RNAiso Plus

Takara Code：D9108A RNAiso Plus （Total RNA 提取试剂） 宝生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 (大连)有限公司 说明书 目 录 内 容 页 码 ● 制品说明 1 ● 制品组成 1 ● 保存和运输 1 ● RNA 提取实验前的准备 1 ● 实验操作 2 ● RNA 提取操作流程图 3 ● 实验例 4 ● Troubleshooting 5 ● 参考文献 6 注 意 事 项 本制品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、 吞食等会中毒、导致灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护 物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛时， 应立即用大量的水冲洗以及前往医院治疗；接触到皮肤时，应立即用大 量的聚乙二醇 400（Polyethylene glycol 400）冲洗，严重时请前往医院 治疗；使用本制品后感觉不舒服时请前往医院治疗。 ● 制品说明 RNAiso Plus 是广谱型 Total RNA 提取试剂。实验操作快速方便，颜色鲜明，便于分层。 本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取 Total RNA。样品在 RNAiso Plus 中 能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（鲜红色下层），RNA 分布在 上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到 Total RNA。 RNAiso Plus 具有以下特性： 1. 广谱性强。可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取 Total RNA。 2. 纯度俱佳。提取的 Total RNA 纯度高，基本不含蛋白质及基因组 DNA，可以直接用于 Northern 杂交、 斑点杂交、mRNA 纯化、体外翻译、RNA 分解酶的保护 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 、RT-PCR、构建 cDNA 文库等各种分子 生物学实验。 3. 快速简便。实验操作快速方便，整个操作在一小时内便可完成。 4. 颜色鲜明。加入氯仿离心后，会形成无色的上清层和鲜红色的下层（有机层）。 ● 制品组成 RNAiso Plus* 100 ml * RNAiso Plus 中含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。若不小心接触到眼睛或皮肤时，请 立即到医院进行处理。 【试剂盒之外所需准备试剂】 ◆ 氯仿 ◆ 异丙醇 ◆ 75%乙醇（DEPC 处理水配制） ◆ RNase-free 水（制备方法：使用 RNase-free 的玻璃瓶，向超纯水中加入 DEPC 至终浓度 0. 1% （v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。） ● 保存和运输 1. 可以在室温下保存，建议在 2-8℃下避光保存，效果更佳。 2. 可以在常温下运输。 ● RNA 提取实验前的准备 RNA 制备的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因此， 在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等 等。通过以上 办法 鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载企业年金办法下载企业年金办法下载 可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。 【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1） 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37℃下处理 12 小时。 （2） 然后在 120℃下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 DEPC。 RNA 实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。 【试剂配制】 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60 分钟）或使用上述方法进行 DEPC 水处理灭菌后的 玻璃容器盛装（也可以使用 RNA 实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用 0.1%的 DEPC 处理后再 进行高温高压灭菌。 RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 -1- ● 实验操作 1. RNAiso Plus 的使用量情况如下。 样品量 RNAiso Plus使用量（ml） 10 cm2的贴壁培养细胞 1 107的悬浮培养细胞 1~2 100 µl 的白细胞 2 100 µl 全血 2 50～100 mg 的普通组织样品 1 50～100 mg 的特殊组织样品（肝、脾、骨及软骨等） 2 15～30 mg 的植物材料（多糖和多酚含量不高的） 1 2. 实验样品的研磨和匀浆。 A. 贴壁培养细胞 ① 倒出培养液，用 1×PBS 清洗一次。 ② 每 10 cm2生长的培养细胞中加入 1 ml的RNAiso Plus，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞 表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥 离细胞）。 ③ 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④ 室温静置 5 分钟。 B. 悬浮培养细胞 ① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心 2 分钟，弃上清。 ② 向每 107个细胞中加入l~2 ml的RNAiso Plus。 ③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 ④ 室温静置 5 分钟。 C. 动物组织、植物材料样品 ① 将超低温冻结的 RNA 提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间 不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响 RNA 的收率 和质量）。 ② 对于普通的 RNA 提取样品，可以向研钵中加入适量的 RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全 覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的 RNAiso Plus 的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。 ③ 将匀浆液转移至离心管中，室温静置 5 分钟。 ④ 12,000 g 4℃离心 5 分钟。 ⑤ 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 3. Total RNA 的提取。 ① 向上述步骤 2 的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈 振荡 15 秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相 现象）后，再室温静置 5 分钟。 ② 12,000 g 4℃离心 15 分钟。 ③ 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带 有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 ④ 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在 15～30℃下静置 10 分钟。 ⑤ 12,000 g 4℃离心 10 分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 -2- 4. RNA 沉淀的清洗。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75％的乙醇 l ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管 壁，12,000 g 4℃离心 5 分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制 RNA 中的盐离子含量，应尽量除净乙 醇）。 5. RNA 的溶解。 室温干燥沉淀 2～5 分钟（不可以离心或加热干燥，否则 RNA 将会很难溶解，有关 RNA 溶解可以参 考 Troubleshooting 中的相关说明），加入适量的 RNase-free 水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹 打沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80℃保存。 ● RNA 提取操作流程简图 -3- 适量的动植物组织或培养细胞 室温静置 5 分钟 加入 1/5 RNAiso Plus 体积量的氯仿 室温静置 5 分钟 将上清液转移至新的离心管中 室温静置 10 分钟 向沉淀中加入 1 ml 的 75%乙醇清洗沉淀 弃上清保留沉淀 溶解于适量的 DEPC 处理水中 加入适量的 RNAiso Plus 后匀浆 振荡混匀 12,000 g 4℃离心 15 分钟 加入与上清液等体积的异丙醇 12,000 g 4℃离心 10 分钟 12,000 g 4℃离心 5 分钟 干燥 12,000 g 4℃离心 5 分钟， 上清转移至新的 1.5 ml tube 中 ● 实验例 1. 从动物组织中提取 Total RNA。 使用本试剂盒从大鼠肝脏、心脏、脑、脾、肾、小肠、骨骼肌、胰腺等组织中提取了 Total RNA，电 泳结果见图 1。 1% Agarose 凝胶电泳图 M1：DL2,000 DNA Marker 1：Rat Liver 2：Rat Heart 3：Rat Brain 4：Rat Spleen 5：Rat Kidney 6：Rat Small Intestine 7：Rat Skeletal 8：Rat Pancreas 图 1.动物组织 RNA 提取结果电泳图 2. 从植物组织中提取 Total RNA。 使用本试剂盒从马铃薯块根、香菇子实体、烟草叶片、水稻叶片、芒果果实、花生果实等组织中提取 了 Total RNA，电泳结果见图 2。 1% Agarose 凝胶电泳图 M1：DL2,000 DNA Marker 1：马铃薯块根 2：香菇子实体 3：烟草叶片 4：水稻叶片 5：芒果果实 6：花生果实 图 2.植物组织 RNA 提取结果电泳图 3. 从全血中直接提取 Total RNA。 从全血中提取 RNA，通常需要分离白细胞，而使用 1 ml 本试剂可以直接从 100 μl 全血中提取 Total RNA，电泳结果见图 3。 1% Agarose 凝胶电泳图 M1：DL2,000 DNA Marker 1：-80℃保存的全血样品 2：新鲜的全血样品 图 3.全血 RNA 提取结果电泳图 -4- M1 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 M1 M1 1 2 4. 从培养细胞中提取 Total RNA。 使用本试剂盒从 HL-60 细胞、HT293 细胞、CHO-K1 细胞、Hela 细胞、香菇培养菌丝、酵母培养细 胞、E.coli JM109 细胞等培养细胞中提取了 Total RNA，电泳结果见图 4。 1% Agarose 凝胶电泳图 M1：DL2,000 DNA Marker 1：HL-60 细胞 2：HT293 细胞 3：CHO-K1 细胞 4：Hela 细胞 5：香菇培养菌丝 6：酵母培养细胞 7：E.coli JM109 细胞 图 4.各种培养细胞 RNA 提取结果电泳图 ● Troubleshooting 1. 一般情况下的组织或细胞中所能提取的 RNA 量如下表： 组织材料 起始样品量 Total RNA提取量 血 1 ml 15～20 μg 白细胞 1×107个 约20～40 μg 肝脏 1 g 约5,000 μg HL-60培养细胞 1×107个 约100 μg 烟草叶片 1 g 约1,000 μg 肾脏 1 g 约3,000 μg 骨骼肌 1 g 约1,500 μg 脑 1 g 约1,500 μg 2. 有关 RNA 的吸光度说明如下： 260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质 等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的 RNA的R值应在 1.8～2.2 之间，当R<1.8 时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R> 2.2 时， 说明RNA已经被水解成了单核苷酸。 在对核酸进行吸光度 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 时，需要注意稀释液应使用 TE Buffer。 3. 如何计算 RNA 的浓度？ RNA浓度=（OD260-OD320）×稀释倍数×0.04 μg/μl。 4. 提取的 RNA 中含有多糖怎么办？ 大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与 RNA 十分接近，因此很难将其从 RNA 中除去，使用此类组织材料提取 RNA 时，建议增加 RNAiso Plus 的使用量、采用 LiCl 沉淀的方 法或按照下述方法进行： 向裂解液中加入氯仿离心分层后，抽提水相中的 RNA，向水相中加入 0.25 ml 的异丙醇（每使用 1 ml RNAiso Plus），再加入 0.25 ml 的盐溶液（0.8 M 柠檬酸钠，1.2 M 氯化钠）轻轻反复颠倒数次混匀。 