毕赤酵母表达系统

微生物学杂志 2003年 7月 第 23卷 第 4期 JOURNAL OF MIcR0BIOLoGY July 2003 Vo1．23 No．4 35 ·综 述 · 毕赤酵母表达 系统 * 韩雪清，刘湘涛，尹双辉 (中国农业科学院 兰州兽医研究所农业部畜禽传染病重点实验室，甘肃 兰州 730046) 摘 要 选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键 。毕赤酵母表达 系统是一种新的、极具潜力的真 棱表达 系统 ，其在蛋白质表达方面具有其它系统不可 比拟 的优点 ，正在得到越来越广泛的应用。较详细地综 述 了毕赤酵母表逸系统的特点、组成及影响其表 达的因素等。 关键词 毕赤酵母；表达系统 中圈分类号 O．93 文献标识码 A 文章编号 1005—7021(2003)04—0035—06 分子生物学研究 已进入后基因组时代，其 中 心任务是更多地关注基因组表达的蛋白质的结构 和功能方面的研究。由于基因功能是最终通过其 表 达产物一 蛋 白质来实现 的 ，因此 ，要 了解基 因组 全部功 能活 动 ，最终 也必须 回到蛋 白质上 ，从而 也 使得用于表达蛋白质 的表达系统显得越来越重 要 ，因为表达蛋 白质的成功与否除基因本身的因 素外，很大程度上取决于表达系统的选择。酵母 表达系统是应用最为普遍的真核表达系统之一 ， 在短短的 20 a中已成功地表达 了大量 的酶及用 于药物和疫 苗的蛋 白质。该系统 以其独有 的安 全、廉价的优点 ，最适合于医用药物蛋白，尤其是 疫苗用蛋 白的表达。最直接的例子就是 目前世界 范围内使用 的人 甲肝、乙肝基 因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 亚单位疫 苗【lI2J。主要是酵母表达系统表达 的蛋 白。酵母 的种类很多 ，而我们用于表达的宿主菌只有几种。 最早研究应用的是啤酒酵母(Cerevisiae)，又名面 包酵母 。早在 1979年就由 Hin等人取得了首例 啤酒酵母 的转化 工程 【lJ。1981年 Hitzeman等 用 该系统表达成功了人干扰素【3J。采用啤酒酵母来 表达重组蛋白有一些成功的例子 ，但总的来说这 一 表达系统的表达量普遍偏低。另外还有其他的 局限性 ，例如 ：①在大量表达时，即使用诱导的启 动子 ，也常常会发生质粒丢失的现象；②重组蛋白 常发生超糖基化 ，每个 N．寡糖链上都含有 100个 以上的甘露糖 ，而正常的高甘露糖寡糖链仅含 8 ～ 13个甘露糖。过多 的甘露糖可能会影响蛋 白 的生物活性及免疫原性 ；③在有些实验中，分泌型 的蛋白都留在间隙中，使得分离纯化困难。因此 ， 人们正在从其他的酵母株系和真核系统中寻找更 合适的宿主系统。目前已找到的较为合适的宿主 系统 ，例如 Pichia pastoris和 Hansenula polymor． pha等 。但研究 比较 清楚、应用 最广 的还 是 Pichia Pastoris(P．Pastoris)表达系统。 P．Pastoris(毕赤巴斯德 )是 2O世 纪 8O～9O 年代发展起来 的极具潜力 的酵母表达系统 ，由于 其在蛋 白质表达方面具有其它系统所不可比拟的 优点而得到越来越广泛的应用【4J。用该系统成功 地表达了几百种的酶和药用及疫苗用蛋白。 1 P．Pastoris表达系统的优点 作为真核表达系统 ，P．Pastoris具有许多其 它蛋白表达系统所不具备的优点 ：① 由于它们属 于单细胞生物 。因而保 留了细菌易于操作和生长 速度快的特点，可高密度发酵培养，在发酵罐中细 胞干重可达 120 g／L以上：②营养要求低 ，运用培 养基成分简单 ，即盐、生物素和碳源 即可，价廉便 于工业化生产 ；③通过同源重组 ，稳定地整合表达 载体到宿主染色体 中，连续培养 5O代，外源基 因 都未丢失 ；④ 具有强有 力 的乙醇 氧化酶 基 因 (Aox)启动子 ，可严格调控外源蛋白的表达。