实验13 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质的凝胶电泳试验一．蛋白质提取（一）材料的研磨一般材料是在液氮中进行研磨。以下是玉米籽粒的蛋白质提取中的几个组织研磨液配方：研磨液1:①40mol/LTris,pH6.8（水溶液）②1mmol/LPMSF（蛋白酶抑制剂）研磨液2:①40mol/LTris,pH8.3（水溶液）②15%PVP（脱色剂）③4%NP-40（裂解细胞）④0.07%巯基已醇（解联蛋白）56⑤DN/RN-ase⑥总pH7.5研磨液3:①10%三氯已酸（水溶液，除多糖）②15%PVP（脱色剂）③5%果胶酶（裂解组织和细胞）④0.07%巯基已醇（解联蛋白）⑤1mmol/LPMSF（蛋白酶抑制剂）（二）玉米蛋白质的提取和纯化程序预备——主要试剂包括研磨液1，纯化液1和纯化液2，先在-20℃预冷，4℃∣预冷研磨液2。↓剥胚——冷冻玉米籽粒，2粒，戴一次性手套进行操作剥胚。↓研磨——胚置入1.5mL离心管中,∣①加研磨液1，40uL202粒），在冰水浴中研磨和冲击100次。∣②加研磨液2，100uL（502粒），研磨和冲击100次，4℃↓下静置40min。纯化——①加纯化液1，1.5mL,-20℃过夜。40000g(20888r/min)离心∣1h，弃上液。∣②加纯化液2，1.5mL,-20℃，静置1h。4℃，40000g,离心0.5h，∣弃上液。∣③加纯化液3（-20℃预冷的纯丙酮），1.5mL,-20℃，静置1h。↓④真空干燥后备用。提取——提取液(8M尿，3%CHAPS,2M硫尿，1%DTT)∣①准确称量，纯化后的干粉，20mg。∣②加40mmol/LTris提取液50uL,充分振荡，4℃浸提1h。∣③加提取液500uL,充分振荡，4℃条件下浸提过夜。∣④4℃，40000g(20888r/min),离心1h。∣⑤吸取上清，1.5mL离心管，分装100ug，上样或–20℃保存备用。↓⑥离心——4℃,10000g离心30min，弃上液。保存备用。试验二．连续体系SDS-PAGE（一）试剂与溶液1．0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（AR）Na2HPO4·2H2O25.63g或Na2HPO4·12H2O51.58g，再称取磷酸二氢钠（AR）NaH2PO4·H2O7.73g或NaH2PO4·2H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容至1000ml。2．样品溶解液0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖及0.02%溴酚蓝。用来溶解 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白质及待测固体蛋白质样品。配制方法如 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 3-1。表3-1连续体系样品溶解配制SDS巯基乙醇甘油溴酚蓝0.2mol/L磷酸盐缓冲液加重蒸水至最后体积为100mg0.1ml1ml2mg0.5ml10ml如样品为液体，则应用浓度一倍的样品溶解液，然后等体积混合。3．凝胶贮液称Acr30g,Bis0.8g,加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶，4℃贮存可用1-2月。4．凝胶缓冲液称SDS0.2g，加0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4℃贮存，用前，稍加温使SDS溶解。5．1%TEMED取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4℃贮存。6．10%过硫酸铵（AP）称AP1g，加重蒸水至10ml，此液应每周新配。置棕色瓶内，4℃贮存。7．电极缓冲液（0.1%SDS,0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液）称SDS1g，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1000ml。8．1%琼脂（糖）称琼脂（糖）1g，加100ml上述电极缓冲液使其溶解，4℃贮存。9．固定液取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。10．染色液称考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后应用。11．脱色液冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。12凝胶单体及缓冲液配方如下：A.丙烯酰胺单体储液（30%）：①29.10g丙烯酰胺②0.9gN,N’-甲叉丙烯酰胺③分别用35ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶解变为透明④双蒸水定溶到100ml⑤过滤⑥棕色瓶盛装，4℃保存。B.分离胶缓冲液（1.5MTris-HClpH8.8）:①Tris,1.5M,36.34g,双蒸水150ml溶解②HCl调至pH8.8③双蒸水定溶到200ml④过滤⑤棕色瓶盛装，4℃保存。C.电极缓冲液:①Tris（FW121.1），25mM,15.15g,双蒸水1000ml溶解②Glycine(FW70.07),72g,(192mM)1000ml双蒸水溶解③SDS(FW70.07),5g,(0.1%w/v)1000ml双蒸水溶解④双蒸水定溶到5000ml⑤HCl调至pH8.3-9.8（二）、器材夹心式垂直板电泳槽[凝胶模（135×100×1.5mm）]，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），吸量管（1,5,10ml），烧杯（25,50,100ml），细长头的滴管，1ml注射器及6号长针头，微量注射器（10μl或50μl），水泵或油泵，真空干燥器，大培养皿（φ×120-160mm）。（三）、操作方法1．安装夹心式垂直板电泳槽用细头长滴管吸取已熔化的1%琼脂（糖）溶液，封住长玻璃板下端与硅胶模间的缝隙。