MTT实验测脱氢酶活性

2011/6/14 休止细胞制备和脱氢酶活性测定 08级生命基地 栾一 200800140109 休止细胞制备和脱氢酶活性测定 生命基地 200800140109 栾一 2011/6/14 摘要： 本文采用MTT法测脱氢酶的活性。首先制备休止细胞，利用细胞内的脱氢酶来催化反应进行；然后选择不同的底物，研究它们在相同浓度下对应脱氢酶的效率，以此判断它们在TCA循环中的 相对位置。为了研究不同浓度的底物对脱氢酶活性的影响，我们可以稀释制成一系列的底物梯度，然后用相同菌悬液来反应，以此研究脱氢酶促反应的动力学方程。 关键词：脱氢酶 休止细胞制备 噻唑盐 背景： 随着免疫学、血液学和肿瘤学研究的不断深入和发展, 科研部门和临床医院检测各种细胞和细胞因子活性等方面的工作日益增多, 但是其检测 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 多不尽人意。目前细胞和细胞因子活性检测多采用同位素法、台盼蓝法等。这些方法虽各具优点, 但都存在着一定的局限性, 如操作过程繁琐, 检测周期长, 需特定仪器设备, 易污染环境等。所以长期以来, 人们一直在不断探索新的更快速更准确的检测方法来满足工作的需要。自从年美国学者建立了比色法以来, 它以其快速、灵敏、简便、准确等优点受到人们的普遍重视。现已广泛应用于各个领域, 例如检测细胞对化学药物的敏感性, 刺激剂对免疫细胞的反应、酶活测定等。 酶催化活性测定方法有定性的，也有定量的，定性方法包括组织化学方法和度纸测定等。酶定量测定可以分为简单反应和偶联反应两种类型。简单反应是直接测定酶促反应前后底物或产物量的变化。如果酶催化是一个简单的反应，在底物大大过量情况下，酶催化的反应速度与酶量成正比。因此可以通过测定反应底物的减少或者产物的增加就能确定酶的催化活性。所以一般依靠产物的生成来确定酶的催化活性。偶联反应的方法是指，如果要测的催化反应 A B；产物B再与另一个化合物C反应，通过测定C的变化来确定B的量，由此确定酶的催化活性。 本文将以北京棒状杆菌为研究对象, 较为详细地研究其呼吸链中脱氢酶活性, 通过在不同底物相同浓度的吸光度的测定，来确定各底物在TCA循环中的相对位置，以及相同底物不同梯度浓度的吸光度测定，来大致确定底物浓度对酶催化活性的影响。 北京棒状杆菌 AS1, 299菌株是中国科学院微生物研究所认当时北京清河粉丝厂的淀粉废浆中分离的到的一株革兰氏阳性、无芽孢的谷氨酸生产菌。1972年坚定认为这个菌株与木下报道（1958）的谷氨酸棒状杆菌及Lee.W,H. 报道的百合棒状菌较相近，而且能由肌酵、糊精和木糖产酸，此外还有“细丝”，而木下和李等整理的这个菌株无这些特点，故AS1, 299是当时世界上的一个谷氨酸生产菌的新种。因它分离自北京，故定名为北京棒状杆菌AS1, 299。该菌是我国筛选的第一个谷氨酸生产菌，并于1965年应用于生产。 北京棒状杆菌细胞短杆至小棒状，有时微呈弯曲，两端钝圆，不分枝，长呈棒状膨大等多形态。细胞大小0.7-0.9*1.0-2.5 微米。不运动，不形成芽孢，好养和兼性厌氧，革兰氏阳性，接触酶阳性，不抗酸。固体培养基上菌落圆形，白色，直径约1毫米；48小时后稍呈淡黄色，中央隆起，表面湿润，光滑且有光泽，边缘整齐，呈半透明状，无粘性，不产生色素。为谷氨酸生产的优良菌株。 休止细胞又称静息细胞，把培养液中各种营养物质和生长因子洗去后悬浮在生理盐水中培养一段时间，以消耗内源营养物质，呈饥饿状态的细胞，在研究微生物的生理生化及新陈代谢中有广泛的应用。它的主要特性就是细胞虽然处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长。另外休止细胞反应专一性强,可以提高底物转化率,不易染杂菌,可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。 三羧酸循环 柠檬酸循环（tricarboxylicacidcycle）：也称为三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA），Krebs循环。是用于乙酰—CoA中的乙酰基氧化成CO2的酶促反应的循环系统，该循环的第一步是由乙酰CoA与草酰乙酸缩合形成柠檬酸。在三羧酸循环中，反应物葡萄糖或者脂肪 HYPERLINK "/view/114958.htm" \t "_blank" 酸会变成乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)。