5第五章 酶分子修饰 PPT课件

Chapter5ModificationofEnzymeMolecule酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程。属于酶分子工程的一部分。什么是酶分子修饰？酶分子修饰的意义提高酶的活力增强酶的稳定性降低或消除酶的抗原性研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响第一节金属离子置换修饰把酶分子中所含的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法。常用的金属离子Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+适用性本来在结构中含有金属离子的酶。一、金属离子置换修饰的方法（1）加入一定量的EDTA（乙二胺四乙酸）等金属螯合物到酶液中，与酶分子中的金属离子螯合；（2）通过透析、超滤、分子筛层析等方法，从酶液中去除EDTA-金属螯合物；（3）加入另一种金属离子到酶液中，酶蛋白与新加入的金属离子结合。二、金属离子置换修饰的作用１、阐明金属离子对酶催化作用的影响２、提高酶活力锌型蛋白酶置换成钙型蛋白酶，酶活力可提高20-30倍；制成晶体，比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2-3倍。３、增强酶稳定性天然含铁超氧化物歧化酶中铁原子被锰取代后,酶的稳定性和抑制作用发生显著改变,重组的含锰酶对H2O2的稳定性显著增强,对NaH3的抑制作用的敏感性显著降低。４、改变酶动力学特性酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌被钴取代时,酶的底物专一性和最适pH都有改变,锌酶对N-氯-乙酰丙氨酸的最适pH是8.5,而钴酶的最适pH是7.0,并且对N-氯-乙酰丙氨酸等三种底物的活力降低，Ｋm增大，亲和力降低。第二节大分子结合修饰利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。水溶性大分子：右旋糖酐、聚乙二醇（PEG）、肝素、蔗糖聚合物等１、修饰剂的选择一、大分子结合修饰的方法大分子在使用前一般需经过活化，活化基团才能在一定条件下与酶分子某侧链基团反应。２、修饰剂的活化通过修饰提高酶活力酶催化剂能力本质上是由其特定的空间结构特别是其活性中心的特定构象所决定水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后可使酶的空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物结合并形成准确的催化部位，使酶活力提高。1分子核糖核酸酶与6.5分子右旋糖酐结合，活力提高2.25倍。二、大分子结合修饰的作用增加酶稳定性酶的稳定性较低是普遍存在的。采用大分子与酶结合，形成复合物，就可起到保护酶的天然构象的作用，从而增加酶的稳定性。表5-1天然SOD与修饰后SOD在人血浆中的半衰期6min7h14h24h35h天然SOD右旋糖酐-SODFicoll（低分子量）-SODFicoll（高分子量）-SOD聚乙二醇-SOD半衰期酶降低或消除抗原性抗原能引起体内产生抗体的物质。抗体当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清中就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质称之为抗体。当酶非经口（如注射）进入人体后，往往会成为一种抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去催化功能。用PEG修饰色氨酸酶可完全消除该酶的抗原性。第三节酶蛋白侧链基团修饰采用一定的方法使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。用于研究酶分子结构与功能：（１）荧光试剂修饰，了解酶水溶液中构象；（２）各基团对酶的影响，必需基团；（２）某基团数量；（４）改变酶性能其侧链功能基团有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等，这些基团可组成各种副键对蛋白质空间结构的形成和稳定起重要作用。