一种抗肝纤维化中药复方组合物及其应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112755084A(43)申请公布日2021.05.07(21)申请号202110134128.7(22)申请日2021.01.28(71)申请人南京中医药大学地址210023江苏省南京市栖霞区仙林大学城仙林大道138号(72)发明人郑仕中　谭善忠　张峰　王飞虾　陈利　连娜琦　(74)专利代理机构北京精金石知识产权代理有限公司11470代理人强红刚(51)Int.Cl.A61K36/752(2006.01)A61P1/16(2006.01)权利要求书1页说明书7页附图2页(54)发明名称一种抗肝纤维化中药复方组合物及其应用(57)摘要本发明公开了一种具有抗肝纤维化作用的中药复方及其应用。该中药复方由下列重量份数的中药原料制成：黄芪10‑30份，太子参10‑30份，当归5‑15份，女贞子5‑15份，茯苓5‑15份，炒白术10‑30份，陈皮5‑15份，酒黄芩5‑15份，炙甘草3‑10份。本发明根据肝纤维化的发病机理，采用辨证论治的方法，结合药理实验筛选组方，方中各药物科学配伍后，临床上对慢加急性肝衰竭肝衰竭患者有良好的保肝作用，体内对肝纤维化具有良好防治作用和效果，体外抑制活化型肝星状细胞增殖，保护肝细胞损伤的功效，具有良好的抗肝纤维化的作用，是一种非常有前景的中药复方，具有较好的市场推广价值。CN112755084ACN112755084A权　利　要　求　书1/1页1.一种抗肝纤维化中药复方组合物，其特征在于，由下列重量份数的中药原料制成：黄芪10～30份，太子参10～30份，当归5～15份，女贞子5～15份，茯苓5～15份，炒白术10～30份，陈皮5～15份，酒黄芩5～15份，炙甘草3～10份。2.如权利要求1所述的中药复方组合物，其特征在于，所述中药复方组合物由下列重量份数的中药原料制成：黄芪30份，太子参30份，当归10份，女贞子10份，茯苓10份，炒白术30份，陈皮10份，酒黄芩10份，炙甘草3份。3.如权利要求1所述的中药复方组合物，其特征在于，制备方法包括以下步骤：(1)称取原料，加入原料药重量1‑10倍量的水，煮沸45‑60min后，煎煮后滤出第一药液；再加入原料药重量1‑9倍量的水，煎煮35‑55min后滤出第二药液；再加入原料药重量1‑8倍量的水，煎煮30‑50min后滤出第三药液；(2)将前述步骤(1)制备所得的第一药液、第二药液、第三药液合并，浓缩至相对密度为1.02‑1.25的浓缩液即中药浓缩液；(3)取步骤(2)所制备得到的中药浓缩液，在‑10℃至‑50℃下冻结成固态，然后在真空1.3‑13Pa下冷冻真空干燥，得到粉状中药复方组合物。4.根据权利要求1至3任一项所述中药复方组合物，其特征在于，将各原料药制备的中药复方组合物和药学上可接受的载体制备成口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂剂型。5.如权利要求1至3任一项所述中药复方组合物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。6.如权利要求1至3任一项所述中药复方组合物在制备治疗慢加急性肝衰竭患者肝脏损伤的作用。2CN112755084A说　明　书1/7页一种抗肝纤维化中药复方组合物及其应用技术领域[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有抗肝纤维化作用的中药复方及其应用。背景技术[0002]肝纤维化是各种慢性肝病发展中的共同病理过程，各种原因导致肝组织内细胞外基质成分过度增生与异常沉积，进而引起肝脏结构或功能异常改变，病情发展，可形成肝硬化导致肝脏功能障碍与衰竭，严重危害生命健康。延缓甚至逆转肝纤维化，对减少严重并发症的发生、改善病人生活质量具有重要意义。[0003]肝脏作为发病的主要脏器，其生理特点有其独特性，体阴而用阳，主藏血而体阴涵养肝气，主疏泄而用阳调畅气机，可以促进胆汁分泌和排泄、促进脾胃的运化，当人体处于病理状态时，肝脏气血阴阳失衡，肝气肝阳容易亢盛而上逆或者郁滞，而属阴的肝阴肝血容易亏损，可导致外泄，最终可导致肝脏的气血阴阳出现亏虚，尤以肝阴肝血为主；脾为肝之所克，肝病最易传脾，可致肝脾不调影响脾脏正常生理功能，导致脾气渐亏；“精血同源”即“肝肾同源”，肝血肾精皆由水谷精微通过脾胃运化作用化生并充养，同时相互滋生，肝阴不足可进一步累及肾阴，导致肝肾不足，这些因素共同影响下，肝病日久最终可导致肝脾肾三脏同病并出现气阴两虚症候。