这种"活化醋酸"(一分子辅酶和一个乙酰基相连)，会在循环中分解生成最终产物二氧化碳并脱氢，质子将传递给辅酶--烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 和黄素腺嘌呤（FAD），使之成为NADH + H+和FADH2。 NADH + H+ 和 FADH2 会继续在呼吸链中被氧化成NAD+ 和FAD，并生成水。这种受调节的"燃烧"会生成ATP，提供能量。 真核生物的线粒体和原核生物的细胞质是三羧酸循环的场所。它是呼吸作用过程中的一步，但在需氧型生物中，它先于呼吸链发生。厌氧型生物则首先遵循同样的途径分解高能有机化合物，例如糖酵解，但之后并不进行三羧酸循环，而是进行不需要氧气参与的发酵过程。 乙酰-CoA进入由一连串反应构成的循环体系，被氧化生成H₂O和CO₂。由于这个循环反应开始于乙酰辅酶A与草酰乙酸(oxaloaceticacid)缩合生成的含有三个羧基的柠檬酸，因此称之为三羧酸循环或柠檬酸循环(citratecycle)。在三羧酸循环中，柠檬酸合成酶催化的反应是关键步骤，草酰乙酸的供应有利于循环顺利进行。其详细过程如下： 1、乙酰-CoA进入三羧酸循环 　　乙酰CoA具有硫酯键，乙酰基有足够能量与草酰乙酸的羧基进行醛醇型缩合。首先柠檬酸合酶的组氨酸残基作为碱基与乙酰-CoA作用，使乙酰-CoA的甲基上失去一个H+，生成的碳阴离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击，生成柠檬酰-CoA中间体，然后高能硫酯键水解放出游离的柠檬酸，使反应不可逆地向右进行。该反应由柠檬酸合成酶(citratesynthase)催化，是很强的放能反应。由草酰乙酸和乙酰-CoA合成柠檬酸是三羧酸循环的重要调节点，柠檬酸合成酶是一个变构酶，ATP是柠檬酸合成酶的变构抑制剂，此外，α-酮戊二酸、NADH能变构抑制其活性，长链脂酰-CoA也可抑制它的活性，AMP可对抗ATP的抑制而起激活作用。 2、异柠檬酸形成 柠檬酸的叔醇基不易氧化，转变成异柠檬酸而使叔醇变成仲醇，就易于氧化，此反应由顺乌头酸酶催化，为一可逆反应。 3、第一次氧化脱酸? 　　在异柠檬酸脱氢酶作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸(oxalosuccinicacid)的中间产物，后者在同一酶表面，快速脱羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)、NADH和CO2，此反应为β-氧化脱羧。此反应是不可逆的，是三羧酸循环中的限速步骤，ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，而ATP，NADH是此酶的抑制剂。 4、第二次氧化脱羧 　　在α-酮戊二酸脱氢酶系作用下，α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰-CoA、NADH·H+和CO₂，反应过程完全类似于丙酮酸脱氢酶系催化的氧化脱羧，属于α氧化脱羧，氧化产生的能量中一部分储存于琥珀酰辅酶A的高能硫酯键中。α-酮戊二酸脱氢酶系也由三个酶(α-酮戊二酸脱羧酶、硫辛酸琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶)和五个辅酶(tpp、硫辛酸、hscoa、NAD+、FAD)组成。此反应也是不可逆的。α-酮戊二酸脱氢酶复合体受ATP、GTP、NADH和琥珀酰-CoA抑制，但其不受磷酸化/去磷酸化的调控。 5、底物磷酸化生成ATP 　　在琥珀酸硫激酶(succinatethiokinase)的作用下，琥珀酰-CoA的硫酯键水解，释放的自由能用于合成GTP，在细菌和高等生物可直接生成ATP，在哺乳动物中，先生成GTP，再生成ATP，此时，琥珀酰-CoA生成琥珀酸和辅酶A。 6、琥珀酸脱氢 　　琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase)催化琥珀酸氧化成为延胡索酸。该酶结合在线粒体内膜上，而其他三羧酸循环的酶则都是存在线粒体基质中的，这酶含有铁硫中心和共价结合的FAD，来自琥珀酸的电子通过FAD和铁硫中心，然后进入电子传递链到O₂，丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，所以可以阻断三羧酸循环。 7、延胡索酸的水化 　　延胡索酸酶仅对延胡索酸的反式双键起作用，而对顺丁烯二酸(马来酸)则无催化作用，因而是高度立体特异性的。 8、草酰乙酸再生 　　在苹果酸脱氢酶(malicdehydrogenase)作用下，苹果酸仲醇基脱氢氧化成羰基，生成草酰乙酸(oxalocetate)，NAD+是脱氢酶的辅酶，接受氢成为NADH·H+. 　　