加琼脂（糖）溶液时，应防止气泡进入。琼脂（糖）溶液用连续体系配制。2．配胶及凝胶板的制备（1）.配胶根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度，见表3-2。表3-2SDS-连续体系凝胶配制试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml5%7.5%10%凝胶贮液30%Acr-0.8%Bis3.335.006.660.2mol/LpH7.2磷酸缓冲液内含0.2%SDS10.0010.0010.001%TEMED2.002.002.00重蒸馏水4.572.901.23混匀后，置真空干燥器中帛气10min10%AP0.100.100.10电极缓冲液为0.1mol/LpH7.2磷酸缓冲液，内含0.1%SDS。（2）凝胶板的制备SDS-连续体系凝胶板的制备：按表2配制20ml所需浓度的PAA，用细长头滴管将分离混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入样品槽 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 。为防止渗漏，可在上、下电极槽中加入蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释，约30min，凝胶聚合，继续放置20-30min后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，用窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电泳或准备加样。3．样品的处理与加样（1）样品的处理根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂的低分子量标准蛋白质试剂盒，每一安瓶则需加入200μl样品溶液，自己配制标准及未知样品，按0.5-1mg/ml样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时迸出），在100℃沸水浴中保温3min，取出冷却加样。如处理好的样品暂时不用，可放在-20℃冰箱保存较长时间，使用前在100℃水中加热3min，以除去亚稳态聚合。（2）加样一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10-15μl（即2-10μg）。如样品较稀，加样体积可达100μl。如样品槽中有汽泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。4．电泳分离胶聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS连续系统预电泳采用30mA，60-120min。在电极槽中倒入0.1%SDS，pH7.2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至50mA，待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边1-1.5cm处，停止电泳，一般需5-6h。5．凝胶板剥离与固定电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为样品标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜。6．染色与脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。7．绘制标准线将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距溴酚蓝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），如图所示。按下式计算相对迁移率以标准蛋白轴的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。实验三不连续体系SDS-PAGE(一)、试剂1．10%（W/V）SDS溶液称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其它全溶解。2．1%TEMED（V/V）取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。3．10%AP（W/V）称取AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。4．样品溶解液内含2%SDS，5%巯基乙醇，40%蔗糖或10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LpH8.0Tris-HCI缓冲液。先配制0.05mol/LpH8.0Tris-HCI缓冲液：称Tirs0.6g，加入50ml重蒸水，再加入30ml1mol/LHCI，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。按表3-3配制样品溶解液表3-3不连续体系样品溶解液配制10%SDS巯基乙醇溴酚蓝蔗糖0.05mol/LTris-HCI加重蒸水至最后总体积为2ml0.5ml2mg4g2ml10ml5．凝胶贮液30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同。称Acr30g及Bis0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。10%浓缩胶贮液：称Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。6．凝胶缓冲液分离缓冲液（3.0mol/LpH8.9Tris-HCI缓冲液）：称Tris36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/LHCI约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100ml，4℃贮存。