中医对肝纤维化的治疗多以活血化瘀为主、益气养阴为辅。但当前对肝纤维化的辨证分型各执己见，尚无统一、规范化的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，且各证常常相兼，暂无抗肝纤维化疗效显著的药物。发明内容[0004]本发明提出一种具有抗肝纤维化作用的中药复方提取物及药学上可接受的胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液剂型的药物，以及其制备方法，以及其在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。[0005]本发明提出的一种具有抗肝纤维化作用的中药复方组合物，其由下列重量份数的中药原料制成：黄芪10‑30份，太子参10‑30份，当归5‑15份，女贞子5‑15份，茯苓5‑15份，炒白术10‑30份，陈皮5‑15份，酒黄芩5‑15份，炙甘草3‑10份。[0006]优选地，所述中药复方组合物由下列重量份数的中药原料制成：黄芪30份，太子参30 份，当归10份，女贞子10份，茯苓10份，炒白术30份，陈皮10份，酒黄芩10份，炙甘草3份。[0007]本发明提出的所述具有抗肝纤维化作用的中药复方组合物的制备方法，所述方法为：称取所述中药复方组合物的每剂药材的生药原料，加入水，煮沸后，煎煮，过滤得到药液；前述步骤重复三次，将数次过滤得到的药液合并，即得到中药粗提物；然后，所述中药粗提物煎煮，浓缩至稠厚状即得到中药浓缩液；所述中药浓缩液经冷冻真空干燥，即得到粉状中药复方提取物即所述中药复方组合物。[0008]具体地，所述中药复方组合物的制备方法包括以下步骤：[0009](1)称取如上所述中药复方组合物的药材原料，加入水，煮沸后，煎煮，滤出第一药3CN112755084A说　明　书2/7页液；再加入水，煎煮后滤出第二药液；再加入水，煎煮后滤出第三药液；[0010](2)将前述步骤(1)制备所得的第一药液、第二药液、第三药液合并得到中药粗提物，煎煮浓缩至稠厚状即中药浓缩液；[0011](3)取步骤(2)所制备得到的中药浓缩液，冷冻真空干燥，得到粉状中药复方提取物即所述中药复方组合物。[0012]在具体实施 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 中，所述制备方法如下：[0013](1)称取所述中药复方组合物的每剂药材的生药原料，加入原料药重量1‑10倍(优选 10倍)量的水，煮沸45‑60min(优选为60min)后，煎煮后滤出第一药液；再加入原料药重量1‑9倍(优选9倍)量的水，煎煮35‑55min(优选为45min)后滤出第二药液；再加入原料药重量1‑8倍(优选8倍)量的水，煎煮30‑50min(优选为40min)后滤出第三药液；[0014](2)将前述步骤(1)制备所得的第一药液、第二药液、第三药液合并得到中药粗提物，煎煮浓缩至相对密度为1.02‑1.25的浓缩液即中药浓缩液；[0015](3)取步骤(2)所制备得到的中药浓缩液，在(‑10℃至‑50℃)下冻结成固态，然后在真空(1.3‑13Pa)下冷冻真空干燥，得到粉状中药复方提取物即所述中药复方组合物。[0016]本发明还提出了一种药物组合物，其为包括如上所述的中药复方组合物和药学上可接受的辅料，所述药物组合物可制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂或口服液剂型。[0017]本发明还提出了所述抗肝纤维化中药复方组合物或药物组合物在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。[0018]其中，所述中药复方组合物或药物组合物用于临床上保护慢加急性肝衰竭患者肝脏功能的作用，体内治疗四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化病理进程，用于抑制活化型肝星状细胞增殖，保护肝细胞损伤。[0019]本发明还提出了所述抗肝纤维化中药复方组合物在制备治疗慢加急性肝衰竭患者肝脏损伤的作用。[0020]其中，所述中药复方组合物或药物组合物临床上具有保护慢加急性肝衰竭患者肝脏功能的作用。