代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌研究进展

微生物学通报 APR 20, 2008, 35(4): 572~576 Microbiology © 2008 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@im.ac.cn 基金项目：国家“863计划”课题资助项目(No. 2002AA514010, No. 2001AA514024) * 通讯作者：Tel: 010-68902330; : cnu_xsyang@263.net 收稿日期：2007-09-06; 接受日期: 2007-11-28 专论与综述 代谢木糖产乙醇的酿酒酵母 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 菌研究进展 张金鑫 田 沈 刘继开 张亚珍 杨秀山* (首都师范大学 生命科学学院 北京 100037) 摘 要: 随着能源价格的持续上涨, 使用木质纤维素生产燃料乙醇已具有重要的实践意义。木糖 是多数木质纤维素水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖, 传统乙醇生产菌株酿酒酵母不能利 用木糖, 这为使用以木质纤维素为原料发酵生产乙醇带来了困难。多年以来人们试图通过基因 工程和细胞融合等方法对其进行改造使其能够代谢木糖生产乙醇。本文主要介绍这方面的研究 进展。 关键词: 酿酒酵母, 木糖, 乙醇, 基因工程, 细胞融合 Progress of Engineered Saccharomyces cerevisiae of Xylose Metabolism and Fermentation for Ethanol Production ZHANG Jin-Xin TIAN Shen LIU Ji-Kai ZHANG Ya-Zhen YANG Xiu-Shan* (College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037) Abstract: With the constant rise of energy price, it has a great practical meaning of using lignocellulose to produce ethanol. Xylose is a kind of monosaccharide whose content is only less than glucose in most ligno- cellulosic hydrolysates. There is some difficulty of producing ethanol from lignocellulose by the traditional ethanol production strain Saccharomyces cerevisiae, because it cannot metabolize xylose. People have tried to use genetic engineering technology and cell fusion method to modify Saccharomyces cerevisiae to make it metabolize xylose and produce ethanol for many years. This review indroduced the progress in this field. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Xylose, Ethanol, Genetic engineering, Cell fusion 石油价格的持续上涨和温室效应引起的全球变 暖 , 使得人们越来越重视可再生能源的开发和利 用。生物质能便是一种重要的可再生能源, 以生物 质为原料生产燃料乙醇具有广阔的发展空间。长期 以来, 人们利用淀粉和糖类发酵生产乙醇。这些原 料成本较高, 大大限制了生物质燃料乙醇产业的发 展。在全球每年光合作用生产的高达 1500 亿吨~ 2000 亿吨的生物质中 80％以上为木质纤维素类物 质, 它十分廉价且容易获得, 因此以木质纤维素为 原料生产燃料乙醇, 具有重要的实践意义。 木质纤维素是纤维素、半纤维素和木质素等的 聚合物。利用酸解或酶解的方法可将木质纤维素转 化为大量的五碳糖(木糖和阿拉伯糖) 和六碳糖(葡 萄糖、半乳糖和甘露糖)。木糖在大多数木质纤维素 水解物中是含量仅次于葡萄糖的一种单糖 , 可达 30％。