磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展

磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展 * 隋少卉 王京兰 蔡 耘 钱小红 ** (军事医学科学院放射医学研究所，基因组与蛋白质组研究室，北京蛋白质组中心，北京 102206) 摘要 蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰，在生物体内起着极为重要的作用.近年来蛋白质翻译后修饰日益 成为蛋白质组研究的热点之一.定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化，更好地了 解生物学功能调节网络奠定了坚实的基础.作为蛋白质组学研究的一个重要组成部分，定量磷酸化蛋白质组学因其磷酸化蛋 白质所具有的独特特征，在技术和方法研究方面将面临更为严峻的挑战.综述了磷酸化蛋白质组学定量的一些分析技术和方 法的发展现状、优缺点以及未来的发展趋势. 关键词 磷酸化蛋白质组学，方法，技术，定量 学科分类号 Q5 *北京市科技 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 重大项目(H030230280190),国家自然科学基金资 助项目(30321003,20405017,20505018,20505019),国家重点基础研 究发展计划(973)(2004CB518707)和国家自然科学基金重点项目 (20635010). **通讯联系人.Tel:010-80705055,E-mail:qianxh1@yahoo.com.cn 收稿日期：2006-09-18，接受日期：2006-12-31 生物化学与生物物理进展 ProgressinBiochemistryandBiophysics 2007,34(3):240~245 www.pibb.ac.cn 综述与专论ReviewsandMonographs 在生物体细胞中蛋白质是主要的功能行使者. 出于功能的需要，许多蛋白质在翻译中或翻译后会 在氨基酸链上共价结合各种非肽类基团，形成翻译 后修饰，常见的如：磷酸化、糖基化和泛素化等修 饰，其中研究最为详细的是蛋白质磷酸化.据统计， 哺乳动物细胞内有 1/3以上的蛋白质可以被磷酸 化，而脊椎动物基因组中有2%的基因编码蛋白激 酶或磷酸酶[1].蛋白质磷酸化参与调节细胞多种生 命活动过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞 骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈 代谢，肿瘤发生等[2].因此，磷酸化蛋白及其位点 的鉴定对更好地理解机体内一些受磷酸化影响的信 号通路机制是十分必要的.而生物体内磷酸化与去 磷酸化是一个可逆的动态变化过程，当细胞中磷酸 化蛋白质 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达失调以及蛋白质磷酸化功能异常时， 会引发一系列疾病，如：老年性痴呆[3]，肝癌[4]等. 因而分析蛋白质磷酸化修饰在不同生理病理状态下 的相对量的变化，可进一步发掘与疾病发生发展相 关的重要生物标志物，为揭示其分子机理奠定基 础.传统的方法注重对单一蛋白质研究，而蛋白质 组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有蛋白 质种类及其与周围环境(分子)的关系.所以为了满 足蛋白质组学的多样性和复杂性的需要，用蛋白质 组技术结合生物信息学分析，进行高通量地磷酸化 蛋白的相对定量分析研究已成为必然趋势. 定量蛋白质组分析的方法和技术原则上都适用 于磷酸化蛋白质定量分析，但由于磷酸化蛋白质自 身的一些特点，使得磷酸化蛋白质组定量分析遇到 新的困难.首先，磷酸化蛋白质含量少，化学计量 值低，磷酸化的肽段很容易淹没在大量非磷酸化的 肽段中；其次，磷酸肽本身所具有的负电性使其在 正离子模式的质谱分析中信号受到抑制，在 MALDI源的质谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相 应未磷酸化肽段的信号强度要低很多；再次，磷酰 键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷酸化蛋白 鉴定困难得多.因此，在蛋白质组学水平进行磷酸 化蛋白质的定量研究，除了要面临蛋白质组学所特 有的挑战外，其自身的特点也给定量磷酸化蛋白质 组学的分析带来了严峻的挑战.主要的技术挑战是 分析灵敏度.只有当一些非磷酸化肽的含量降低(或 磷酸化肽被富集)后，分析磷酸化肽段才会变得相 对容易.