[0021]本发明在中医理论的指导下，辩证施治，结合肝纤维化的发病机理，以中医上补气健脾治本，标本兼治，共奏扶正固本祛邪的整体治疗理念为出发点进行配伍组方。[0022]本发明经过文献检索和实验验证以及发明人的创造性劳动贡献，筛选得到所述具有抗肝纤维化作用的中药复方，精选黄芪，太子参，当归，女贞子，茯苓，炒白术，陈皮，酒黄芩，炙甘草九味中药进行组方。[0023]本发明的有益效果在于：[0024]本发明提供的具有抗肝纤维化作用的中药复方与现有技术相比具有以下优势：[0025](1)本发明提供的具有抗肝纤维化作用的中药复方，本中药复方在中医理论的指导下，精选黄芪，太子参，当归，女贞子，茯苓，炒白术，陈皮，酒黄芩，炙甘草九味中药进行组方：本方中重用黄芪，佐以太子参为君药，黄芪益气健脾，以补益为主，太子参补气健脾兼可生津，助黄芪扶正补虚改善气阴两虚；当归、丹参、益母草、桃仁为臣药，养血活血，与黄芪配伍，补气活血，使有形之血生于无形之气；白术、茯苓、大黄、栀子及女贞子为佐药，白术、茯苓健脾利湿，而配伍茵陈既可清热祛湿又可利肝胆，少佐大黄清热凉血，既有祛瘀作用又可防止出血，栀子清热利湿，女贞子滋补肝肾阴精，陈皮可以燥湿理气，防止壅滞；炙甘草为使4CN112755084A说　明　书3/7页药，调和诸药。全方清热活血、利湿退黄治标，补气健脾治本，标本兼治，共奏扶正固本祛邪之效。本发明提供的中药复方具有保护慢加急性肝衰竭患者肝脏的作用，本发明提供的中药复方具有抗肝纤维化作用，能明显抑制四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化进展。[0026](2)本发明提供的中药复方具有抗肝纤维化作用，能够下调四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型中肝损伤相关因子的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达，其中肝损伤相关因子指谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、结合胆红素(DBIL)、肝指数；本发明提供的中药复方也能缓解四氯化碳诱导的肝脏结构紊乱情况、抑制四氯化碳诱导下肝脏中胶原沉积情况。本方明所提供的中药复方组合物体外能抑制活化型肝星状细胞的增殖，抑制胶原生成；保护肝细胞免受LPS+D‑Gal 诱导的损伤，下调LPS+D‑Gal诱导的肝损伤因子表达，其中肝损伤相关因子指谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)。本发明提供的中药复方临床上具有保护慢加急性肝衰竭患者肝脏功能的作用。本方明所提供的中药复方组合物疗效确切，在肝纤维化治疗方面取得新突破，可在一定程度上填补我国目前肝纤维化治疗用药开发的领域空白。[0027](3)本发明提供的具有抗肝纤维化作用的中药复方，制备方法成本低、环保，可实现工业化大生产。[0028](4)本发明提供的具有抗肝纤维化作用的中药复方，可以和药学上可接受的载体制备成各种剂型，方便临床服用，有望开发成新的抗肝纤维化药物。附图说明[0029]图1为本发明实验例的中药复方对肝星状细胞增殖活性的影响和LPS+D‑Gal诱导肝细胞损伤的保护作用的示意图；[0030]A MTT测定本发明实验例的中药复方对HSC‑LX2细胞活力的影响。[0031]B MTT测定本发明实验例的中药复方对LPS+D‑Gal处理下肝细胞活力的影响。[0032]C光镜观察本发明实验例的中药复方对LPS+D‑Gal处理下肝细胞形态的影响。[0033]图2为本发明实验例的中药复方可以显著降低LPS+D‑Gal诱导肝细胞损伤相关指标示意图；[0034]A试剂盒测定本发明实验例的中药复方对LPS+D‑Gal处理下肝细胞中ALT含量的影响。[0035]B试剂盒测定本发明实验例的中药复方对LPS+D‑Gal处理下肝细胞中AST含量的影响。[0036]C试剂盒测定本发明实验例的中药复方对LPS+D‑Gal处理下肝细胞中LDH含量的影响。[0037]图3为本发明实验例的中药复方不同浓度对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化肝脏病理及胶原沉积的影响示意图。小鼠分组为：1表示正常组；2表示四氯化碳诱导的肝纤维化模型组； 3表示肝纤维化模型+本发明实验例的中药复方低剂量治疗组；4表示四氯化碳诱导的肝纤维化模型组；5表示肝纤维化模型+本发明实验例的中药复方中剂量治疗组；6表示四氯化碳诱导的肝纤维化模型组；3表示肝纤维化模型+本发明实验例的中药复方高剂量治疗组。