试剂法测定自由巯基和二硫键

ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 [2]。DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml.我们的条件可以达到这个检测限度。ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在，其降解速度为%/h，在pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].试验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 主要材料：1.材料PEG-G-CSF批号：080229浓度mlG-CSF批号：080126浓度ml10k超滤膜PALL2.试剂SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。20ug/小瓶。加入20ul50mMNH4HCO3，溶解，配成1ug/ul的酶液。1MDTT刘春凤提供TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114乙腈：FisherScientificLot#055848StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-208241-001(includingα-Cyano-4-hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibrationstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)PEG肽段反相分离流动相A液：%TFA/H2OB液：%TFA/90%乙腈/H2O3.仪器质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号KC2007-011)Beckman22R台式离心机（厂内编号AM-039）BeckmanDU-800紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）恒温循环仪：JULABOF12-ED（厂内编号KC2008-003）反相柱：SymmetryC185um300à*150mm，LotNO01，内部编号1655高压液相仪器：，（UV/VisibleDetector）试验过程：一、缓冲液替换PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mMNH4HCO3，pH。使用50mMNH4HCO3作为空白对照，样品用50mMNH4HCO3稀释一倍后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。PEG-G-CSF的浓度约ml，G-CSF的浓度约ml。二、酶切处理1）取37ulG-CSF,共400ug，加入50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。取PEG-G-CSF,共400ug，加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。另做一空白对照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。37℃反应，开始时间为。三、肽段反相分离TimeFlow%A%B0110001110001516832451653550154467014951801208085110009511000G-CSFTrypsin+DTT反相分离收样：TimeFlow%A%B0110001110001516832451653550154467014951801208085110009511000PEG-G-CSFTrypsin+DTT反相分离收集到之间的信号峰，交由崔文喜冻干四、ELLMAN试剂测定自由巯基由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：反应缓冲液：磷酸钠+EDTA，pH温度：25℃在这些参数下，摩尔吸收光系数为±*103LM-cm-[9].标准曲线用反应缓冲液配制10umDTT，20umDTT，40umDTT，80umDTT，160umDTT，320umDTT。用缓冲液配制10mM的ELLMAN试剂。准备两个比色皿。①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。④A412nm=Afinal-（）(ADTNB-Abuffer),制作标准曲线。2）样品巯基测定①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值ADTNB。③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为Afinal。④A412nm=Afinal-（）(ADTNB-Abuffer)，根据标准曲线测定巯基。参考文献：1)etQuantitativeAnalysisofDisulfideBondsinPolypeptidesandProteins.ANALYTICALBIOCHEMISTRY138,181-I88(1984).2)W.L.ANDERSONANDD.B.WETLAUFER.ANewMethodforDisulfideAnalysisofPeptides.ANALYTICALBIOCHEMISTRY(1975).3)Ellman,.,Arch.Biochem.Biophys.,74,443.(1958).4)PeterEyer,etal.MolarabsorptioncoecientsforthereducedEllmanreagent:reassessment..AnalyticalBiochemistry312(2003)224–2275)W.L.ANDERSONANDD.B.WETLAUFER.ANewMethodforDisulfideAnalysisofPeptides.ANALYTICALBIOCHEMISTRY(1975).6)Sigma5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)产品说明书。7)Riddles,.etal.,Anal.Biochem.,94,75(1979)8)Danehy,,Elia,.andLavelle,.,J.Org.Chem.,36,1003(1971).9).Riddles,.Blakeley,B.Zerner,Ellmansreagent:5,5-dithiobis(2-nitrobenzoicacid)—areexamination,Anal.Bio-chem.94(1979)75–81.