在此循环中，最初草酰乙酸因参加反应而消耗，但经过循环又重新生成。所以每循环一次，净结果为1个乙酰基通过两次脱羧而被消耗。循环中有机酸脱羧产生的二氧化碳，是机体中二氧化碳的主要来源。在三羧酸循环中，共有4次脱氢反应，脱下的氢原子以NADH H+和FADH2的形式进入呼吸链，最后传递给氧生成水，在此过程中释放的能量可以合成ATP。乙酰辅酶A不仅来自糖的分解，也可由脂肪酸和氨基酸的分解代谢中产生，都进入三羧酸循环彻底氧化。并且，凡是能转变成三羧酸循环中任何一种中间代谢物的物质都能通过三羧酸循环而被氧化。所以三羧酸循环实际是糖、脂、蛋白质等有机物在生物体内末端氧化的共同途径。三羧酸循环既是分解代谢途径，但又为一些物质的生物合成提供了前体分子。如草酰乙酸是合成天冬氨酸的前体，α-酮戊二酸是合成谷氨酸的前体。一些氨基酸还可通过此途径转化成糖。 乙醛酸循环 脂肪酸经过β-氧化分解为乙酰CoA，在柠檬酸合成酶的作用下乙酰CoA与草酰乙酸缩合为柠檬酸，再经乌头酸酶催化形成异柠檬酸。随后，异柠檬酸裂解酶(isocitratelyase)将异柠檬酸分解为琥珀酸和乙醛酸。再在苹果酸合成酶(malate synthetase)催化下，乙醛酸与乙酰CoA结合生成苹果酸。苹果酸脱氢重新形成草酰乙酸，可以再与乙酰CoA缩合为柠檬酸，于是构成一个循环。其总结果是由2分子乙酰CoA生成1分子琥珀酸，反应方程式如下： 　　2乙酰CoA＋NAD+→琥珀酸＋2CoA＋NADH＋H+ 　　琥珀酸由乙醛酸体转移到线粒体，在其中通过三羧酸循环的部分反应转变为延胡索酸、苹果酸，再生成草酰乙酸。然后，草酰乙酸继续进入TCA循环或者转移到细胞质，在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP carboxykinase)催化下脱羧生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，PEP再通过糖酵解的逆转而转变为葡萄糖6磷酸并形成蔗糖。 　　油料种子在发芽过程中，细胞中出现许多乙醛酸体，贮藏脂肪首先水解为甘油和脂肪酸，然后脂肪酸在乙醛酸体内氧化分解为乙酰CoA，并通过乙醛酸循环转化为糖，直到种子中贮藏的脂肪耗尽为止，乙醛酸循环活性便随之消失。淀粉种子萌发时不发生乙醛酸循环。可见，乙醛酸循环是富含脂肪的油料种子所特有的一种呼吸代谢途径。 脱氢酶（dehydrogenases）是一类催化物质氧化还原反应的酶，在酶学分类中属于第一大类。反应中被氧化的底物叫氢供体或电子供体，被还原的底物叫氢受体或电子受体。当受体是O2时，催化该反应的酶称为氧化酶，其他情况下都称为脱氢酶。不同的脱氢酶几乎都根据其底物的名称命名。如琥珀酸脱氢酶。  　　琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种 标志 禁止坐卧标志下载饮用水保护区标志下载桥隧标志图下载上坡路安全标志下载地理标志专用标志下载 酶。作为参与三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶（marker enzyme）之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标[1]，对于评价精子线粒体功能、研究致奶牛酮缺乏症病理过程等具有重要意义。 琥珀酸脱氢酶的常用测定方法主要有五种 2.1  硫酸甲酯吩嗪（PMS）  琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映。 2.2  铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法  以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。   2.3  TTC（氯化三苯四氮唑）法  无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶体的形式存在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液测定485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶活性，根据 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线计算TF生成量，进而求出TTC-脱氢酶活性。 2.4  MTT法  MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazana），经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度510nm处OD值推测出活细胞的数目。 