而且 是个很易控制的启动子；⑤表达量高 ，许多蛋白可 达到每升克以上水平，如破伤风毒素 C片段表达 量高达 12 g／L[6l，而明胶表达量为 14．8 g／L[7 ： ⑥在 P．Pastoris中表达的蛋白质既可存在于胞内 又可分泌至胞外 ，P．Pastoris自身分泌的蛋 白(背 景蛋白)非常少 ，十分有利于纯化。如表达的重组 水蛭素(HIR)，仅经过二步层析纯化，纯度就高达 97％以上【7 ；⑦作为真核表达系统 ，可对表达 的 蛋 白进行 翻译 阿房宫赋翻译下载德汉翻译pdf阿房宫赋翻译下载阿房宫赋翻译下载翻译理论.doc 后的正确加工和修饰 ，即二硫键的 形成、脂肪的酰化、蛋白的磷酸化、折叠、信号序列 加工、N．糖基化、O．糖基化 ；⑧糖基化程度低 ，即 收稿 日期：2002一l1一O6 作者简介 ：韩雪清 女，副研究员。清华大学博士后。研究方向为病毒分子生物学和病毒生物大分子结构和功能。 * 国家重点基础研究发展规划(973)项 目资助 维普资讯 http://www.cqvip.com 36 微 生 物 学 杂 志 23卷 不象酿酒酵母 超糖基化 。甲醇酵母 中加到翻译蛋 白上 的糖链 长 度 平均 每 条 侧链 为 8～14个 甘 露 糖残基 。较 之 酿 酒 酵 母 每 条 侧 链 平 均 50～150 甘露糖残基 短得 多⋯8。此 外 ，酿酒 酵母 核心多 糖 末端 存 在 a一1．3糖 苷链 ，而 甲醇 酵母 没 有 。一般 认 为酿酒 酵母 中糖蛋 白 a一1．3糖 苷键 使得 这些蛋 白具有高度 的抗 原性 ，因而不适合治疗用途 。 2 P．Pastoris表达载体及其元件 载体是 由许 多元件构成 的 ，包括启动子 、终止 子 、选择 标记 、 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基 因、复制起点 ，对分泌型载体 还需要信号肽序列。 2．1 启动子 最常用 的启 动子是 AOX1启动 子 (AOXl， promoter，PA0X)，它的甲醇诱导性很强 ，因而它 控制下 的外 源基 因能得 到较 高的表 达。A0X1基 因是 从 用 RNA 构建 的 cDNA 文 库 中分离 的， RNA来 自克隆筛选能在甲醇培养基上生长的 P． Pasotds细 胞 J。P．Pasotris基 因组 包 含 2个 基 因：AOX1和 AOX2。在序列上这 2种 AOX蛋白 同源性≥97％，并有相似特殊活性LloJ，但 A0X1 表达水平 明显高于 AOX2，即启动能力 AOX1大 大强于 AOX2[nJ。细胞 中绝大多数 乙醇 氧化酶 的活力是 由A0X 提供的。当以甲醇为唯一的生 长碳源时，AOX 基因的表达被 甲醇严格调控 ，并 被诱导到相当高的水平，可 占整个细胞可溶蛋 白 的 30 ％ 以上。当 A0X1基 因缺 乏 而 只 存 在 AOX2时 ，大部分乙醇氧化酶的活力丧失，细胞利 用甲醇能力降低。因此细胞在甲醇介质上生长很 慢，这种菌株被称为 Mut。；A0X1基 因存在时，细 胞利用甲醇能力正常，在甲醇介质上生长较快，这 种菌株表型被称为 Mut 。A0X 基因的表达为 转录水平调控。以甲醇为碳源时，生长细胞中约 5％ mRNA来 自于 A0X1基因。A0X1基 因的调 控是两步过程：抑制机制加上诱导机制。即在以 葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转 录 ；而在 以甲醇为唯一生长碳源时，诱导基 因转 录，蛋 白表达。最近在 P．Pasotris中克隆到一个 组成型启动子：PGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动 子)，在它控制下 的 p．Lacz基 因表达率 比甲醇诱 导下 的以 PAOX1为启 动子的产量更 高L12J。由于 该组成型启动子不需 甲醇诱导，发酵工艺更为简 单 ，产量高 ，所 以它是 一个很有潜 力的启动子 。 