所以，进行磷酸化蛋白质组相对定量分析， 首先要对磷酸化肽段进行高通量的选择分离和富 集，其次要选择使用适合磷酸化肽段的定量方法， 隋少卉等:磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展2007;34(3) 再次要选用适当的检测方法，最后要有计算机软件 自动化分析，辅助磷酸化蛋白质的定量.下面就磷 酸化蛋白质的相对定量分析技术的现状及发展趋势 从蛋白质组学研究的角度作一综述. 1 规模化磷酸化蛋白质组分析中常用的分 离富集技术 1.1 固相金属亲和色谱 固相金属亲和色谱(immobilizedmetalaffinity chromatography，IMAC)是一项较为成熟的磷酸化 多肽分离富集技术.它是利用磷酸基团与固相化的 Fe3+、Ga3+、Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷 酸肽，目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径 主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质 谱 -数据库检索联用的方法.Ficarro等[5]最先将 IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质 组学的分析中，从啤酒酵母中鉴定了216个磷酸化 肽段，383个磷酸化位点.该方法的优点在于对每 个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用， 而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC 分析，但有可能丢失一些与 IMAC柱结合能力较 弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱 的磷酸肽，另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化 肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富 集.为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，通 过在羧基上进行酯化反应[6]以及改变洗脱液的体 系[7]等措施被用来提高IMAC的特异性.另外，自 动化 IMAC-capillaryRPHPLC-ESIMS/MS技术平 台的研究开发[8,9]，使磷酸肽的富集，反相分离和质 谱检测都能自动在线进行，为 IMAC在蛋白质组 学中的高通量应用开辟了道路. 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大 的关注，2004年Pinkse等[10]将二氧化钛(TiO2)技术 引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽 上的磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富 集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLC- ESI-MS/MS技术平台.虽然该技术在对磷酸化肽段 富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术， 但仍然存在非特异性吸附等问题[11].后来人们又利 用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材 料进行开发研究[12]，进一步增强了该技术对磷酸化 肽段富集的巨大潜力.但是目前纳米级的TiO2富集 磷酸化肽段技术还只能适于MALDI源的质谱仪， 在ESI源质谱仪中的应用还有待进一步研究. 1.2 强阳离子交换色谱富集法 大规模分析磷酸化蛋白质是一个具有挑战性的 问题，最近采用各种不同分离模式与 LC-MS/MS 联用从生物样品中鉴定大量的磷酸化位点的策略已 越来越受到重视.Beausoleil结合 SDS-PAGE和 强 阳 离 子 交 换 色 谱 (strongcationexchange chromatography，SCX)成功地从HeLa细胞中鉴定 了967个磷酸化蛋白，2002个磷酸化位点.这个策 略是基于磷酸化肽段与非磷酸化肽段在酸性溶液中 所带电荷的不同达到分离的目的.在溶液pH为2.7 时，胰蛋白酶的酶切产物大部分肽段带+2电荷， 而磷酸化肽段由于含有磷酸基团，带一个负电荷， 所以磷酸化肽段在酸性溶液中带+1电荷.这样在强 阳离子交换色谱中，单电荷肽段比多电荷肽段流出 时间早，因此磷酸化肽段便能被从多电荷复杂的非 磷酸肽中分离富集.相同的技术后来又被应用到哺 乳动物脑组织的磷酸化蛋白质组分析中，鉴定出了 500多个磷酸化位点[13].尽管这一技术为大规模磷 酸化蛋白质的鉴定展现了广阔的前景，但是仍存在 一定局限性：a.