null生物技术专业系统实验(四)
—酶(蛋白质)工程实验VI生物技术专业系统实验(四)
—酶(蛋白质)工程实验VI六、脲酶米氏常数(Km值)
简易测定 六、脲酶米氏常数(Km值)
简易测定 null1.目的意义 2.实验原理
3.仪器设备 4.实验方法
5.实验
报告
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6.思考
题
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1.目的意义1.目的意义 1913年,由Michaelis L.和Menten M.在前人研究的基础上提出的米氏方程(Michaelis-Menten Equation)是酶学中
表
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示一个酶促反应的起始速度V与底物浓度[S]关系的方程。 1925年,经过Briggs和Haldane修正后,提出更有普遍意义的酶促反应速度方程,如下所示:、null其中,V为酶促反应速度;Vmax为最大反应反应速度(与V的单位相同, mol·L-1·min-1); [S]为底物浓度(mol·L-1);Km为米氏常数,是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
在酶促反应中,底物在低浓度情况下,反应相对于底物是一级反应(first order reaction);而当底物浓度处于中间范围时,反应(相对于底物)是混合级反应(mixed order reaction);当底物浓度增加时,反应由一级反应向零级反应(zero order reaction)过渡;当底物浓度[S]逐渐增大时,速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图: 米氏常数的意义米氏常数的意义由米氏方程可知,当反应速度等于最大反应速度一半时,即V = 1/2Vmax时, Km = [S] 。
上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。
因此,米氏常数的单位为mol·L-1。
不同的酶具有不同Km值,它是酶的一个重要的特征物理常数。
Km值只是在固定的底物,一定的温度和pH条件下,一定的缓冲体系中测定的,不同条件下具有不同的Km值。
Km值表示酶与底物之间的亲和程度:Km值大表示亲和程度小,酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。
通过Km值的测定,可鉴定酶的各种底物,Km值最小者为酶最佳底物,即天然底物。2.实验原理2.实验原理底物浓度对酶促反应的影响
在酶浓度、pH、温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示:
在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比,表现为一级反应特征。
当底物浓度达到一定值,几乎所有的酶都与底物结合后,反应速度达到最大值(Vmax),此时再增加底物浓度,反应速度不再增加,表现为零级反应。null 酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度,然后测试几种不同底物浓度下的起始速度,即可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的,因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此,通常情况下,我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定,即Lineweaver-Burk plot,也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot):null 用1/V 对1/[S]作图,即可得到一条直线,该直线在Y轴的截距即为1/Vmax,在X轴上的截距即为1/Km的绝对值,斜率为Km/Vmax。如图所示:Km=-1/x3.仪器设备3.仪器设备3.1 试剂
大豆粉(教师准备)。
脲酶液:取大豆粉2g移入250ml三角烧瓶,加30%酒精100ml,连续搅动15min,室温下静止1-4h,离心或脱脂棉过滤,收上清备用(上清液需清亮、透明)。
30%酒精(教师准备) 。
0.1 mol·L-1脲液:取尿素0.6g定容至100ml。然后分别稀释至1/20、1/30、1/40、1/50 mol·L-1系列液(教师准备) 。
1/15 mol·L-1PB(磷酸盐缓冲液,pH7.0;教师准备)。
100g·L-1硫酸锌(教师准备) 。
100g·L-1酒石酸钾钠(教师准备) 。
null纳氏试剂:
分别溶解3.5g氯化高汞(HgCl2)于20ml热蒸馏水,10g碘化钾于5ml水中,再将前者慢慢倒入碘化钾溶液中,不断搅拌,直至出现微红色的少量沉淀为止。向此液中加70ml 30%KOH,不断搅拌,再滴HgCl2溶液至出现红色沉淀为止。混匀,静置过夜。倾出上清液贮存于棕色试剂瓶(用橡皮塞)中放置暗处保存。
显色液:
将100g·L-1酒石酸钾钠和纳氏试剂按1:2混合即成显色液(临用前混合)null3.2 器材
15ml 大试管20支
1ml 移液管2支
5ml 移液管2支
10ml 移液管2支
200ml 烧杯2个
100ml 烧杯2个
玻棒 1支
双蒸水1瓶(50ml)
比色皿1套(4个)、玻璃皿1套、洗瓶1个
吸耳球 1个
恒温水浴锅1台
试管架2个200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl移液器各1支;
小号、中号、大号枪头各1盒(需灭菌)
旋涡混合器1套(置于每组桌上)4.实验方法4.实验方法取一定量的酶(稀释为10-5倍);
加入各种不同浓度的底物(如表所示);
在一定时间内测定产物的量(15min);
建立x,y轴,作图,建立回归方程;
在Y=1/2Vmax时,求其x(即[S])→Km;4.1 测定—取5支试管,分别标记1-5号,按照下表操作。4.1 测定—取5支试管,分别标记1-5号,按照下表操作。迅速摇匀,用分光光度计在420nm下测定各管A值。4.2 数据处理4.2 数据处理
各管在420nm测定OD420nm值。
由于光密度(OD420nm)与显色,显色与底物浓度成正比,反应时间均为15min。故以1/A取代1/V为纵坐标作图。
测定所用单位为Km单位g·L-1 。
由1/A对1/[S]作图,求得回归方程,计算α-淀粉酶催化可溶性淀粉溶解的米氏常数Km。
5.实验报告5.实验报告5.1 根据所得数据填写实验报告表
5.2 讨论
6.思考题6.思考题 1.在测定酶催化反应的米氏常数Km时和最大反应速度Vmax时,应如何选择底物浓度范围?
2.为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数,而Vmax却不是?
3.米氏常数Km值的物理学意义和生物学意义是什么?