室温静置 5 分钟后，4℃ 12,000 g 离心 10 分钟（替代原来异丙醇沉淀，后续步骤相同）。但此方法会 损失大量 RNA，导致收量降低，small RNA 的损失尤其严重。 -5- M1 1 2 3 4 5 6 7 5. 一些富含多糖多酚的植物材料，按照上述方法仍无法有效提取出 RNA，怎么办？ 可以搭配使用 RNAiso-mate for Plant Tissue（Takara Code：D325）进行提取，如香蕉果实、松树针 叶等特殊组织材料均可以使用这种方法有效地进行提取。若提取的结果仍不满意，可以使用 RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue（Takara Code：D326）提取。 6. RNA 提取量较低怎么办？ ① 向组织材料中加入 RNAiso Plus 后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。 ② 相分离后请尽量完全回收上清液。 7. 提取的 RNA 不溶怎么办？ ① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。 ② 可以于 60℃加热 5 分钟后再于冰上溶解数小时。 ③ RNA 沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，避免枪头接触蛋白层。 ④ 溶解液更换为 0.5%的 SDS 溶液（DEPC 处理水配制）。 8. OD260/OD280值<1.65，为什么？ ① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。 ② 样品裂解时加入的 RNAiso Plus 量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对 RNA 溶液进行苯酚/ 氯仿抽提，以除去蛋白。 ③ 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足 5 分钟。 ④ 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。 ⑤ RNA 未充分溶解。 9. 提取的 RNA 降解，为什么？ ① 使用的组织材料不够新鲜。提取 RNA 的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料 用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。 ② 提取 RNA 时使用的试剂及器材中混有 RNA 分解酶。 ③ 提取的组织材料中含有大量的 RNA 分解酶，而 RNAiso Plus 的添加量不够。 10. 提取的 RNA 中含有 DNA 污染，为什么？ ① 裂解组织或细胞使用的 RNAiso Plus 量偏少。 ② 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等）、高浓度的 Buffer、碱性溶剂等。 ③ 如果提取的 RNA 中含有 DNA 时，可以使用 DNase I（RNase Free；Takara Code：D2215）进 行 DNA 消化。 ● 参考文献 1. J. Chirgwin, et al. "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease", Biochemistry.18(24): 5294-5299 (1979). 2. D. Wallace, "Large-and Small-Scale Phenol Extractions", Methods in Enzymology.152: 33-41 (1987). 3. Coombs, L. M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann, M., Denner, J. and Knowles, M. A. "Simultaneous Isolation of DNA, RNA, and Antigenic Protein Exhibiting Kinase Activity from Small Tumor Samples Using Guanidine Isothiocyanate", Anal. Biochem.188: 338-343 (1990). 4. Nicolaides, N. C. & Stoeckert, Jr., C. J. "A Simple, Efficient Method for the Separate Isolation of RNA and DNA from the Same Cells", Biotechniques. 8: 154-156 (1990). 5. J. R. Feramisco, et al. Molecular Cloning: 194-195, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. -6- 6. Raha, S., Merante, F., Proteau, G. and Reed, J. K. "Simultaneous Isolation of Total Cellular RNA and DNA from Tissue Culture Cells Using Phenol and Lithium Chloride", Gene Anal. Techn. 7: 173-177 (1990). -7- Note This product is for research use only. It is not intended for use in therapeutic or diagnostic procedures for humans or animals. Also, do not use this product as food, cosmetic, or household item, etc. Takara products may not be resold or transfered, modified for resale or transfer, or used to manufacture commercial products without written approval from TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co.,Ltd.. MEMO -8- -9- 技术咨询热线： 0411-87641685，87641686 8008909508，4006518769 宝生物工程（大连）有限公司 TaKaRa Biotechnology (Dalian) Co., Ltd. 辽宁省大连经济技术开发区东北二街 19号（116600） No.19 Dongbei 2nd Street, Development Zone, Dalian, China 电 话： 0411-87641681 87641683 传 真： 0411-87619946 87621675 E.mail： service@takara.com.cn 网 址： http://www.takara.com.cn V2011.09 内 容 页 码