带有碱性残基(如含有漏切位点， 或含有His等)的磷酸化肽段将随着大批后面的非 磷酸化肽段一起洗脱；b.该方法只适合Trypsin酶 切的肽段，而且还有32%肽段会被忽略掉；c.该方 法对样品量要求较大，而且由于要对分离出的每个 馏分进行分析，工作量也不小. 目前不同富集方法的联用也越来越被重视.如 Trinidad等[14]将SCX与IMAC结合的策略用于磷酸 化蛋白富集，结果比单独用任何一个富集方法得到 的磷酸化肽段高至少 3倍.最近 Olsen[15]结合 SCX-TIO2创下了磷酸化肽段富集史上的新纪录更 是个很好的例子.有效的大规模磷酸化肽段的富集 为磷酸化蛋白质组定量分析的顺利进展提供了 保障. 2 磷酸化蛋白质组学定量技术 2.1 32P代谢标记和荧光染料染色的磷酸化蛋白质 定量分析方法 32P放射性标记(32P-labeling)可以非常灵敏、直 观地检测磷蛋白.早在1991年该技术便在研究磷酸 化蛋白质的定量分析中展现了一定的应用前景[16]. 但 32P高放射性对细胞有损害并对磷酸化状态有影 响，此外还存在不能标记组织样本，有放射性污染 等问题.荧光染料染色(Pro-QDiamond)是Molecular Probes公司前几年推出的一种磷酸化蛋白质的荧光 241· · 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(3) 染料[17]，它可以直接对聚丙烯酰胺凝胶中的磷酸化 蛋白质进行选择性染色，无需同位素或特异性抗 体，通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二 维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质，对非磷酸化 蛋白质的反应性很低，荧光强度会随着蛋白质磷酸 化程度的不同而呈现出一定的量的变化.这种染料 与质谱兼容，胶上的蛋白质点可以通过胶上酶切进 行质谱鉴定.Chen等[18]将 32P放射性标记和 Pro-Q 染色两种方法结合来分析中国鼠卵巢细胞的磷酸化 蛋白质组，发现，在定量磷酸化蛋白质时，结果受 标记时间的影响，而且放射性标记的磷酸化蛋白质 与Pro-Q磷酸化染料所染出的磷酸化蛋白质之间不 存在很好的相关性.Hopper等[19]分别用2DE-Pro-Q Diamond染料方法和 32P放射性标记方法分析了猪 心线粒体中的磷酸化蛋白质组，也同样发现二者相 关性较差的问题，并进一步研究发现，32P标记比 Pro-QDiamond方法更灵敏，特别是对那些磷酸基 团转化速率高的蛋白质，32P标记方法能更好地检 测.而Pro-QDiamond对较高丰度但低磷酸基团转 化速率的蛋白质具有更高的灵敏度，但对不同的磷 酸化位点，绝对灵敏度并不是一成不变的. 2.2 稳定同位素标记技术 2000年 Weckwerth，Willmitzer和 Fiehn等[20] 首次提出稳定同位素标记(stable-isotopelabeling， SIL)与LC/MS结合使用来进行蛋白质定量.开辟了 定量蛋白质组学的一个新技术平台，与传统的定量 方法如2-DE相比，稳定同位素标记技术在定量准 确度和规模化定量分析方面都有很大的应用前景. 在磷酸化蛋白质差异定量研究中，目前常用以下几 种稳定同位素标记定量方法： 2.2.1化学标记技术(chemicalmodification) 目前该技术发展的基本化学原理主要有针对肽 段上磷酸基团的β消除-马氏加成反应、在羧基端 的酯化反应以及氨基端的酰化反应.其中β消除- 马氏加成反应用得最为广泛，其基本原理是使磷酸 化肽段的磷酸基团在碱性环境下发生β消除形成 双键，同时用标有不同同位素的亲核试剂与双键发 生加成反应取代磷酸基团.该技术是专门针对磷酸 化肽段而建立的，但较多的化学修饰以及纯化步 骤，导致了大量样本的损失，而且在没有预分离和 处理的情况下，该反应对O-糖基化肽段也起反应， 所以在结果中将导致两种类型肽段的混淆. Thompson等[21]将IMAC技术与β消除-马氏加成 反应结合来分析定量磷酸化蛋白质，主要是先用 IMAC亲和富集磷酸化肽段，然后用碱性溶液将磷 酸化肽段发生β消除，与此同时磷酸化肽段也被 洗脱下来，接着进行马氏加成反应标记上含有不同 同位素的标签.该方法改进之处在于：a.消除了O- 糖基化肽段的干扰；b.用β消除反应释放磷酸化 肽段减少了反应步骤，减少了样品的损失，并排除 了IMAC柱上的一些非磷酸化肽段的共洗脱.作者 用该方法分析了 celladhesionproteinp120catenin 和糖胎球蛋白，从中找到了新的磷酸化位点，验证 了该方法的有效性. 此外，在肽段的羧基上进行的酯化反应，既可 改善IMAC的非特异性又可与稳定同位素标记联 合应用，在磷酸化蛋白质的定量比较方面展现了一 定的应用前景.