2.5  NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法   NBT易溶于水，呈淡黄色，以NBT为受氢体，接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢，进而形成紫蓝色的沉淀，于反应体系中加入PMS，混匀，37℃保温30min，之后加入TCA终止反应。加异丙醇溶解显色，混匀，即可于548nm测OD值。规定：30min内548nm下OD值为1.0时的酶量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白。 本实验采用的是MTT法 MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。MTT产品为淡黄色粉末, 易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内。可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原, 形成不溶于水的蓝紫色甲瓒结晶。该结晶可溶于酸性异丙醇、二甲亚砜等有机溶剂中, 通过多孔扫描分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光度值。由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例, 因此吸光度（A）值的大小可反映细胞的数量及活性。 1　材料和方法 1. 1　主要仪器 (1)可见光分光光度计(722型) (2)振荡培养箱 (3)离心机 1. 2　主要试剂 (1) 0.1M 醋酸钠；0.1M 柠檬酸； 0.1M 琥珀酸； 0.1M α-酮戊二酸；（备用，然后按实验要求稀释成不同浓度梯度。） (2) 磷酸缓冲溶液(pH = 7.8) (3)二甲亚砜 (4)3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐 (5) 生理盐水 1.3 菌种 北京棒状杆菌 1.4 培养基 液体培养基 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g NaCl 0.5g 蒸馏水 100ml pH7.6 固体培养基 牛肉膏 0.5g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 蒸馏水 100ml 琼脂 2g pH7.6 1.5 MTT 溶液的配制方法      通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。   MTT一般最好现用现配，避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；配制MTT时用PBS（pH=7.8）溶解。 PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.8,定容1L。 2　实验方法 2. 1　配制不同浓度系列的底物 柠檬酸浓度系列包括原为0.1M；0.1M/2; 0.1M/5; 0.1M/10; 0.1M/20; 0.1M/30; 0.1M/40. 琥珀酸稀释为0.1M；0.1M/10; 0.1M/20; 0.1M/30; 0.1M/40. 这些不同梯度溶液的配置均从原0.1M的浓度开始配置。 2.2. 休止细胞的制备　　 2.2.1.    培养基的灭菌：分别配制固体培养基和液体培养基。固体培养基分装到5个试管中，灭菌后摆斜面；液体培养基分装到2个三角瓶，每瓶100ml，灭菌。　　 2.2.2     菌种活化：挑取菌种接种到试管斜面上，28℃　活化培养18小时。细菌培养：将活化好的菌种转接到三角瓶中，28℃　恒温培养至OD600大于1.0时。　 2.2.3   菌悬液制备：将三角瓶中生长好的菌液，置于50ml离心管，4500rpm离心10分钟，收集菌体。分别用生理盐水洗涤三次，最后收集细胞用pH7.8的PBS制成菌悬液。在0度条件下冰箱中放置72h。　　 2.2.4    休止细胞制备：使用时在28℃恒温培养6～8小时，以充分降低内呼吸，即可得休止细胞。　　 2.3 琥珀酸脱氢酶活性测定 2.3.1 实验组：取琥珀酸的不同稀释度的溶液于各试管中，每种浓度平行重复三次，各试管中加入的底物为1ml，然后依次向各管中加入0.4ml的休止细胞。把这些当做实验组。 2.3.2 空白组：加入休止细胞和1ml的蒸馏水。 