2．2 选择 标记 选择标记 一般为对应于 营养缺 陷型受体 的野 生型基 因 ，常 用 HIs4。由于 P．Pasotris不利 用蔗 糖 ，所 以也 可用 啤酒 酵母 的蔗 糖 酶 基 因 suG 作 为标记u 3J。AMP：氨苄抗性基因，可在大肠杆菌 中筛 选。G418 和 Zeocinr(Invitrogen，sandiego， CA)也是筛选标记 ，使得 到高 拷贝 的转 化子 ，这是 因为 表 达 载 体 上 外 源 基 因和 卡 那 基 因 相 偶 联 。 Zeocinr在 E．coli和 P．Pastoris宿主中都表达，因 此缩短 了穿 梭载体 的长 度 ，但 Zeocin是一 种强 诱 变剂 ，可能 导致转 化子产生 突变 。 2．3 信号肽序 列 P．Pastofis自身分泌的蛋白质很少 ，分泌表达 是一种理想 的表达 方式 ，胞外 表达 有 利于 蛋 白质 的提取和 纯化 ，同 时有 助于 不分 泌 型 的蛋 白质使 其分泌，而像人血清蛋白(HSA)和牛凝乳酶(Ren— nin)[¨J，用 自身信号肽序列 即可在 P．Pastoris中 成功表达。然而 ，对于有些蛋白的 自身信 号肽， P．Pastoris不 能有 效利 用，如 反转 录酶【l 5l。P． Pastoris信号肽主要来 自于磷酸酶(PHO)、转化酶 (inertase)和 口一因子 ，其中 因子信号肽( MF)使 用最广。a一因子信号序列是由 87个氨基酸组成， 来 自于 S．cerevsiae的 口性成熟因子前导序列 ，并 且已将这 段序列编码 的信号 肽插入 到几个 P． Pastoris的表达载体中(Invitrogen)。在构建 口．因 子信 号 肽融 合基 因时 ，需 保 留 KeX2蛋 白酶 切位 点附近 的谷氨酸一丙 氨酸 (Glu-Ala)间隔区，Glu． Ala的存在会避免错误切割的发生。研究证 明： 信号肽引导的外源蛋白在 P．Pastoris中均能被有 效切割u引。a．MF是在高尔基体 中被 KeX2蛋白 酶识别并切割，而 PHO1一般在 内质网被切割。 2．4 载体 Invitrogen公 司构 建 的多 种 P．Pastoris表 达 载体 ，既有胞内表达的，又有分泌表达的。这些载 体都包括一个表达盒(cassette)，它是由 0．9 kb的 5 A0X1序列片断和约 0．3 kb的转录终止基因的 3 序列组成【1 。分泌型表达载体主要有 pPIc9， pPIc9k[ ，pHIL．S1，pPIcza，pYAM75P6[ 】；胞 内 表 达 的 载 体 主 要 有 ：pHIL．D2，pA0815L埔J， pPIC3K[ ， pPICZ[引 ， pHW O10[ ， pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)等。按 Invitrogen公司推出 维普资讯 http://www.cqvip.com 4期 韩雪清等：毕赤酵母表达系统 37 的 Kit可 分 为 3类。第 一 类 属 高 拷 贝型 ：如 pPIC3K和 pPIC9k都携带有卡那基因，可通过提 高 G418浓度 ，很容易得到高拷贝的转化子u 。 PA0815是先在体外构建 串联 的外源基 因多拷贝 (可连接 8个拷贝子)，转化后可得到已知的多拷 贝转 化 子 J。 第 二 类 为 易 筛 选 型 ：pPIczA， pPIcza，不需要营养缺陷筛选、不需要氨苄抗性筛 选，且载体小 ，易操作。但是筛选标记为 Zeocin~， 它是很强的诱变剂，可使外源蛋白突变 J。第三 类为原始型 ：pPIc9等操作繁琐 ，是单一拷 贝 J， 有高水平表达外源蛋 白的时候，但不多见。 3 宿主菌 一 般 用 于 外 源 基 因表 达 的 P．Pastoris菌 株 有 ： Y一11430， M—G100—3， GSll5， KM71， SMD1168。