金委中国科学院中国科学院,,动物研究所动物研究所对本研究组的大力支持，感谢各对本研究组的大力支持，感谢各位专家指导。位专家指导。Thankyouverymuchforpatiencehearing!谢谢