2.3.3 在空白组和实验组加入40ul的噻唑盐，振荡混匀溶液，在28度保温2h，然后加入1.3ml二甲亚砜，振荡混匀。在保温30min后，加入1.5mlPBS，混匀，在波长为510nm时测吸光度。 2.4 柠檬酸脱氢酶活性测定 与琥珀酸相同分为实验组和空白组分别按上述加样顺序操作，然后测各组的吸光度。 2.5 相同浓度不同底物脱氢酶的活性 　加样顺序和所加试剂均与上述测琥珀酸脱氢酶的步骤一致，只有底物发生了变化。此处所用底物为相同浓度的乙酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、柠檬酸。 实验结果　　 不同底物在相同浓度下的脱氢酶活性 底物 OD1 OD2 OD3 乙酸钠 0.37 0.358 0.365 琥珀酸 0.369 0.369 0.363 α-酮戊二酸 0.394 0.428 0.411 柠檬酸钠 0.886 0.878 0.827 从图中可以看出在每一种底物下我们平行做了三组实验，其中忽略偶然误差和仪器误差，我们组的数据相当准确。为了较少偶然误差，我们可以在实验时可以平行重复多次。 虽然在相同浓度下，不同底物的脱氢酶活性不同。其中柠檬酸脱氢酶的活性活性最高，因为柠檬酸脱氢酶所产生的还原性氢与噻唑盐反应生成的有色物质最多，从图中可以看出柠檬酸钠的那一组OD值最高。 α-酮戊二酸的OD值大小比柠檬酸的小，可以说是因为它的脱氢酶与有色物质产生的有色产物较少，那么在相同稀释倍数下α-酮戊二酸的OD值小。α-酮戊二酸脱氢酶活性比柠檬酸脱氢酶活性低。这可以看出在柠檬酸循环中α-酮戊二酸的脱氢还原在柠檬酸脱氢之后。 琥珀酸的OD值略小于α-酮戊二酸的OD值。 OD值的大小说明了溶液里生成的有色物质的浓度差异。根据MTT 实验的原理，脱氢酶所产生的还原性氢与噻唑盐反应生成的有色物质，根据有色物质的浓度来判断脱氢酶产生的还原性氢的量，从而判断脱氢酶的活性。 在某些生物体内，供能的循环不是三羧酸循环，而是三羧酸循环的一部分，即乙醛酸循环。异柠檬酸不是被还原成α-酮戊二酸，而是被裂解成乙醛酸和苹果酸。根据α-酮戊二酸脱氢酶活性和乙酸脱氢酶活性差异可以知道哪种循环在供能中起主要作用。 从实验中得出的脱氢酶活性不同可以判断出各个底物在三羧酸循环里的位置。 即在实验中，先是柠檬酸在柠檬酸脱氢酶作用下，被氧化生成α-酮戊二酸，然后α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱氢酶作用下生成琥珀酸，琥珀酸在其脱氢酶的作用下，进行进一步的反应。 研究过不同底物在相同浓度下的脱氢酶活性后，我们也可以研究一下其他因素对脱氢酶活性的影响。我们已知底物浓度对酶促反应速率有很大的影响，那么不同的酶受底物浓度变化的影响是否一致呢？ 我们可以对琥珀酸和柠檬酸进行梯度稀释，然后观察不同脱氢酶活性受底物浓度影响情况。 不同浓度梯度下的琥珀酸脱氢酶活性 琥珀酸浓度 OD值 0.0025 0.771 0.765 0.765 0.0033 0.778 0.785 0.78 0.005 0.806 0.8 0.8 0.01 0.821 0.821 0.816 0.1 0.886 0.878 0.878 Km 和rmax 的测定方法 Linewear Burk 法，即双倒数法。 对米氏方程两侧取倒数，得1/r=1/rmax+Km/rmax*1/Cs, 以1/r ~1/Cs作图，得一直线，直线斜率为Km/rmax. 截距为1/rmax。根据直线斜率和截距可计算出Km 和rmax。 为了做出琥珀酸酶促反应动力学曲线，我们总共做了5组实验，选择了一定的浓度梯度。从拟合的曲线结果来说，有3个点在曲线上，有另外2个点分布于曲线两侧。点没有精确地定位为在曲线上，影响因素可能是多方面的。如：仪器测量的精确度不高。在反应时间结束后，测量其OD值时，第一组和最后一组所经历的反应时间不同。另外，OD值所表征的是产物的量，在反应时间相同时，OD值仅与平均速度成正比关系，并不能表明瞬时速度。参与反应的菌株的量各不相同，需要选择合适的菌悬液浓度。而且，底物稀释需要选择合适的稀释梯度，不能使点过于集中在一个小的范围内。 琥珀酸浓度对于酶促反应速率的影响近似是一个双曲线。在底物浓度较小时，反应速率随着底物浓度的改变有较大的变化，即随着底物浓度的增大，反应速率有一个较快的增长。但是，当底物增加到一定程度时，随着底物浓度的增大，反应速率的增加不再向刚才一样明显。速率的增长率变小，最后，基本上随着底物浓度的增加，反应速率保持不变。说明此时，酶已经被较多的底物饱和，仅增加底物的量，不能使反应速率提高。 基于我们对双曲线的了解，在反应速率达到最大速率的一半时，速率的增长率最大。 在三羧酸循环中，琥珀酸被琥珀酸脱氢酶氧化成延胡索酸，一分子的琥珀酸被脱下了两分子的还原性氢。