除 Y一11430为野生型外，其余都为组 氨酸突变型。GSll5表型为 Mut。重组表达载体 转化 后，转 化 子 既 可能 是 Mut ，又 有 可 能是 Mu ，可 在 MM 和 MD 培 养 基 上 鉴 定 表 型； SMD1168和 GSll5类 似，不同的是 它是蛋 白酶 缺陷型[19]，适用于分泌型表达载体，以免外源蛋 白在培养基中很快被宿主菌同时表达的蛋白酶所 降解；KM71的染色体上大部分 AOX】基因被删 除，本身就是 Mut。，转化后 ，转化子就是 Mut。，不 必鉴定表型；Mcl00—3的 AOX基因全部删除，甲 醇利用 为负 ，即表型为 Mut—His一。 4 转 化 对于 P．Pastoris的转化 目前有 4种方法：① 锂盐法；②PEG法 ；③原生质球法；④ 电穿孔法。 锂盐法和 PEG法方法简便，但效率很低 ，每微克 DNA只有几 十个 转化子或更 低 ，一般不多 用 。原 生质球法和电穿孔法转化率都较高 ，而且一般可 得到高拷 贝重组 ，其转化率都可达到 10 钊。 但原生质球法操作繁琐费时；电穿孔法简便、快 速、高效 ，是理想的转化方法。 P．Pastoris的转化不同与大肠杆菌转化，所有 的表达载体均不含酵母复制原点。这就是说 ，导 入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上 的同源区发生重组，从而整合到染色体上 ，外源基 因才能够稳定存在，外源蛋 白也才能得到稳定表 达。这种整合 的转化子一旦形成就非常稳定 ，整 合区位 点有 5 AOX】，3 AOX】和 His(组氨酸 )。 有人 报 道 经 50代 传 代 后 67 ％ 的 细 胞 仍 带 质 粒 5。P．Pastoris重 组 可 分 为 两 种情 况 ，一 种在 His或 5 AOX】的单酶切位点将质粒载体线性化 ， 通过单交换整合进染色体 ，即插入 AOX1基因仍 然保 留 ，这 样 得 到 的 转 化 子 表 型 为 Mut ，利 用 SalI线型化 ；另一 种是 双 交换 ，即替换 ，用 BgI1I 酶切质粒载体，外源基因通过重组替换 了染色体 上 的 AOX】基 因，造成 AOX】缺失 ，得到 的转化 子 表型为 Mut。，它们代谢 甲醇的速度明显减慢。 5 重组蛋 白翻译后修饰 P．Pastoris含有典型高等真核生物的许多翻 译后修饰功能 3。这些功能包括信号肽的加工、 蛋 白质折叠 、二硫键的形成 、O一及 N一型 糖基 化、酰 化等。目前研究较多的是糖基化作用。蛋 白质的 糖基化链参与细胞识别、激素受体结合、蛋白质定 位及宿主一微生物问相互作用 ，糖基化具有组织和 细胞特异性。低等和高等真核生物糖基化形式不 同，哺乳动物的蛋 白糖链的剪切在高尔基体中进 行 ，主 要 是 一 系 列 剪 接 和 产 生 由 Man5—6 GluNAC2(高甘露糖型)组成 的寡核糖的增 加反 应。Man5．6 GluNAC2是由几种不同糖组成的混 合物，或是两者的结合物(杂交型)[引。P．Pastoris 能够加 O一和 N一连接碳水化合物到分泌表达酶外 源蛋白质L20J。O一糖基化还经过丝氨酸和苏氨酸 的羟基碳水化合物连接到多肽上。O一寡糖基只 由甘露糖(Man)残基组成。S．cerevisiae缺乏甘 露糖酶，对表达的外源糖蛋白不进行剪切 ，相反， 还会加上高达 75个之多的甘露糖残基，这就产 生了过糖基化作用(hgperglycosglation)，并含有许 多侧链；a一1—3糖苷键，使酿酒酵母表达的糖蛋 白 具抗原性，不适合治疗用。而 P．Pastoris修饰糖 链 的平均长度为 8～14甘 露糖 ，而 且外 链 不含 ot一 1—3甘露糖，表达的糖蛋白适合作治疗用 。 6 发酵罐培养 许多外源蛋 白在 P．Pastors摇瓶 培养 中表达 量很好 ，发酵罐培养能大幅度提高表达量 ，例如在 表达 mEGF时，发酵罐较之摇瓶培养提高 10～ 100倍[2 2l。