分析 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明, 充分利用木质纤维素原料中的木 张金鑫等: 代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌研究进展 573 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 糖发酵生产乙醇能使乙醇产量在原有基础上提高 25％[1]。所以, 如何通过对已有菌株进行改造使其能 高效利用木糖产乙醇已成为使木质纤维素资源得以 充分利用的关键问题之一。 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)作为工业 上生产乙醇的优良菌株, 多年以来人们试图通过基 因工程和细胞融合等方法对其进行改造使之能够代 谢木糖生产乙醇。本文主要介绍这方面的研究进展。 1 木糖的代谢 木糖进入微生物细胞后首先要转化为其异构体 木酮糖以便进入戊糖磷酸途径(PPP)。自然界中木糖 转化为木酮糖的途径有两条。在某些细菌中, 通过 木糖异构酶(Xylose isomerase, XI)直接将木糖转化 为木酮糖。在可利用木糖的酵母菌中, 木糖首先在 木糖还原酶(Xylose reductase, XR)作用下被还原为 木糖醇 (Xylitol), 再在木糖醇脱氢酶 (Xylitol dehy- drogenase, XDH )作用下生成木酮糖(Xylulose)。木酮 糖再经木酮糖激酶(Xylulose kinase, XK)作用生成 5- 磷酸木酮糖 (Xylulose-5-phosphate), 由此进入戊糖 磷酸途径(PPP)。PPP途径的中间产物 6-磷酸葡萄糖 和 3-磷酸甘油醛通过糖酵解途径生成丙酮酸, 丙酮 酸在缺氧条件下被丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶脱羧 还原为乙醇 (图 1) 。 图 1 细菌和酵母的木糖代谢途径 Fig. 1 Xylose metabolic pathway in bacterium and yeasts 2 应用基因工程技术构建重组酿酒酵母 发酵木糖生产乙醇 2.1 引入木糖向木酮糖转化途径 酿酒酵母不能发酵木糖, 但能发酵其异构体木 酮糖, 因此构建利用木糖产乙醇的重组酿酒酵母有 两个策略：一是在酿酒酵母中克隆并表达天然利用 木糖酵母菌的两个基因, 即木糖还原酶基因 XYL1 和木糖醇脱氢酶基因 XYL2; 二是在酿酒酵母中克隆 并表达木糖异构酶基因 XYLA。 在酿酒酵母中同时表达木糖还原酶基因(XYL1) 和木糖醇脱氢酶基因(XYL2)可使酿酒酵母获得利用 木糖的能力。但是, Kötter 等[2]进行了深入研究, 在 厌氧条件下使用表达树干毕赤酵母 (Pichia stipi- tis)XYL1, XYL2的酿酒酵母转化子 pRD1进行批式发 酵实验, 当木糖浓度为 21.7 g/L 时, 乙醇产量只有 0.07 g/g, 乙醇体积产率仅为 0.07 g/(L·h), 而木糖 醇产量为 0.46 g/g, 木糖被转化成了大约等摩尔的 木糖醇和乙醇（表 1）。这主要是因两种氧化还原 酶所需的辅因子不平衡而引起的。P. stipitis的木糖 还原酶可分别以 NADH 和 NADPH 为辅酶, 但对 NADPH的亲和力大。而木糖醇脱氢酶(XDH)只有利 用 NAD+才能使木糖醇氧化为木酮糖。在厌氧条件 下, 因 NAD+不能再生而导致胞内氧化还原不平衡 而使木糖醇积累并向胞外分泌。人们曾试图通过改 变菌种的遗传背景而使木糖代谢过程中细胞内氧化 还原状态维持平衡, 如在敲除 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 基因(ZWF1)或 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(GDN1) 的酿酒酵母中同时超表达外源 XYL1、XYL2 及自身 的木酮糖激酶基因(XKS1), 分别构建了重组酿酒酵 母 TMB3255和 TMB3008, 其乙醇产率均显著提高。 在敲除 ZWF1基因构建的工程菌 TMB3255中, 最高 乙醇产量达 0.41 g/g, 木糖醇产量最低为 0.05 g/g, 但这些突变同时降低了木糖的吸收速率 [3]。 Watanabe等[4]通过对 P. stipitis的 XDH进行定点诱 变, 得到了一个对 NADP+亲和力提高 4500 倍且催 574 微生物学通报 2008, Vol.35, No.4 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 化效率与野生型 XDH相当的酶。