但该方法所存在的遗憾是如果蛋白 质中含有多个羧基，如含有较多天冬氨酸、谷氨 酸，酯化反应很难进行完全，而反应的不完全以及 该方法剧烈的反应条件导致肽段中的天冬酰胺和谷 酰胺发生脱氨基反应，使结果的分析复杂化[22].关 于通过肽段氨基端的乙酰化反应标记上不同的同位 素进行定量的化学修饰技术也有报道[23]. 各种各样的化学修饰技术为磷酸化蛋白质的定 量带来了可喜的前景，但这些化学修饰方法本身固 有的反应效率，副产物等问题以及在大规模磷酸化 蛋白质定量研究中的应用还有待进一步研究. 2.2.2同位素代谢标记技术(metaboliclabeling).15N 标记法(15Nlabeling)是Oda等[24]最早提出的一种同 位素代谢标记技术，是在培养基中分别掺入 14N和 15N来寻找差异表达蛋白的一种方法.虽然该方法非 常适用于追踪单个磷酸化位点的动力学变化，但它 仅限于分析那些表达水平相对较高的蛋白质. SILAC(stableisotopelabelingbyaminoacidincell culture)技术[25]出现以后，很快取代了 15N标记法. SILAC技术即细胞培养过程中氨基酸的稳定同位 素标记.已经使用过的稳定同位素标记氨基酸有精 氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸 (Leu)等.SILAC标记技术具有一些显著优点：蛋白 质损失小；标记效率高，误差低；可以实现多种的 样本比较；肽段覆盖率高，可以提高定量结果和鉴 定结果的可靠性；实验操作简便.正是因为拥有这 些优点，SILAC技术才迅速得到认可并在国际著 名实验室使用[15,26].最近Olsen[15]便是用L-arginine和 L-lysine，L-arginine-U-13C6-14N4和L-lysine-2H4，或者 L-arginine-U-13C6-15N4 和 L-lysine-U-13C6-15N2 实 现 HeLa细胞在EGF(epidermalgrowthfactor)刺激后5 242· · 隋少卉等:磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展2007;34(3) 个时间点的标记，并通过SCX-TiO2进行磷酸化肽 段的富集，用LTQ-FT检测到2244磷酸化蛋白和 6600个磷酸化位点.其中 14%的磷酸化位点在 EGF刺激后有2倍以上的差异，揭示了HeLa细胞 中的磷酸化蛋白受EGF影响的一个动态过程，为 探索癌症的发生发展提供了有用信息.同时也是 SILAC在细胞水平上研究定量磷酸化蛋白质组学 的一个很成功的例子.虽然Ishihama等[27]已经用细 胞系作为内参将该技术用于组织样本的定量分析， 但是方法的实用性还有待研究. 2.2.3 18O标记技术(oxygen-18labeling)[28].该技术是 将蛋白质酶切时或酶切后放入H218O中，在蛋白酶 催化作用下将羧基上的 2个氧替换成 18O而进行 的，除了C端肽之外，在适宜的条件下，所有的 肽段一般都可以替换上2个 18O，使肽段质量数相 差+4u.Korbel等[29]采取免疫沉淀反应/IDE/LC/MS 与 18O标记来分析EPO受体依赖的蛋白质.鉴定并 定量了187个磷酸化蛋白，发现89个蛋白质上的 酪氨酸以EPO受体依赖的方式发生变化.18O标记 技术是一种操作简单，条件温和，应用广泛 (trypsin，chymotrypsin，lys-C和glu-C都能被用来 标记酶切肽段的C端)，没有副产物的标记技术， 并能与多种磷酸化肽段富集方法连用，适于低丰度 磷酸化肽段的定量标记，已得到国际上一些大型实 验室的青睐.但是用 18O进行同位素标记经常产生 标记一个氧原子和两个氧原子不等的现象，即产生 分子质量+2和+4两种混合的产物，一般选用全扫 描的离子色谱面积(EIC)或峰强度定量，EICs在分 辨率上有一定的局限性而且经常会与其他共洗脱的 峰重叠，此外，18O与 16O交换速率也依肽段的大 小，氨基酸的类型，酶的类型以及肽段序列而有所 变化.所以尽管该技术已经得到比较普遍的应用， 但是要得到准确的定量结果还需对其进一步优化. 3 磷酸化蛋白质的质谱分析和鉴定 目前，碰撞诱导解离(CID)和源后裂解(PSD)是 应用最为广泛的MS/MS裂解方式，在规模化多肽 测序/蛋白质鉴定中取得了巨大的成功，但是随着 蛋白质组学研究技术的深入和发展，这两种裂解方 式也暴露出一些弱点，如序列依赖性等，使得CID 和PSD在蛋白质组学尤其是翻译后修饰研究中的 应用受到限制[30].电子捕获解离(ECD)与傅立叶变换 离子回旋加速共振(FTICR)质谱相连，是蛋白质、 肽测序和研究蛋白质翻译后修饰的一个有力方法. 近来，它已被成功地用于鉴定肽片段上发生磷酸化 的残基.与CID和PSD不同，ECD不存在序列依 赖性，优先断裂二硫键，优先产生c、z离子，可 产生广泛的主链裂解，更为重要的是许多脆弱的翻 译后修饰甚至非共价键维系的二级结构在ECD条 件下都保持稳定，因而将生物质谱的“软”电离能 力从MS延伸到MSMS，使得ECD成为一种非常 有前途的翻译后修饰研究工具.