这是 因为在 发酵罐 中，① 溶 解氧水 平、通气量、pH、搅拌速率、营养补给等方面更容 维普资讯 http://www.cqvip.com 微 生 物 学 杂 志 23卷 易得到优化 ，有机体才能高密度生长(>120 g／L 干细胞重)，从而导致更高效 的表达；②在发酵罐 培养中，P．Pastoris细胞 甲醇营养限制速率下，从 A0X1起始 转录水平更 高于 细胞 生长在 过量 甲醇 上，从而导致更 高的表达【8 ；③ 甲醇在代谢 过程 中氧气利用率高 ，如果氧气受限则势必影响外源 基因的表达量，而只有在发酵罐 中的控制环境 中 才能正确监控和调整培养基中氧的水平。 7 影响 P．Pastoris中外源蛋 白表达 的因素 虽然许多蛋 白质在 P．Pastoris中可 高效表 达，如明胶表达量高达 14．8 g／L[ 引，但仍有一些 蛋白质表达量相对较低，如 [3-cryptogein表达量约 为 1～5 mg／L[2引。同一表达系统 ，对于不同的外 源蛋白，表达量千差万别。一方面是外源基因序 列本身的内在特性起着很重要的作用 ；另一方面， 表达条件对表达量高低的影响也极其显著。 7．1 外源基因的内在特性 7．1．1 5'-UTR的核苷 酸序列和长度影 响外源 基因的表达。适当长度的 5 非翻译区可极大地 促进 mRNA有 效地翻译 。UTR太 长或太 短会 造 成核糖体 40 S亚单位识别 的障碍。A0Xl基 因 5 玎R长 为 114 nt，并 富含 A+U，因 此对 于 最 佳蛋 白的表达量，维持外 源基 因 mRNA5 一UTR 尽可 能和 AOX】的 mRNA5 一UTR相 似是 必需 的，最好保持二者一致。这种方法使 HAS表达量 提高了 50倍L22J。 7．1．2 A+T含量过高的基因在 P．Pastoris中表 达有 时会 造成 转 录 提前 终止。共 有 序列 AT— TArIv1_rATAAA就是一个转录提前终止信 号， 还有一些未确定 的转录提前终止信号存在于 AT 富含 区L21 J。控 制 A+T 含 量 在 30 ％～ 55 ％。 使破伤风毒素 C片段得到高效表达【2 5I。 7．1．3 低频率利用的密码子 ：通过对 110个酵 母基因使用密码子的统计分析，确证 了密码子的 嗜好性与基 因表达量密切相关L26J。在酵母中表 达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码 子 。在所 有的 61个 密码 子 中有 19～25个 是 酵 母所偏爱的【27,28]。高表达的基 因几乎毫无例外 地使用这 25个偏爱密码子。P．Pastoris表达植 酸酶时，把酵母 中使用频率为零 的精氨酸密码子 突变为使用频率较高的密码子 ，表达水平提高了 37倍[293。 7．1．4 外源基 因的长度，直接影响其转化率 ，当 外 源基 因大于 1 kb时 ，转化率大 于 50％；外 源基 因小于 0．5 kb时，转化率猛降至小于 0．1％ 。 7．2 表达条件 7．2．1 裁体 的选 择 一 般 选分 泌 型、高 拷 贝 标 记，易操作的穿梭载体。绝大多数情况下，P．Pas— toris中整合多拷贝编码重组蛋白的基因会提高重 组蛋白表达产量【30,2]；但也有例外 ，甚至反而会 下降【31]，因此，有必要选出高拷贝的同时，选一单 拷贝进行比较表达。 7．2．2 茵株及其表型 一般首选蛋 白酶缺失型 菌株。对于分泌表达 ，Mut 和 Muff无明显差别 ， 但在高生物量 的发酵 中，Mut 生 长更快 ，较 之 Muff对于提高外源蛋白的产率更有效。 7．2．3 表达盒整合位点 重组表达载体经酶切 线性化后 ，含外 源基 因的部分称 为表达盒 (cas— settes)。表达盒中的 AoX1位点和 His位点是同 源整合区。这两个整合位点并无区别。极少数情 况下 ，在 His位点整合时，染色体突变的 His位点 和表达盒的 HIs4基因位点之间发生基因交换会 导致表达盒的丢失 ，故一般优先选择 A0X】位点。 