最近证明, 当此酶 与 P. stipitis野生型 XR共表达于 S. cerevisiae, 混糖 发酵时, 与同时表达 P. stipitis野生型XR和XDH的 重组菌相比, 木糖醇的分泌减少了 86％, 乙醇产量 增加了 41％, 达 0.46 g/g[5]。有研究发现, XYL1 与 XYL2 相对表达水平的变化也影响最终代谢产物的 形成[6]。Eliasson[7]等指出, 建立在动力学模型基础 上的模拟数据显示三种酶活 XR/XDH/XK 比值为 1:≥10: ≥4时, 木糖醇的积累最少。基于这一理论, 我研究组正将 XYL2和 XKS1分别置于不同强度的启 动子控制下并通过诱导型启动子人为控制 XYL1 的 表达量, 试图通过优化三种酶的酶活水平减少木糖 醇的积累增加乙醇产量[8]。 在酿酒酵母中引入木糖异构酶基因(XYLA)是使 其获得代谢木糖能力的又一途径。该基因曾先后从 大肠杆菌等多种细菌中克隆得到, 并分别连接于酵 母组成型启动子下, 转化于酿酒酵母中。但各种来 源的 XYLA基因在酿酒酵母中均没有得到活性表达。 直到 Walfridsson[9]等克隆高温细菌 Thermus ther- mophilus 的木糖异构酶基因并首次在酿酒酵母中得 到活性表达。但该重组菌株表达的 XI的最适温度为 85 , ℃ 在乙醇发酵的常规温度(30 )℃ 时, 其活性仅 为最适条件下酶活的 4％。在此基础上 Lonn 等[10] 用易错 PCR方法对 T. thermophilus的 XYLA进行定 向改造, 试图解决 XI 最适温度过高的问题, 但效果 仍不理想。Kuyper 等[11]将一种厌氧真菌 Piromyces sp. E2 的木糖异构酶基因 XYLA 首次在酿酒酵母中 高水平活性表达, 但此重组菌以木糖为单一碳源生 长缓慢。经过对表达 XYLA 的酿酒酵母进行进化工 程改造, 获得了能在木糖上厌氧生长并产乙醇的菌 株 RWB-202-AFX[12]。为了进一步提高乙醇产率, 除 了表达 XYLA 基因, Kuyper等[13]又将从木糖转化到 糖酵解中间产物所需的全部基因均过量表达, 同时 将酿酒酵母的醛糖还原酶基因 GRE3 敲除以减少木 糖醇产生而得到重组菌 RWB217, 其利用木糖产乙 醇 能 力 可 达 0.43 g/g, 乙 醇 产 生 速 度 达 到 0.46 g/(g·h)（表 1）。由于通过木糖异构酶将木糖 转变为木酮糖仅需要一步反应且不需任何辅酶, 所 以这一路径的开拓是十分有意义的。 2.2 下游代谢途径的改造 木酮糖激酶(xylulokinase, XK)催化木酮糖转化 为 5-磷酸木酮糖, 处于木糖代谢物进入 PPP的节点, 是提高木糖代谢向下游进行的关键酶。酿酒酵母本 身具有该酶 , 但表达量不大。研究表明在表达 P. stipitis 的 XYL1、XYL2 的同时超表达自身木酮糖激 酶基因(XKS1)的重组酿酒酵母, 木糖利用水平和乙 醇得率都有所提高[14]。Johansson 等[15]人研究发现, 对超表达 XKS1 和 XYL1、XYL2 的两株重组酿酒酵 母, 乙醇产量得以增加, 但同时木糖总消耗量也大 幅降低了 50％。这被认为是因过量的木酮糖激酶使 胞内的 ATP水平大大降低, 从而对细胞生长产生了 毒性。Jin等[16]将 P. stipitis的木酮糖激酶基因(XYL3) 在其自身启动子控制下适度表达于已表达 P. stipitis 的 XYL1 和 XYL2 的酿酒酵母中 , 构建出重组菌 FPL-YSX3, 其细胞生长状况较好且木糖醇积累明 显减少乙醇产量增加, 这证明适量表达 XYL3 是需 要的。 表 1 几种重组酿酒酵母木糖厌氧发酵和乙醇生产情况 Table 1 Performance of several recombinant S. cerevisiae strains in the production of ethanol from xylose in anaerobic fermen- tation experiments 菌种 Strains 木糖 (g/L) Xylose 乙醇产量 (g/g) Ethanol yield 乙醇体积产率 [g/(L·h)] Volumetric ethanol productivity 木糖醇产量(g /g) Xylitol yield pRD1 21.7 0.07 0.07 0.46 TMB3008 50 0.38 0.27 0.13 TMB3255 50 0.41 0.29 0.05 FPL-YSX3 40 0.12 0.01 0.27 RWB202-AFX 20 0.42 / 0.02 RWB217 20 0.43 / 0.06 TMB3050 50 0.29 / 0.23 TMB3057 50 0.33 0.13 0.22 张金鑫等: 代谢木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌研究进展 575 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn 5-磷酸木酮糖进入 PPP 途径后, 需要在转酮酶 (transketolase, TKL)和转醛酶(transdolase, TAL)作用 下进一步转化。