还原性氢与MTT反应生成蓝紫色结晶。该有色结晶可通过分光光度计定量测定，从而测出脱氢酶的反应速率。 OD值达到最大时，脱氢酶活性最高，产生的还原性氢越多，反应速率越大。在选定的函数类型后，可以大致得出该形的函数符合的表达式类型。符合该曲线的方程式y=Vmax*x*n/(k*n+x*n). 其中n的值为1，y所表示的是速度，x是底物的浓度，简化后，该方程为 V=Vm*s/(s+k) 在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系；当底物浓度较高时，反应速度虽然随着底物浓度的升高而加快，但不再呈正比例加快；当底物浓度增高到一定程度时，如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，说明酶已被底物所饱和。 　 酶促反应速度与底物浓度之间的变化关系，反映了[ES]的形成与生成产物[P]的过程。在[S]很低时，酶的活性中心没有全部与底物结合，增加[S]，[ES]的形成与[P]的生成均呈正比关系增加；当[S]增高至一定浓度时，酶全部形成了[ES]，此时再增加[S]也不会增加[ES]，反应速度趋于恒定。 　 为了解释底物浓度与酶促反应速度的关系，1913年Michaelis和Menten归纳酶促反应动力学最基本的数学表达式---米氏方程： 琥珀酸反应速率随底物浓度的变化曲线正符合米氏方程。  V=Vmax[S]/（Km+[S]） 　 Vmax为反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓度时相应的反应速度。　 当反应速度为最大速度一半时，米氏方程可以变换如下： 1/2Vmax=Vmax[S]/（Km+[S]） 所以  Km=[S]。 因此，Km值等于酶促反应最大速度一半时的底物浓度。(如图所示) Km值可判断酶与底物的亲和力（Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；反之亦然）。 Km值是酶的特征性常数，只与酶的结构、酶所催化的底物和酶促反应条件有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。 Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。 当K3不远远小于K2和K1时，Km表示整个反应的化学平衡的常数。 如果Km值已知，任何底物浓度时酶的饱和度(形成中间产物的酶占总酶的比例，便可计算出来。 但是由于使用方法和器材的局限，我们的结果存在较大偏差。只能对酶促反应速率做大致的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，所得到的关于Km的值并不准确。原因是多方面的。 通过上一个实验，我们知道琥珀酸脱氢酶的反应速率随着底物浓度变化规律符合米氏方程，是一种常型酶，但是，所有的酶随底物变化都是这样的规律吗？底物的持续增加对酶促反应速率没有一点影响吗？ 接下来我们来研究另一种酶，看它的底物对于酶促反应速率的影响。 相同底物不同浓度对脱氢速率的影响 柠檬酸脱氢酶 0.1 0.352 0.351 0.355 0.05 0.45 0.452 0.457 0.02 0.345 0.343 0.349 0.01 0.332 0.335 0.332 0.005 0.314 0.324 0.303 0.0033 0.311f 0.317 0.309 0.0025 0.304 0.305 0.307 Row Mean Sd(yEr+) se Min Max Range Sum N 1 0.35267 0.00208 0.0012 0.351 0.355 0.004 1.058 3 2 0.453 0.00361 0.00208 0.45 0.457 0.007 1.359 3 3 0.34567 0.00306 0.00176 0.343 0.349 0.006 1.037 3 4 0.333 0.00173 1E-3 0.332 0.335 0.003 0.999 3 5 0.31367 0.0105 0.00606 0.303 0.324 0.021 0.941 3 6 0.31233 0.00416 0.0024 0.309 0.317 0.008 0.937 3 7 0.30533 0.00153 8.81917E-4 0.304 0.307 0.003 0.916 3 为了做出柠檬酸脱氢酶酶促反应动力学曲线，我们总共做了7组实验，选择了一定的浓度梯度。从拟合的曲线结果来说，有四个点在曲线上，有另外三个点分布于曲线两侧。