7．2．4 通 气量 充足 的通 气 量对 于诱 导 阶 段外 源蛋白的表达量极其重要。增加通气量的措施有 培养基体积不超过摇瓶体积 10％～30％，把摇 瓶斜置于摇床上，提高摇床转速等。 7．2．5 培 养 基 如 BMGY／BMMY，BMG／ BMM，MGY 等 都 可 用 来 表 达。BMGY／ BMMY，BMG MM培养基成分 中含有缓冲液， 常用来表达分泌蛋白，可在一个广泛范围内获得 最佳的蛋白产量 ，尤其是当 pH 对外源蛋 白活力 重要的情况下。培养基 中的酵母 膏和蛋白胨，可 作为富营养物 ，使菌体更好地生长，从而导致总的 蛋 白量 增大 。 7．2．6 蛋白酶 表达的外源蛋 白对蛋 白酶 的敏 感与否也影响蛋白的产量。通常是调整 pH改变 酶活性【 ；培养基 中添加 1％酪氨酸蛋 白水解 物【32,33]；使用蛋白酶缺陷受体菌 SMDl168，有报 道使用 SMD1168比使 用 GSll5表 达量提 高 2 倍[3 4l。 维普资讯 http://www.cqvip.com 4期 韩雪清等 ：毕赤酵母表达系统 7．2．7 甲醇含量 一般每天添加到培养基中的 甲醇含量为培养体积的 O．5％，但在表达 GA时， 甲醇含 量 为 O．75％时表 达量 最 高 ，超 过或 低于 该浓度都会导致表达量 的下降【3引。而 Mut 代 谢 甲 醇 的 能 力 强 ，有 研 究 者 每 天 添 加 甲 醇 到 3％，无 不 良影 响 。 7．2．8 诱导前 OD值 P．Pastoris中蛋 白表达分 二个 阶段 。首先 是 在含 甘油 培养 基 中生长 菌体 ， 达到一定 OD值后离心而得菌体，然后把菌体悬 浮于以甲醇为碳 源的培养基 中诱导表达。理论 上，OD值越高，生物量越大 ，则总的表达量 也越 大。但 OD值越高，培养基 中氧和营养供给越受 限制 。事实上高 细胞密度不一定有 利于外源蛋 白 的产生，这有赖于所要表达的外源蛋白的性质，如 溶解性、稳定性、毒性等 。影 响外源蛋 白在 P． Pastoris中表达 的 因素是 多 方面 的。许 多 因素 对 蛋白表 达量 的影 响 是 巨大 的 ，有 时 仅仅 改进其 中 一 个或几个方面不一定有明显效果，必须全面考 虑各种 因素 。 8 P．Pastoris表达系统应用前景 近年来，P．Pastoris表达体系有了更为广泛的 应用 ，表达 的蛋 白质 除人 、畜药 、疫苗 制 品外 ，还包 括来 自植物 、动物 和细菌 的各 种酶 、膜 蛋 白、抗原 和抗体 、调节蛋 白以及可 用 于研 究 晶体 结构 的 蛋 白质 ，它还可 以 同时表 达酶 组分 比例适 当的一 个 酶系，而以全细胞作为生物催化剂L3 6l。和其它体 系 比较 ，它在 表 达 真 核蛋 白方 面 有很 好 的应 用。 国内虽然起步较晚，但用此体系分别成功地表达 出人 用 胰岛素 、乙肝表 面抗 原、降钙 素 、人 血清 蛋 白等几十种 蛋 白质 。此 外 ，许 多难 于 用其 它 系统 表达 的蛋 白在 这一 系统 中得到 成功 表 达 ，且 表达 量较 为可 观 。到 目前 为止 ，国 内外 用该 系统 成功 地 表达 出了几百种蛋 白质 。这些尝 试为促进人们 认 识分 子生物 学领 域 的许多 问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 以及 P．Pastoris 酵母 自身的背景奠定了实验基础，也必将使这一 表达 系统更加完善 。在不 断 的尝试 和 改进 中 ，P． Pastoris在分 子生物 学理 论 和 应 用领 域将 发 挥 出 越来越重要 的作 用。 参 考 文 献 瞿礼嘉，顾红雅，胡苹，等．现代生物技术导论[M]．第一版． 北京 ：高等教育出版社。1998． 卢圣栋 ．现代分子生物学实验技术【M]．北京：中国协和医科 大学出版社。1999． 