[0038]A肝脏拍照、HE染色、天狼星红染色及Masson染色表明本发明实验例的中药复方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化进展的影响。5CN112755084A说　明　书4/7页具体实施方式[0039]结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。[0040]本发明的具有抗肝纤维化作用的中药复方组合物，各复方的具体配方及用量如下：[0041]实施例1：配方1黄芪20g太子参10g当归10g女贞子10g茯苓25g炒白术10g陈皮8g酒黄芩8g炙甘草5g[0042]实施例2：配方2黄芪25g太子参15g当归12g女贞子10g茯苓25g炒白术10g陈皮8g酒黄芩8g炙甘草3g[0043]实施例3：配方3黄芪30g太子参10g当归10g女贞子10g茯苓30g炒白术10g陈皮10g 酒黄芩10g炙甘草3g[0044]以上三种配方的制备方法均按照以下方法实施：[0045](1)称取所述中药复方组合物的每剂药材的生药原料，加入原料药重量10倍量的水，煮沸后，煎煮60min后滤出第一药液；再加入原料药重量9倍量的水，煮煎45min后滤出第二药液；再加入原料药重量8倍量的水，煎煮40min后滤出第三药液；[0046](2)将前述步骤(1)制备所得的第一药液、第二药液、第三药液合并得到中药粗提物，煎煮浓缩至稠厚状即中药浓缩液；[0047](3)取步骤(2)所制备得到的中药浓缩液，冷冻真空干燥，得到粉状中药复方提取物即所述中药复方组合物。[0048]为了验证本发明中药复方各组分配比的优选效果，将上述配方1、配方2、配方3制成中药复方组合物，进行平行实验，发现按照配方3所制中药复方组合物药效最好，因此确定配方3组分配比为最优配比方案。以下实施例中所述中药复方配比均按照配方3进行。[0049]实施例4：所提供的中药复方在临床上发挥保肝作用。[0050]技术方法：[0051]1.患者纳入纳入2013年8月至2016年3月在南京中医药大学附属南京医院就诊的慢加急性肝衰竭患者97例。[0052]2.分组及给药[0053]上述患者随机分为对照组和给药组。对照组(西医常规治疗组)：根据2012年《肝衰竭诊疗指南》，该组患者仅给予常规西医内科治疗，不使用中草药及相关中成药。给药组服用本发明实施例3所制备的片剂，水煎服，1剂/日，分两次口服，疗程1年。[0054]3.指标 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 血清中肝损伤指标ALT、TBIL、Alb、Cr、PTA、Na检测使用生化检测试剂盒，实验操作方法按照生化检测试剂盒说明书。[0055]表1治疗前两组实验室检查比较6CN112755084A说　明　书5/7页[0056][0057]表2治疗后两组实验室检查差值比较(±s)[0058][0059][0060]实验结果如表1及表2所示，所提供的中药复方对于慢加急性肝衰竭患者肝脏具有明显的保护作用。[0061]实施例5：本发明体外抑制活化型肝星状细胞增殖，抑制LPS+D‑Gal诱导的肝细胞损伤。[0062]技术方法：[0063]1、细胞的培养[0064]人肝星状细胞LX2和人肝细胞LO2培养于含10％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素双抗的 DMEM培养基中。所有细胞均培养在37℃恒温培养箱(湿度95％，5％CO2浓度)中。[0065]2、MTT法测定细胞增殖[0066]取对数期的细胞消化后根据其增殖速度以不同密度(肝星状细胞2×104个/孔，肝细胞细胞1.5×104个/孔)接至96孔板，每孔100μL培养基。24h后，肝星状细胞组加入不同浓度实施例3所述复方，对照组加入等量的PBS，各组设6个复孔。肝细胞组LPS(10μg/mL)+D‑Gal (10mg/mL)诱导4h后，加入不同浓度中药复方提取物，对照组加入等量的PBS，各组设6 个复孔。继续培养24h，加入20μL MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h，然后吸掉上清，每孔加入200μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6 复孔，计算抑制率＝[(对照‑空白)‑(给药‑空白)]/(对照‑空白)×100％。