点没有精确地定位为在曲线上，影响因素可能是多方面的。如：仪器测量的精确度不高。在反应时间结束后，测量其OD值时，第一组和最后一组所经历的反应时间不同。另外，OD值所表征的是产物的量，在反应时间相同时，OD值仅与平均速度成正比关系，并不能表明瞬时速度。参与反应的菌株的量各不相同，需要选择合适的菌悬液浓度。而且，底物稀释需要选择合适的稀释梯度，不能使点过于集中在一个小的范围内。 不同底物浓度对柠檬酸脱氢酶的影响与琥珀酸不同。底物浓度对反应速率的影响是一个中型曲线。且受底物浓度影响较大。在底物浓度较小时，随着底物浓度的增大，反应速率有一个较快的增长。然后达到最大放映速率。但是，当底物浓度继续增加时，反应速率开始降低，而且与增长的曲线呈对称型。 显然这种酶促反应速率曲线不符合米氏方程，不能用米氏方程曲线的特点来分析这个酶促反应曲线。柠檬酸脱氢酶活性在底物浓度下的调控不同于琥珀酸脱氢酶，因此，它必然存在一种与琥珀酸不同的底物浓度调控机制。而不是简单的底物满足所有的酶活性位点而使得反应速率不再变化这个简单的调控机制。 有些酶除了活性中心外，还有一个或几个部位，当特异性分子非共价地结合到这些部位时，可改变酶的构象，进而改变酶的活性，酶的这种调节作用称为变构调节(allosteric regulation)，受变构调节的酶称变构酶(allosteric enzyme)，这些特异性分子称为效应剂(effector)。变构酶分子组成，一般是多亚基的，分子中凡与底物分子相结合的部位称为催化部位(catalytic site)，凡与效应剂相结合的部位称为调节部位(regulatory site)，这二部位可以在不同的亚基上，或者位于同一亚基。 一般变构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物与一个亚基上的活性中心结合后，通过构象的改变，可增强其他亚基的活性中心与底物的结合，出现正协同效应(positivecooperative effect)。使其底物浓度曲线呈S形。即底物浓度低时，酶活性的增加较慢，底物浓度高到一定程度后，酶活性显著加强，最终达到最大值Vmax。 　　多数情况下，底物对其变构酶的作用都表现正协同效应，但有时，一个底物与一个亚基的活性中心结合后，可降低其他亚基的活性中心与底物的结合，表现负协同效应(negative cooperative effect)。即，在一定范围内反应速率随着底物的增加而增加，但是到某一浓度时，随着底物的增加反应速率不在增大，反而减小。这是由于底物与酶的负协同效应。在这个过程中，反应速率有一个最大值，然后，再开始减小。如3-磷酸甘油醛脱氢酶对NAD+的结合为负协同效应。 　　 变构酶除活性中心外，存在着能与效应剂作用的亚基或部位，称调节亚基(或部位)，效应剂与调节亚基以非共价键特异结合，可以改变调节亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的效应剂称变构激活剂(allosteric activitor)，它能使上述S型曲线左移，饱和量的变构激活剂可将S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的效应剂称变构抑制剂(allosteric inhibitor)，能使S形曲线右移。例如，ATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而ADP、AMP为其变构激活剂。 　　由于变构酶动力学不符合米－曼氏酶的动力学，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用Km表示，而代之以K0.55表示(图2-20)。为了解释变构酶协同效应的机制并推导出动力学曲线方程式，不少人曾提出各种模型，各有优缺点，现将有关变构作用的Hill模式内容附本章节后，供学习参考。 图2-20 变构酶的底物活性曲线 ⊙不加变构剂 加变构抑制剂 　　3.生理意义 　　(1)在变构酶的S形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以快速调节细胞内底物浓度和代谢速度。 　　(2)变构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的开端，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。 　　例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP转变成ATP，当ATP过多时，通过变构调节酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多时，则可促进糖的分解。