彭毅 ，步威 ，康 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的有益菌，又是病鱼的致病菌，但它只是成为草鱼 肠道的单一菌落才发生强烈 的致病效应，但当草 鱼肠道存在与之有一定抗衡能力 的哈夫 尼亚菌 时，它的致病力就显著下降 ，由此，初步说明正常 草鱼肠道需要一个平衡的微生态 ，该微生态平衡 需有多种菌维持。 致谢 ：在本篇论 文的 实验设计和撰 写过程 中得到 了 南京师范大学赵 庆新博士的 悉心指 导和 大力支持 ，谨 表 衷心感谢 ! 参 考 文 献 [1】 黄琪琰．水产动物疾病学[M]．上海：上海科学技术 出版社， 1993，112— 113． [2] 徐伯亥．熊木林，韩先朴，等．二 龄草鱼肠炎病的研究[J]．水 生生物学报 ，1987。il(1)：73～82． [3】 黄琪琰，宋承方．鱼病防治实用技术[M]．北京：农业出版社， 1992，70-- 71． [4] 陈翠珍，张晓君，房 海，等．草鱼肠炎 的病原 菌检验与分析 [J]．中国兽医科技 ，1999，29(1)：5—6． 【s] 李振林．徼生物学及检验技术【M]．广州：广东科技出版社， 1997，64，72，83，93— 96，132，142。149-- 150，184． 【6] 俞大绂，李季伦．徼生物学【M]．北京 ：科学 出版社。1985。91 — 92． [7] 刘恭植．微生物学和微生物学检验[M]．北京：人民卫生 出版 社，1988，147，209--211。239，265--276． [8] 陈孝煊，吴志新，刘毅辉 ，等．呋喃哩酮对草鱼肠道菌群的影 响[J]．水利渔亚 ，1999，19(3)：34—36． [9] 周文豪 ，陈孝煊 ，张冬晓，等．摄食不同饵料对草鱼肠道 菌群 影响的研究【】]．华中农亚大学学报 ，1998，17(3)：252--255． A Study on Adj ustion Miorobial Ecosystem of Grass Carp With Baterial Entertis wu Xiaofeng，ZHAO Qingxin (Department of Biology，Yancheng University of Teacher3 Training，Jiangsu，Yancheng，224001) Abstract After analyzing intestinal bacterium of healthy Grass carp an d Grass carp with Bacteria len tertis，we found that therewere suchbactexiurn asAe．Fo'mo~ ，Hafnia， vobacterium。and 80o11。thatininstances oihealthyGrass carpandthere were hardly arebactexium apart from Aeromonas in instine of the Grass carp with Bacterial enteritis．Antagon~m exists between Hafnia and }rD Io，ms．Backexperlment showed that three kinds of A rD7加，l口s could nlake Grass carp catch Bacterial enteri． tis．Treating experiment，based on microbial ecosystem suggests that Hafnia can improve the balance oi instine o{grass carp th Bacterial enteritis． Keywords Grass carp，Bacterial enteritis，Adjusting rn~crobial ecosystem． 维普资讯 http://www.cqvip.com