而ECD在某些方面 和CID、PSD又是互补的，比如二硫键在后者是稳 定的而在前者可被有效地打开，X-P(X为任一氨 基酸残基)在 CID、PSD条件下优先断裂，而在 ECD条件下是目前发现唯一不能断裂的序列.当前 ECD技术存在的不足在于电子捕获引起的电荷中 和导致的灵敏度降低.此外，ECD技术在除了傅立 叶转换离子回旋共振质谱仪(Fouriertransformion cyclotronresonancemassspectrometry，FTICRMS) 外的其他类型质谱仪中实现还有困难，而FTICR MS比较昂贵，这也限制了ECD技术的广泛应用. 但由于该技术分辨率超过 140万，准确度优于 1.0ppm，可实现超高分辨、高准确度和高灵敏度 的多级串联质谱功能，为开展定量磷酸化蛋白质组 学分析提供了可能. 虽然FT-ICR等高分辨率的质谱仪在磷酸化蛋 白质定量中的应用，为定量磷酸化蛋白质组学展现 了一定的可喜前景，但是，对于一些低丰度的磷酸 化肽段仍很难实现在一级质谱图上进行有效定量， 最近Jin等[23]利用二级质谱图中出现的强中性丢失 峰进行定量，可极大提高方法的灵敏度，容许相对 定量在一级质谱上不容易观察到的低丰度或者低磷 酸化水平的磷酸化肽段，接着发生中性丢失的离子 可以通过三级质谱做进一步鉴定，这一策略最近已 被成功地应用到大规模的磷酸化蛋白质鉴定实验 中[31].另外，iTRAQ(isobarictaggingtechnology)[32] 是近年来继ICAT化学标记技术后，最新开发的一 种新的蛋白质组学定量研究技术，可以实现在二级 图谱上的定量，具体原理已有详细报道[33].但目前 有关iTRAQ在磷酸化蛋白质定量方面的研究报道 还很少. 4 辅助定量分析的计算机软件技术 生物信息学(bioinformatics)是一门新兴的交叉 学科.它包含了生物信息的获取、处理、存储、分 析、解释和发布等在内的所有方面，它综合运用数 学、计算机科学和生物学等多种工具，来阐明和展 243· · 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 2007;34(3) 示大量数据包含的生物学意义.生物信息学的发展 已给蛋白质组学研究提供了更方便有效的计算机分 析软件.定量蛋白质组学需要生物信息学的计算机 软件技术来辅助分析庞大数据中所包含的差异信 息.ICAT技术在定量蛋白质组学中的应用已经比 较成熟，相应的软件技术也得到了开发(ABI4700 附带的GPS2.0能自动分析ICAT数据)，但对于新 兴的定量磷酸化蛋白质组学技术，目前还缺乏自动 化分析的软件，虽然辅助SILAC标记定量技术的 软件 MSQuant(http://msquant.sourceforge.net)以及 辅 助 18O 标 记 技 术 的 软 件 ZoomQuant(http: //proteomics.mcw.edu)[34]可以在相关网站上下载得 到，但对于其在实际分析中的应用，还有待进一步 研究改进. 5 结 语 在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定 量研究已经引起人们强烈的关注，各种技术也相应 地迅速发展起来，为研究蛋白质磷酸化介导的细胞 生物功能分析提供有用信息.但由于磷酸化蛋白质 组学自身的一些特点，使得现有的技术还不能很好 地满足研究的需要，许多技术在应用的同时被取代 或淘汰，稳定同位素标记技术应是未来发展的一个 方向，但要很好地在磷酸化蛋白质组学领域应用， 还需进一步完善,还需更特异地富集磷酸化蛋白质 和磷酸化肽的分析方法来为蛋白质定量的顺利开展 提供保障，还需更稳定更成熟的标记技术来确保定 量的准确性，还需要研究发展一些能与大规模富集 磷酸化肽段的技术相兼容的定量技术方法，还需要 更有效的鉴定技术和计算机软件进行辅助定量.相 信随着蛋白质组学研究的不断深入和发展，磷酸化 蛋白质组学定量技术必将得到突飞猛进的发展，为 全面和深入地认识生命的复杂活动提供可能. 参 考 文 献 1 AlonsoA,SasinJ,BottiniN,etal.Proteintyrosinephosphatasesin thehumangenome.Cell,2004,117(6):699～711 2 CohenP.Theoriginsofproteinphosphorylation.NatCellBiol, 2002,4(5):E127～130 3 HoeHS,FreemanJ,RebeckGW.ApolipoproteinEdecreasestau kinasesand phospho-tau levelsin primary neurons. 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