这些功能基团发生改变，引起副键改变，使空间结构发生某些变化，从而引起酶特性和功能的改变。蛋白酶类的修饰（1）氨基修饰（2）羧基修饰（３）巯基修饰（４）胍基修饰（5）酚基修饰（６）咪唑基修饰（７）吲哚基修饰（８）分子内交联侧链基团修饰方法氨基的化学修饰赖氨酸的-NH2以非质子化形式存在时亲核反应活性高，易被选择性修饰。三硝基苯磺酸（TNBS）是非常有效的氨基修饰剂。1、氨基的烷基化反应式2、氰酸盐使氨基甲氨酰化，离子小，易接近要修饰的基团。3、磷酸吡哆醛（PLP）4、多肽链N-末端残基的化学修饰：用于蛋白质序列分析。有2，4—二硝基氟苯（DNFB）法（sanger试剂）、丹磺酰氯（DNS）法、苯异硫氰酸酯（PITC）法。碳二亚胺修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法，条件温和。反应式羧基的化学修饰+巯基的化学修饰巯基在维持亚基间相互作用和酶催化过程中起重要作用，具很强的亲核性，在含半胱氨酸的酶分子中是最易反应的侧链基团。1、烷基化试剂；2、马来酰亚胺；3、有机汞试剂；4、5-5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，Ellman试剂）巯基修饰剂反应式具两个邻位羰基的化合物，如丁二酮等，是修饰精氨酸残基的重要试剂；精氨酸残基在结合带有阴离子底物的酶活性中心部位起重要作用。精氨酸胍基的化学修饰反应式酚基的化学修饰1、碘化法2、硝化法3、琥珀酰化法酪氨酸残基上含有酚基，酚基经修饰后，引入负电荷，增加了对正电荷底物的结合力。修饰方法：分子内交联剂含两个反应活性部位的双功能基团，可在相隔较近的两个氨基酸残基之间或其它分子间发生交联反应，可使酶分子空间构象更加稳固。有同型双功能试剂、异型双功能试剂。第四节肽链有限水解修饰酶的催化功能主要决定于酶的活性中心构象肽段作用（1）在活性中心部位的，起催化作用；（2）在活性中心以外部位，维持酶的空间构象。肽链被水解后的情况（1）酶活性中心破坏，酶失去催化功能（2）仍可维持酶活性中心的完整构象，酶活力保持不变或损失不多（3）有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催化部位，酶催化功能增强或酶活力提高利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活第六节氨基酸置换修饰将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。置换的氨基酸催化剂：酪氨酰-tRNA合成酶。其第51位苏氨酸换成脯氨酸，对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍。例１酪氨酸+tRNA酪氨酰-tRNA酪氨酰-tRNA合成酶１、提高酶活力２、增强酶的稳定性。３、酶专一性改变一、氨基酸置换修饰的作用β-干扰素的稳定性（修饰后低温保存半年，活性不变）。干扰素含3个半胱氨酸，其中2个的巯基连成二硫键，另一个（Cys-17）游离,易与另一个干扰素的游离巯基结合失去活性。用丝氨酸置换之,使干扰素不生成二聚体,大大提高其稳定性。例2原理二、氨基酸置换修饰的方法1、化学修饰法２、定点突变法蛋白质工程通过改造蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质的技术过程。1、新蛋白质工程结构的设计2、突变基因的核苷酸序列的确定3、突变基因的获得4、新蛋白质的产生蛋白质工程的主要步骤实验操作大致步骤(1)先测定酶的一级结构(2)用X射线衍射分析测定其三维结构(3a)根据结构信息选择突变部位,即选定哪一个氨基酸残基要被取代;选4~6个氨基酸残基的寡肽序列,其间含待取代的氨基酸残基(3b)用化学法合成由12~18个碱基组成并为所选寡肽的氨基酸序列编码的核苷酸序列,作为定位诱变的引物(4)找到(构建)单股质粒,含有为所要蛋白质编码的基因,作为定点突变的模板(7)将这两个基因分离并克隆,最后产物是细胞转化突变型,能合成突变体蛋白质,与母体蛋白质仅有1个氨基酸的差别,这个氨基酸就是事先选定的突变部位.(6)将异质双链质粒引入宿主细胞,(如E.coli).