酿酒酵母自身具有木酮糖代谢的下 游酶系, 但其活性较低, 也限制了木糖代谢向下游 进行而影响乙醇的产生。Walfridsson等[17]在研究含 有转酮酶和转醛酶以及木糖还原酶, 木糖醇脱氢酶 等基因的重组酿酒酵母利用木糖的情况时发现, 超 表达转醛酶基因(TAL1)可以增强重组菌株对木糖的 利用并加快重组菌的生长。Karhumaa等[18,19]构建的 重组酿酒酵母 TMB3050 和 TMB3057, 这两株菌都 在表达P. stipitis的XYL1、XYL2基础上过表达TKL1、 TAL1 和 XKS1, 它们的过表达明显增加了重组菌在 木糖上生长的速度和乙醇产量。这证明木糖代谢下 游流向乙醇生成方向的强化也是需要的。 3 原生质体融合的方法构建发酵木糖的酵 母工程菌 原生质体融合技术克服了细胞壁的天然屏障 , 排除了细胞接合型的限制, 可实现多基因重组, 也 是提高酵母菌发酵木糖产乙醇能力的重要方法。 Kordowska 等[20]得到了树干毕赤酵母和酿酒酵母的 融合子。融合子耐乙醇性能高于亲本毕赤酵母, 但 融合子发酵木糖产乙醇的速率小于毕赤酵母。 Dziuba E与 Chmielewska J[21]以酿酒酵母( D43) 与休 哈塔假丝酵母(ATCC 58779), 嗜鞣管囊酵母(ATCC 32691 和 ATCC 60392)进行了原生质体融合, 融合 子 120 h能完成对木糖的发酵。Chmielewska J [22]后 来又获得了酿酒酵母(D43)与毕赤酵母(ATCC 58376) 的属间融合子, 融合子发酵木糖产乙醇量与亲株毕 赤酵母 (0.389 g/g)相当, 但木糖醇的产量比亲株低 40％多, 并且木糖发酵的周期由 10 d缩短至 7 d。发 酵葡萄糖与木糖质量比为 7:3的混合糖时, 7 d后乙 醇产量达到 0.377 g/g, 木糖醇产量为 0.038 g/g。毛 华等[23]获得了树干毕赤酵母和酿酒酵母的融合子。 融合子厌氧发酵木糖以及共发酵木糖-葡萄糖能力 均明显优于亲株, 其耐受乙醇的最大浓度也比亲株 提高了一个百分点。张明等 [24]获得了酿酒酵母 (PW218)和粟酒裂殖酵母(PW232)的属间融合子, 融 合子 F10 利用葡萄糖、木糖及两种糖混合液产乙醇 的能力大大高于两亲株; 融合子 F2对葡萄糖、木糖 及两种糖混合液的发酵能力亦较两亲株高, 其中利 用木糖产乙醇的量分别比亲株 PW218 和 PW232 提 高了 1.38倍和 2.65倍。钟桂芳等[25]通过属间融合获 得了休哈塔假丝酵母和高温酿酒酵母的融合子。融 合子能在 45℃下发酵木糖生产乙醇, 所产乙醇体积 分数为 1.675％, 转化率为 68.8％。其在兼性厌氧条 件下发酵木糖、葡萄糖混合糖的能力优于亲株, 且 与亲株比较, 融合子乙醇耐受能力提高了 1％。我研 究组曾用 PEG、Ca2+诱导酿酒酵母和嗜鞣管囊酵母 进行融合, 得到了一株融合子 F1, 其发酵 50 g/L木 糖 96 h, 乙醇产量为 0.062 g/g, 是嗜鞣管囊酵母亲 株的 2.8倍, 发酵 30 g/L葡萄糖和 20 g/L木糖的混 合糖 72 h, 木糖醇产量为 0.44 g/g, 是理论产率的 43.56％, 比嗜鞣管囊亲株高 4 倍, 乙醇产量也达到 9.52 g/L。 4 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 与展望 以木质纤维素为原料生产乙醇, 其关键之一是 开发出能有效利用各种糖类高效生产乙醇的微生物 菌种。人们通过对酿酒酵母进行基因工程改造和细 胞融合, 已经构建出能够代谢葡萄糖和木糖产乙醇 的酵母菌。但这些菌株还存在着不少问题, 比如乙 醇产量低, 副产物较多, 以及融合子性能不稳定等。 人们正在对酿酒酵母进行进一步改造以提高其利用 木糖生产乙醇的能力。比如对其细胞膜上的转运体 进行改造, 以提高细胞摄取木糖的能力。或者通过 进化工程及驯化手段对重组酵母或融合子进一步改 良。也可以将自然筛选到的能高效利用木糖并耐受 抑制物的野生酵母菌株与酿酒酵母等进行原生质体 融合, 以期改良菌种的生产性能。 随着能源价格持续上涨和因温室气体过量排放 而导致的全球变暖趋势的愈演愈烈, 利用木质纤维 素材料生产燃料乙醇已成为世界各国研究的热点。 相信随着研究的深入, 必将有性能更优良的木糖代 谢工程菌应用于燃料乙醇的生产。 参 考 文 献 [1] Nigam JN. 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