浓缩胶缓冲液（0.5mol/LpH6.7Tris-HCI缓冲液）：称Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/LHCI约48ml，调pH至6.7，最后加重蒸水定容至100ml，4℃贮存。7．电极缓冲液（内含0.1%SDS,0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入10%SDS10ml，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。8．1%琼脂（糖）溶液称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液100ml，加热使其溶解，4℃贮存，备用。9.固定液取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。10.染色液20%的三氯乙酸，1%的戊二醛，银氨染色液。11．脱色液冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。12凝胶单体及缓冲液配方如下：A.丙烯酰胺单体储液（30%）：①29.10g丙烯酰胺②0.9gN,N’-甲叉丙烯酰胺③分别用35ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶解变为透明④双蒸水定溶到100ml⑤过滤⑥棕色瓶盛装，4℃保存。B.分离胶缓冲液（1.5MTris-HClpH8.8）:①Tris,1.5M,36.34g,双蒸水150ml溶解②HCl调至pH8.8③双蒸水定溶到200ml④过滤⑤棕色瓶盛装，4℃保存。C.浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HClpH6.8）:①Tris,1.0M,24.24g,双蒸水150ml溶解②HCl调至pH6.8③双蒸水定溶到200ml④过滤⑤棕色瓶盛装，4℃保存。D.电极缓冲液:①Tris（FW121.1），25mM,15.15g,双蒸水1000ml溶解②Glycine(FW70.07),72g,(192mM)1000ml双蒸水溶解③SDS(FW70.07),5g,(0.1%w/v)1000ml双蒸水溶解④双蒸水定溶到5000ml⑤HCl调至pH8.3-9.8(二)、器材夹心式垂直板电泳槽[凝胶模（135×100×1.5mm）]，直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA），吸量管（1,5,10ml），烧杯（25,50,100ml），细长头的滴管，1ml注射器及6号长针头，微量注射器（10μl或50μl），水泵或油泵，真空干燥器，大培养皿（φ×120-160mm）(三)、操作方法1．安装夹心式垂直板电泳槽用细头长滴管吸取已熔化的1%琼脂（糖）溶液，封住长玻璃板下端与硅胶模间的缝隙。加琼脂（糖）溶液时，应防止气泡进入。琼脂（糖）溶液用不连续体系电极缓冲液配制。2．配胶及凝胶板的制备（1）.配胶根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续系统及不连续系统两种，两者间有不同的缓冲系统，因而有不同的配制方法，见表3-3和表3-4。表3-4SDS-不连续体系凝胶配制试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液3.335.006.668.00—30%Acr-0.8%Bis分离胶缓冲液2.502.502.502.50—pH8.9Tris-HCI浓缩胶贮液————3.0010%Acr-0.5%Bis浓缩胶缓冲液————1.25pH6.7Tris-HCI10%SDS0.200.200.200.200.101%TEMED2.002.002.002.001.00重蒸馏水11.8710.208.543.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.100.100.100.05电极缓冲液pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，内含0.1%SDS。（2）凝胶板的制备分离胶的制备：按表22.5配制20ml10%PAA，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长，短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3-4mm，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。浓缩胶的制备：按表22.5配制10ml3%PAA，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽板插入浓缩胶内，约30min后凝胶结合，再放置20-30min，使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水，将pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。3．样品的处理与加样（1）样品的处理根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂的低分子量标准蛋白质试剂盒，每一安瓶则需加入200μl样品溶液，自己配制标准及未知样品，按0.5-1mg/ml样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时迸出），在100℃沸水浴中保温3min，取出冷却加样。如处理好的样品暂时不用，可放在-20℃冰箱保存较长时间，使用前在100℃水中加热3min，以除去亚稳态聚合。（2）加样一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10-15μl（即2-10μg）。如样品较稀，加样体积可达100μl。如样品槽中有汽泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。