随时调节ATP/ADP的水平，可以维持细胞内能量的正常供应。 注意事项； 1. 选择适当得细胞接种浓度。制成的菌悬液浓度，即脱氢酶的浓度对反应速率有较大的影响，从而对测得OD值影响较大。当所选浓度不合适时，所测OD值可能会大于1. 2. 在不同底物的浓度对脱氢酶反应速率的影响的试验中，选用合适的稀释倍数无疑是实验成功的关键，因为要用所测数据做曲线，所以所选的底物浓度不可过度集中在一起，否则就无法做出较为接近标准的曲线。 3. 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以蒸馏水调零，以空白对照作为底物浓度为0时的OD值。 4． 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。 5． 吹吸混匀时，吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 6． 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。 讨论 1. 保藏菌种的活化是使用保藏菌种的第一步。活化的要求是使用保藏菌种恢复旺盛的生命活动和显示其原有的代谢和生长性能。因此，保藏菌种的活化必须使用保藏菌种时使用的相同培养基和培养条件，或以保藏菌种生长和代谢最佳的培养基和培养条件，以使保藏菌种能迅速恢复其原有的代谢速率和生理特性。 2. 菌落一般在培养基表面粘附不紧密，用生理盐水洗涤时可以轻易地洗下。若有部分菌落仍未脱落，可以用接种环轻轻刮擦，注意尽量不要碰触培养基而使其进入洗涤液中。 3. 在液体中静置培养和振荡培养时，一般用离心机收集菌体。离心收集细胞的条件一般随微生物的种类不同，细菌一般用5000转/分，10分钟或者9000转/分，5分钟就足够了。然后洗涤以除去所收集细胞中的培养基，离心沉淀的细胞加入洗涤液后，用玻璃棒小心搅拌使成均一的悬浊液，再离心分离。洗涤后，一般再悬浮在洗涤液中保存，有时也可直接保存除去上清液的沉淀细胞。 4. 在进行实验之前必须根据自己小组细菌生长情况选取最佳的菌悬液浓度。菌悬液浓度过大会导致OD值过大。使用噻唑盐时，注意避光，它见光易被分解。保温二个小时，注意时间不要太长，否则噻唑盐会因为光分解。 5. 经培养的微生物，不仅在细胞表面同时在菌细胞的内部也残留有营养物质，为除去营养物质，在应用休止细胞前，可在室温通气或振荡以消耗菌体细胞内的营养物质，减少内源呼吸，避免在实验中产生误差，此外，休止细胞的应用存在局限性。 MTT比色法的影响因素及改变 在MTT比色法测定过程中, 细胞还原MTT所形成的甲瓒结晶不溶于培养液, 需加入有机溶剂使细胞裂解, 甲瓒颗粒溶解便于比色。这就往往存在颗粒溶解不完全, 以及加入某些溶剂如酸性异丙醇之后,而影响比色测定 。此外, 培养液中的酚红和pH的变化也会干扰结果的值。为此，国内外学者对比色法进行了不断地改良。有人使用二甲亚矾（DMSO）做溶解液, 它能迅速溶甲瓒颗粒, 溶解力强。但DMSO能与孔中残存的MTT发生反应，产生的颜色随时间延长不断加深, 使结果的本底值升高,且受MTT残余量或加样量变化的影响。 Tada等用10%SDS做甲瓒溶解液部分克服了上述缺点, 但溶解力不如DMSO。Hansen等使用20%SDS-50%二甲基甲酰胺水溶液, 并调整pH4.7，结果显示，它可以完全溶解甲瓒。 该方法测脱氢酶活性是在原有美兰还原法的基础上的一个较大的进步，我们不但可以定性分析酶促反应，而且可以用比色法定量。但该方法仍有不少需要改进的地方。如：由于平行试验组加入试剂的时间不同，在最后比色时，同一组数据会造成较大偏差。此实验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 只能测试每一种脱氢酶在相同时间内所生成的产物的量，这只是与平均速度成正比。绘制酶促反应动力学图线时需要的瞬时反应速率。 参考文献 1. 边兴艳. MTT比色法及其应用 。国外医学临床生物化学与检验学分册 1998年第19卷第2期。 国 2. 赵连梅, 池勇志, 张春青。TTC - 脱氢酶活性测定中标准曲线的影响因素研究。实验室科学 2009年8月 第4期。 3. 周涛，戴红梅，汤国营，孟庆东，朱厚础等，用改良的MTT法测定rhG-CSF活性。生物技术通讯。1999年12月，Vol.10 No.4. 4. http://www.docin.com/p-91332558.html 北京棒状杆菌休止细胞的制备和脱氢酶活力的测定 Km Vm 8 / 24 _1368366033.bin _1369914892.bin _1367954518.bin