[0067]图2结果所示，本发明实验例的中药复方抑制肝星状细胞增殖，并呈剂量依赖性。此外，本发明实验例的中药复方在体外对LPS+D‑Gal诱导的肝细胞具有保护作用。[0068]实施例6：本发明保护肝细胞损伤。7CN112755084A说　明　书6/7页[0069]技术方法：[0070]1、试剂盒检测ALT、AST、LDH[0071]将20000个肝细胞接入到6孔板中，待细胞贴壁后加入不同浓度实施例3所述复方，提取细胞培养基，试剂盒检测培养基中ALT、AST、LDH含量，每组实验重复三次。实验操作方法按照生化检测试剂盒说明书。[0072]图3结果所示，本发明实验例的中药复方抑制肝细胞免受LPS+D‑Gal诱导的肝细胞损伤因子表达，并呈剂量依赖性。[0073]实施例7：本发明缓解四氯化碳诱导的小鼠肝损伤。[0074]技术方法：[0075]1、四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型建立[0076]SPF级雄性ICR小鼠(8周龄)，体重20‑25g，由实验前，动物进行一周的适应性饲养。造模前，将小鼠饲养在标准条件下，室温为20±2℃，相对湿度为40±5％，光照/黑暗循环为 12小时。使用四氯化碳(CCl4)和橄榄油[1:10(v/v)]的混合物通过腹腔注射(0.05mL/10g 体重)诱导小鼠肝纤维化。[0077]2.血清ALT、AST、DBIL的检测[0078]血清中肝损伤指标ALT、AST、DBIL检测使用生化检测试剂盒，实验操作方法按照生化检测试剂盒说明书。检测结果见表3。[0079]表3本发明实验例的中药复方对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中血清肝损伤指标的影响[0080][0081]*，#P＜0.05，**，##P＜0.01，*为肝纤维化模型组与正常组相比，#为治疗组与肝纤维化模型组相比。[0082]表3结果所示，随着本发明实验例的中药复方浓度的增加，小鼠血清中ALT、AST、DBIL相比四氯化碳模型组明显减少。表明本发明实验例的中药复方在四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中下调肝损伤指标ALT、AST、DBIL。[0083]实施例8：本发明在肝纤维化模型中缓解肝纤维化进程。[0084]技术方法：[0085]1、H&E染色[0086]小鼠颈椎脱臼处死后，解剖，剥离肝脏，去除多余结缔组织，放置在PBS中清洗一遍。在4％多聚甲醛中充分固定。根据小鼠的解剖位置的冠状面，切取组织，放置在包埋盒8CN112755084A说　明　书7/7页中，用铅笔标注相关信息后进行组织的脱水、透明、浸蜡后进行H&E染色。[0087]2、Masson染色[0088]肝脏组织石蜡切片用Bouin液或Zenker液固定至过夜，使用流水冲洗至无色。天青石蓝染色5min，Mayer’s苏木素染色5min，用1％盐酸乙醇液分化，流水冲洗，丽春红酸性品红液染色5‑10min，蒸馏水冲洗，用1％磷钼酸水溶液做处理5min，最后直接用苯胺蓝或亮绿染色5min，1％冰醋酸处理5min，95％乙醇、无水乙醇多次脱水，最后使用二甲苯做透明处理后中性树胶封固。在光学显微镜下观察并随机选取视野拍照。[0089]3.苦味酸天狼星红(sirius red)染色[0090]肝脏组织石蜡切片常规脱水。天青石蓝液染色处理5‑10min后，蒸馏水洗3遍。天狼星红饱和苦味酸液染色处理15‑30min。用无水乙醇分化与脱水。最后用二甲苯做透明处理，中性树胶封固。在光学显微镜下观察并随机选取视野拍照。[0091]图3结果所示，四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中肝脏结构紊乱，大量胶原沉积，肝纤维化病变明显。随着中药复方剂量的增加，肝脏的结构逐渐恢复，胶原沉积减少，肝纤维化病变减轻。表明发明实验例的中药复方在四氯化碳诱导小鼠肝纤维化模型中缓解肝纤维化进程。[0092]上述实施例仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。9CN112755084A说　明　书　附　图1/2页图1图210CN112755084A说　明　书　附　图2/2页图311