4．电泳分离胶聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定。在电极槽中倒入pH8.3Tris-HCI电极缓冲液，内含0.1%SDS即可进行电泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏pH环境，如需预电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳将分离胶面冲冼干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续SDS-PAGE。开始时电流为10mA左右，待样品进入分离胶后，改为20-30mA，当染料前沿距硅橡胶框底边1.5cm时，停止电泳，关闭电源。5．凝胶板剥离与固定电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为样品标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜。6．染色与脱色（银染色法）（1）固定与浸泡、电泳后的凝胶板置于大培养皿中，加入20%，三氯乙酸浸没胶片，浸泡8h以上。（2）戊二醛处理：吸去三氯乙酸溶液（回收可重复使用数次），用150ml蒸馏水冲洗凝胶板，弃去洗涤液，再加150ml蒸馏水并充分摇动20min，弃去洗涤液。重复上述漂洗步骤3次，加入1%戊二醛150ml，摇动4h以上（增加戊二醛浓度可缩短处理时间）。（3）染色：弃去戊二醛溶液，用蒸馏水冲洗胶表面，再加蒸馏水荡洗3次，每次10min。弃去荡洗液后，加入氨银染色液100ml（染一块胶板），摇动0.5h。（4）显色：弃去氨银溶液，加蒸馏水150ml荡洗凝胶表面3-5min，弃去荡洗液，加入显色液100ml，不断摇动，密切观察显色情况，至显色条带清晰约需5-10min，迅速将凝胶片转移至另一培养皿中，用蒸馏水充分洗涤两次以终止显色。（5）褪色：如显色过深，可用脱色液适当褪色。将终止显色的凝胶片放入含脱色液的培养皿中，不断摇动，直至底色脱去，蛋白染色条带清晰。再用蒸馏水冲洗数次，以终止脱色。银染色法的注意事项：（1）银染色法极其灵敏，着色的快慢及染色的深浅与各步骤所用溶液的浓度及显色时间有关。而各步骤所需的时间又受温度，凝胶浓度及其厚度的影响。本法适用1mm厚的10%PAA凝胶板的染色，在室温（25-30℃）条件下操作。（2）银染色法受多种因素干扰，造成底色过深或假象，因此，各种试剂及蒸馏水应确保纯净。所用的器皿应充分洗净，用于制备凝胶板的玻璃板应在含铬酸的洗液中浸泡4h以上，再用自来水反复冲洗数次，最后用蒸馏水冲洗数次，自然晾干后使用。（3）染色过程中，应避免用手接触凝胶板。转移凝胶板时，应用塑料板或带乳胶手套操作。（4）用三氯乙酸，戊二醛固定处理凝胶板的时间不应少于4h。然而，延长这两步的时间，对染色效果无不良影响，也不需延长洗涤时间或增加洗涤次数。（5）用氨银染色处理后，洗涤时间不宜过长，一般5min足够，时间过长会降低染色灵敏度。7．绘制标准线将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），如图所示。按下式计算相对迁移率以标准蛋白抽的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。8．注意事项（1）SDS纯度：在SDS-PAGE中，需高纯度的SDS，市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20gSDS放在圆底烧瓶中，加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min，用热布氏漏斗趁热过滤。过滤应透明，冷却至室温后，移至-20℃冰箱中过液。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。（2）SDS与蛋白质的结合量：当SDS单体浓度在1mmol/L时，1g蛋白质可与1.4gSDS结合才能生成SDS-蛋白复合物。巯基乙醇可使蛋白质间的二硫键还原，使SDS易与蛋白质结合。样品溶解液中，SDS的浓度至少比蛋白质的量高3倍，低于这个比例，可能影响样品的迁移率，因此，SDS用量约为样品量10倍以上。此外，样品溶解液应采用低离子强度，最高不超过0.26，以保证在样品溶解液中有较多的SDS单体。在处理蛋白质样品时，每次都应在沸水浴中保温3-5min，以免有亚稳聚合物存在。（3）凝胶浓度：应根据未知样品的估计分子量，选择凝胶浓度。分子量25000-200000的蛋白质选用终浓度为5%的凝胶；分子量在10000-70000的蛋白质选用终浓度为10%的凝胶；分子量在10000-50000的蛋白质选用最终浓度为15%的凝胶，在此范围内样品分子量的对数与迁移率呈直线关系。以上各种凝胶浓度其交联度都应是2.6%。标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2-0.8之间均匀分布。值得指出的是，每次测定未知物分子量时，都应同时用标准蛋白制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白质分子量的方法加以校正。此法对球蛋白质及纤维状蛋白质的分子量测定较好，对糖蛋白，胶原蛋白质等分子量测定差异较大。（4）对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15μl为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。（5）由于凝胶中含SDS，直接备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25%异丙醇内含7%乙酸浸泡，并经常换液，直至SDS脱尽（约需2-3天），才可按PAGE法制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。思考题:1.简述SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。2.做好本实验的关键是什么？