转化为两个同质双链质粒,一个含的基因是天然蛋白质编码的,另一个是为突变体编码的(5)将引物与单链模板DNA配对,用各种DNA聚合酶和DNA连接酶将引物延长,形成互补链,得到共价闭合的双链DNA,也叫异质双链质粒第八节物理修饰通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。特点（1）不改变酶的组成单位和基团；（2）酶分子中的共价键不发生改变；（3）副键发生某些变化和重排。效果（1）改变底物特异性。多肽酶经高压处理，有利于肽的合成反应，降低了水解反应的能力（2）提高酶活力，降低最适温度。高压处理纤维素酶，30-40OC，酶活提高10%。第九节酶分子修饰的应用一、在酶学研究方面的应用１、酶的活性中心研究２、酶空间结构研究３、酶作用机制研究（１）亲和标记法（２）差示标记法（３）氨基酸置换法（４）核苷酸置换法二、在医药方面的应用１、降低或者消除酶抗原性２、增强医药用酶的稳定性三、在工业方面的应用１、提高工业用酶的活力２、增强工业用酶的稳定性３、改变酶的动力学特性四、在抗体酶研究开发方面的应用一、抗体酶概述抗体是和抗原结合的物质。抗体与靶分子精确匹配。产生高度特异性和亲和性。免疫系统可以产生108～1010个不同的抗体分子（多样性）抗体结构抗体分子是由两条轻链(L链)和两条重链(H链)通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。能否利用抗体的这些特性将抗体开发成象酶那样的催化剂呢？1969年，Jentcks根据Panling的化学反应过渡态理论预言，用过渡态类似物，作为半抗原，产生的抗体，该抗体具有酶催化反应的基本特征。1986年《Science》同时发表了两篇来自由Lemer和Schultz分别领导的两个研究组的发现具有酶催化能力的抗体 研究报告 水源地可行性研究报告美术课题研究中期报告师生关系的个案研究养羊可行性研究报告可行性研究报告诊所 ，揭开研究抗体酶的热潮。取得的成果：天然酶所催化的6种酶促反应数十种类型的常规反应的抗体酶。包括酯、羧酸和酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂解和聚合，酯交换，等等。抗体酶（abzyme）：是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，也叫催化抗体。特点：1、反应专一性相当于或超过自然酶反应的专一性，2、催化速度有的可达到自然酶催化的水平。但一般来说比非催化反应快102～106倍，比天然酶催化反应速度慢，仅为它的10-4-10-2。革命尚未成功，同志仍需努力。二、抗体酶的制备方法1.诱导法以Pauling的稳定过渡态理论为指导，即酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得到抗体酶。例：Schultz研究小组以羧酸二酯水解反应的过渡态类似物对硝基苯磷酰胆碱作为半抗原，诱导产生单克隆抗体，经过筛选找到一株MOPC167。使水解反应速度加快12000倍。2.抗体结合部位修饰法以底物为半抗原所产生的抗体应当具有底物结合部位，然后在此抗体的结合部位上引入催化基团。如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处，则应产生高活力抗体酶。在抗体的抗原结合部位引入催化基团。方法有两种：（1）选择性化学修饰法（2）基因工程定点突变法例：使用可裂解亲和标记物将含巯基的柄状亲核基团引入到抗2，4-二硝基苯酚（DNP）的单抗的抗原结合位点，得到的抗体酶对含有(DNP)与香豆素的羧酸酯的水解反应的催化效率比二硫苏糖醇高104倍。（1）选择性化学修饰法（2）基因工程定点突变法通过基因工程，精确地将催化基团引入到抗体的结合部位上。例：Schultz小组用此法将催化基团组氨酸插入到对二硝基苯专一的抗体（MOPC315）的结合部位。合成了VL片断的基因，其中抗体结合部位的Tyr34被组氨酸取代,然后用大肠杆菌表达重组的VL,再将VL链与天然的VH链组合在一起，则得到具有显著酯解活力的抗体酶。六、在有机介质酶催化反应中的应用对酶分子进行侧链基团修饰，增强酶分子表面的基团的疏水性，有可能使酶溶解于有机溶剂，均匀地分布于溶剂中，进而提高酶在有机相中的催化效率和稳定性。